Bu protokolde tümör mitokondriyal fonksiyonunu ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol klinik çeviri onkolojisi için yaygın olarak geçerlidir ve mitokondrilerin kanserin başlangıcında ve ilerlemesinde rolünün tanısal ve mekanistik yorumunu artırmaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, difüzyon sınırlamalarını azaltırken hazırlığı basitleştirmek ve mitokondri verimini en üst düzeye çıkarmak için doku homojenizasyonunun uygulanmasıdır.
Bu teknik, yeni biyopsilenmiş veya ekscised tümör dokusu kullanılarak tümör mitokondriyal fonksiyonunun nicel bir değerlendirmesi ile klinik ve tanısal ortamlarda potansiyel uygulamalar sunmaktadır. Islak buzun üzerine sıkıca oturan bir cam pestle içine bir mililitre mitokondriyal solunum ortamı veya MiR05 içeren bir cam homojenizatör yerleştirerek başlayