우리는 기술 지원을 제공 하기 위한 자극 토론 및 Zhan 연구소에서 회원을 제공 하기 위한 장 연구소에서 회원을 감사 합니다. 이 연구는 NSFC, 중국의 M.O.S.T.에서 973 프로그램의 (E.E.Z. C.Z.)를 2012CB837700의 31500860 (C.Z.)를 부여 하 고 베이징 시 정부에서 자금에 의해 지원 되었다. E.E.Z.는 "채용 프로그램 글로벌 청소년 전문가" 중국 사람에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜의 모든 절차는 중국의 정부 규정에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 국립 연구소의 생물학, 베이징의 승인을 실시 했다.
1. 건설 Cry1 형광 기자
참고: 이전 circadian 연구 생물 발광 시스템2,12를 사용 하 여,13 퓨즈 리듬 dLuc 식 유도를 정한 luciferase (dLuc)와 circadian 발기인. 개발 하기 위해 형광 기자, 정한 luciferase 리듬 dVenus 식 유도를 정한 형광 단백질 (dVenus)로 대체 되었다. P (Cry1)의 생성-d금성 기자 아래 설명의 구조는 현재 Addgene에 제출 되 고 학문적 인 사용을 위해 곧 유효할 것 이다.
<ol><li>증폭 기능 마우스 Cry1 발기인 (-1208 bp 지역 전사 시작 사이트 '-1'로 지정, Cry1 유전자의 +328). PCR 효소 (로그인 플러스 네오)를 사용 하 여, 뇌관 f 1와 r 1은 ( 표 2참조), 서식 파일 및 제조업체의 PCR 프로토콜 Cry1 발기인 DNA 파편을 증폭으로 게놈을 마우스.</li>
	<li>Intron 336 Cry114의 circadian 시계 기능을 위해 중요 하다, Cry1 유전자의 증폭. 사용 하 여 PCR 효소 뇌관 f 2와 r 2, 서식 파일 및 제조업체의 intron 336 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜 마우스 게놈.</li>
	<li>금성을 증폭. 뇌관 f 3와 R3, 템플릿과 제조업체의 금성 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜으로 pVENUS N1 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.</li>
	<li>NLS-D2 DNA 파편을 증폭. 뇌관 f 4와 R4, 서식 파일 및 NLS D2 DNA 파편을 증폭 하는 제조 업체의 PCR 프로토콜 pcDNA3.3 d2eGFP 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.</li>
	<li>Exon 1로 DNA 조각 1을 음성 합성.</li>
	<li>Intron 336와 금성 DNA 파편 사이 링커로 DNA 조각 2를 음성 합성.</li>
	<li>잘라 두 번 pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE-MluI 및 EcoRI 효소 HGHpA 벡터 플라스 미드. 젤 추출 키트를 사용 하 여 더 큰 DNA 파편을 정화. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.</li>
	<li>Using 깁슨 어셈블리 혼합 및 그것의 표준 프로토콜, 모두 함께-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1) 기자를 생산 하는 DNA 파편의 조립. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.</li>
</ol>2. 생산 Adeno 관련 바이러스15
<ol><li>준비 다음 플라스 미드 DNA 주식: 31.25 µ g의 pRV1, pH21의 31.25 µ g, pFdelta6의 125 µ g 및 62.5 µ g (Cry1)-intron336-pAAV-P의 금성-NLS-d 2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>293T 세포의 5 15 cm 요리를 준비 하 고는 세포가 90% 합칠 때까지 기다립니다.</li>
	<li>Transfection 시 프로토콜을 따르고 297T 셀에는 플라스 미드를 transfect. 각 요리에 대 한 사용 하 여 pRV1의 6.25 µ g, pH21, pFdelta6의 25 µ g, pAAV-P (Cry1)의 12.5 µ g의 6.25 µ g-transfection 시 약의 intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, 그리고 120 µ L.</li>
	<li>transfection, 후 72 h 피 펫 총;를 사용 하 여 각 접시에서 셀 분리 2 50 mL 튜브에 세포를 수확.</li>
	<li>10 분 동안 800 x g에서 셀 작은 고는 상쾌한 삭제. 각 관;에 20 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 배치 하 여 세포를 씻어 10 분, 800 x g에서 셀 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>150 mM NaCl에 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0; 펠 릿 resuspend 솔루션/튜브의 25 mL를 사용 합니다. 각 튜브를 갓된 10% 나트륨 deoxycholate (dH2O)에서 1.25 mL를 추가 합니다. Benzonase nuclease mL 당 50 단위의 최종 농도에 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>15 분 동안 3000 x g에서 centrifuging 세포질 파편을 제거 합니다. 0.45 μ m 주사기 필터;를 통해 혼합물을 추진 하 여 모든 파편 제거 되었습니다 확인 이 단계는 덤플링 열 차단 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>연동 펌프;를 사용 하 여 헤 파 린 열 설정 1 mL/min, 아무 공기 방울 열에 소개 된다 보장에 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	<li>150 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 10 mL와 함께 열 equilibrate 각 열에 바이러스를 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 100 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 20 mL의 열을 씻어. 그런 다음 5 mL 주사기를 사용 하 여 300 mM NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0 200 m m NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션 pH 8.0, 열 세척.</li>
	<li>Elute 400 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 3 mL와 함께 바이러스 4 mL 450 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 뒤에 5 mL 주사기를 사용 하 여 마지막으로 500 m m NaCl의 3 mL로 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0. 추출 된 자료를 수집 합니다.</li>
	<li>재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 농도 대 한 100000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 추출 된 자료를 한 번에 4 mL를 로드 합니다. 실내 온도에, 흐름을 통해 삭제 5 분 x g 2000에서 각각 4 mL 샘플 원심</li>
	<li>모든 추출된 물질을 원심 필터 단위를 통해 실행 하는 경우 PBS의 4 mL를 추가 하 고 약 250 μ로 혼합물을 원심. RAAVs 제거 (바이러스 titer에 관하여 이어야 한다 2-8x mL 당 1012 바이러스 성 입자) 원심 필터 단위, 약 수와 사용까지-80 ° C에서 저장소에서. 이 단계에서 바이러스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. rAAV 주입 및 성인 마우스 SCN에 광학 섬유 삽입
<ol><li>Circadian 형광 기자 들고 rAAVs는 SCN에 주입<ol>
<li>RAAV의 5 µ L 로드 (바이러스 titer에 대 한은 mL 당 1012 바이러스 입자 x 2-8) 마이크로 주사기로.</li>
		<li>Nembutal (80 mg/kg)을 복 주입을 통해 성인 마우스 (2에 5-달-오래 된, C57BL/6 배경)를 anesthetize. 발가락-핀치 응답의 부족에 의해 마 취의 충분 한 깊이를 확인 합니다.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 마우스의 머리에서 모피를 제거 한 다음 stereotaxic 장치에 마우스를 탑재. 순환 온수 담요 또는 다른 난방 장치를 통해 마 취 동물에 열 소스를 제공 합니다. 참고: 또는, 모피를 제거 하려면 depilatory 크림 또는 전기 머리 깍을 사용 합니다.</li>
		<li>적절 한 소독 작용 외과 사이트를 청소. 예를 들어 포함 살 균 물 또는 알코올 및 요오드 화물, betadine, 또는 스크럽을 번갈아에 액체를 희석 수이. 3 번 이상 반복 합니다. 수술 사이트 드러 워 진.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 두 피에 절 개 하 고 두개골을 노출 시킵니다.</li>
		<li>있도록 bregma 및 람다; 동일한 가로 평면에서 stereotaxic 장치 조정 동일한 가로 평면에서 bregma의 두 개의 대칭 포인트를 확인 합니다.</li>
		<li>멸 균 면봉을 사용 하 여 H2O2/H2O 뇌과 부식에 4%에 배어. 다음 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 명확 하 고 두개골의 표면 건조.</li>
		<li>마이크로 드릴을 사용 하 여, 게 구멍 약 1 m m 0.46 m m 후부와 0.25 m m 직경에서 측면 bregma.</li>
		<li>
fi 생리 염 분 해결책으로 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 두뇌의 노출 된 표면에서 뼈 파편을 취소.</li>
		<li>마이크로 주사기의 팁 후부 0.46 m m 되도록 두뇌 및 두개골의 표면에서 bregma, 및 깊은 5.7 m m 0.25 m m 옆에 마이크로 주사기를 삽입 합니다.</li>
		<li>500 주사 rAAV의 완전 한 보급을 보장 하기 위해 주사 후 10 분에 대 한 장소에서 마이크로 주사기를 떠나 SCN에 rAAV (50 nL 분-1)의 nL.</li>
		<li>천천히 마이크로 주사기를 철회 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SCN 지역에 광섬유를 삽입 합니다.<ol>
<li>광섬유 나이프를 사용 하 여, 섬유 17 m m 길이, 눈 섬유의 양쪽이 부드러운 컷.</li>
		<li>광학 섬유 세라믹 깃 봉으로 삽입 하 고 광학 섬유와 세라믹 아무의 표면 플러시 되는지 확인 메 틸 에틸 케 톤 과산화물 (AB 접착제)와 세라믹 아무에 광케이블을 수정.</li>
		<li>차가운 sterilant 솔루션 또는 에틸렌 산화물과 섬유를 청소.</li>
		<li>RAAV 주입 (3.1.11 단계), 후는 SCN에 세라믹 깃 봉 포함 된 광학 섬유를 삽입 합니다.</li>
		<li>세라믹 아무와 광섬유 치과 수 지를 사용 하 여 두개골에 해결 하 고 건조를 허용.</li>
		<li>다시 매니큐어와 치과 수 지의 표면 얼룩. 3.2.5 하 3.1.2, 제어를 위한 rAAV의 실제 주입 생략에 설명 된 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수술 후 관리<ol>
<li>Buprenorphine 2 mg/kg 몸 무게, 같은 수술 후 진통제, 피하, 마우스 제공 하루에 두 번.</li>
		<li>그들은 마 취에서와 서 하는 동안 복구에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 명암 조건 (빛의 강도 감 금 소의 바닥에서 ~ 100 럭 스)에서 개별적으로 집 쥐. 8 일 더 충분 한 회복 시간을 허용 하 고 최적의 형광 기자 식 되도록 실험 하기 전에 할당 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. vivo에서 형광 신호 모니터링 및 데이터 수집
<ol><li>수술 후 8 일 형광 신호 모니터와 마우스 머리에 섬유를 연결 (예., 유전자 관찰자). 배경 신호를 설정 하려면 컨트롤 마우스의 SCN에 형광 신호를 확인 하십시오. 관찰 및 형광 신호 모니터를 사용 하 여이 신호 측정을 수행 합니다.</li>
	<li>컨트롤 마우스의 동일한 작업과 실험 마우스의 형광 신호를 평가 합니다. 이 가능성이 광 섬유의 끝은 SCN을 놓친 있다 나타냅니다 마우스는 바이러스 성 벡터 받았지만 분석, 배경 신호 표시를 제외 합니다. 이러한 초기 조치 후 자신의 집 새 형광 신호를 안정 시킬 수 있도록 또 다른 3 주 동안에 쥐를 반환 합니다.</li>
	<li>3 주 후 형광 신호 모니터와 마우스를 연결 합니다. 15 형광 측정 s 100 Hz의 주파수에서 매 10 분. 이러한 측정 동안 쥐 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 그들의 감 금 소에 자유롭게 움직이는 있습니다. ~ 100 럭 스의 감 금 소의 바닥에는 빛의 강도 사용 하 여 그리고 15-20 µW 사이 광 섬유의 끝에 레이저 전원.</li>
	<li>모든 녹음 완료 후 4 %paraformaldehyde 마우스를 perfuse 및 제거 하 고 슬라이스는 광케이블의 위치를 확인 하는 머리. 광섬유 팁은 SCN에 제대로 이식 되지 경우에 분석에서 마우스를 제외 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션
<ol><li>측정 형광 신호 15 매 10 분 1500 데이터 포인트를 100 Hz의 주파수에서 s. 이 1500 점의 평균 주어진된 시간에서 형광 신호를 변환합니다. 시간이 지남에 따라 여러 평균 플로팅 transcriptional의 리듬에 맞춰 Cry1 자유롭게 마우스를 이동는 SCN에 제어 조명 조건 하에서 해당 신호-시간 곡선을 생성 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li><li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+not+winding+down:+unravelling+circadian+networks.">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system.">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li><li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+preparation,+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus.">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression:+View+of+a+mouse+clock+gene+ticking.">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li><li>Ono, D., Honma, K. 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M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms.">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function.">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. 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A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Circadian+Entrainment.">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li><li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice.">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li></ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Ex vivo 방법, 동물 살해는 요구, 슬라이스 문화4,5, RT-PCR16, 제자리 교 잡17, 등 달리는 vivo에서 메서드를 기록 수 있습니다. 살아있는 동물에 circadian 유전자 발현 연구 조사. 따라서,이 기술은 신경 circadian 시계에 다른 물리적 섭 (예를 들어, 수 면 부족, 스트레스, 음식 섭취, 등)의 효과 ?...

포유류에서 suprachiasmatic 핵 (SCN) 외 인 환경 변화 (예를 들면, 빛, 온도, 스트레스, 등)1개인의 응답을 조정 전체 신체의 circadian 리듬을 제어 합니다. 코어 클록 구성 요소 Per1-3, Cry1 2, Clock, Bmal1의 구성 하 고 각 셀의 circadian clock을 조절에 중추적인 역할. 각 셀은 SCN에 transcriptional 활성 제, 시계/BMAL1, 당의 표현을 유도에 heterodimer 역할 포함 및 외침. 당 / 울 복잡 한 다음 시계/BMAL1 완료2,3약 24 h는 녹음 방송 번역 피드백 루프를 형성 하기의 기능을 억제.
이전 연구는 SCN에 비보 전 SCN 슬라이스 문화 방법4,,56 주로 고용 하 고, 한계가 우리의 능력을 저해는 동안이 접근은 귀중 한 정보를 제공 하 고, SCN에 다른 뇌 핵의 영향 뿐만 아니라이 중요 한 영역에 있는 셀에 외 인 자극 (예를 들면, 빛)의 효과 대 한 데이터를 가져옵니다. 2001 년에, 히토시 오카무라의 그룹 자유롭게 이동 마우스7에서 SCN에 vivo에서 모니터 circadian 시계 유전자 발현을 생물 발광 시스템을 사용 하는 첫번째 이었다. 켄 이치 혼 마의 그룹은 지난 몇 년 동안에는 생물 발광에서 vivo에서 SCN8,,910녹화 시스템 개발 지출 했습니다. 함께, 이러한 연구는 지속적인 암흑 또는 빛 펄스 후 circadian 시계를 모니터링 하는 기능 연구를 제공 합니다. 그러나, 때문에 생물 발광 너무 희미 한 명암 주기 동안 지속적인 모니터링 사실 빛 circadian 시계11, SCN 중재 진입에 필요한 주된 신호 함께 있도록입니다. 생물 발광 녹화와 관련 된 한계를 극복 하는 실험 방법의 개발에 대 한 수요 증가. 현재 보고서는 circadian 시계는 SCN에서 vivo에서 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 모니터링을 건립 되었다 형광 기반 시스템을 설명 합니다. 이 사용 하기 쉬운 메서드 명암 주기 동안 지속적인 모니터링을 허용 하 고 실시간 및 높은 시간 해상도에서 SCN에 circadian 시계 유전자의 녹음 방송의 장기 관찰에 대 한 허용.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1408px;" width="1408">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:627px;">KOD Plus Neo</td>
			<td style="width:403px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:133px;">KOD-401</td>
			<td style="width:245px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pVENUS-N1</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#61854</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pcDNA3.3_d2eGFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#26821</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>#20297</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MluI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0564</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0274</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gibson Assembly Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611s</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe Filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>0.45&#160;&#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiTrap heparin columns</td>
			<td>gelifesciences</td>
			<td>17-0406-01</td>
			<td>1 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Amicon ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>&#160;UFC810024</td>
			<td>100,000 MWCO</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5670</td>
			<td>Make fresh solution for each batch</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mouse stereotaxic apparatus</td>
			<td>B&#38;E TEKSYSTEMS LTD</td>
			<td>#SR-5M/6M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">pentobarbital</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>#1507002</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mouse stereotaxic apparatus</td>
			<td>B&#38;E TEKSYSTEMS LTD</td>
			<td>#SR-5M/6M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>#216763</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Optical Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FT200EMT</td>
			<td>0.39 NA, &#216;200 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">microsyringe pump</td>
			<td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ceramic ferrule</td>
			<td>Shanghai Fiblaser</td>
			<td></td>
			<td>230&#8201;&#956;m I.D., 2.5 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gene Observer</td>
			<td>BiolinkOptics</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

이 기술을 기반으로 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 유전자 기자 들의 정확한 납품 광섬유 중재 형광 녹음을 결합합니다. 이 새로운 및 사용 하기 쉬운 vivo에서 형광 모니터링 시스템 개발 되었다 자유롭게 마우스를 이동의 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 시계 유전자, Cry1의 transcriptional 리듬을 기록 하. 이렇게 하려면, Cry1 전사 형광 기자 설계와 Adeno 관련 바이러스로 포장. 정제, 집중 바이러스 SCN 광케이블은 두뇌의 표면에 고정 후 삽입 하 여 다음 마우스에 주입 했다. 동물 자신의 집 새를 반환 하 고 충분 한 기자 식 되도록 1 개월 수술 회복 기간을 허용 했다. 형광 다음 자유롭게는 vivo에서 우리의 기관에서 만들어진 시스템 모니터링을 통해 마우스를 이동에 기록 되었다. 대 한 vivo에서 녹화 시스템, 488 nm 레이저는 동등한 힘의 4 개의 레이저 구동 출력으로 빛을 분할 한 1 × 4 빔-스플리터와 결합 했다. 이 설치 프로그램 4 동물에서 동시에 레코드를 사용할 수 있습니다. 각 내보낸된 형광 신호 광 전 증폭 관 관 및 데이터 수집 카드 통해 수집 되었다. 반면 이전 생물 발광 vivo에서 circadian 시계 기록 기술,이 형광에서 vivo에서 녹화 시스템 허용 빛 주기 circadian 시계 유전자 발현의 기록.

Cry1 의 형광 기자 디자인 그림 1A에 게재 했다. 500 이상 상세한 접근을 사용 하 여 (Cry1)-intron336-rAAV-P의 nL 금성-NLS-d 2는 성인 마우스의 SCN에 성공적으로 주입 했다 그리고 강력한 금성 식 (그림 1B, 1c) 전시. 12 h/12 h 명암 (LD)와 어둠/어두운 (DD) 조건 (그림 2)에서 기록 하는 형광 신호 ?...

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In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

8.2K 조회수.  Peking University. 이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

비디오: In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

연구

신경과학

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

쥐에 활동 륜 실행에 녹음 및 Circadian 리듬 분석

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...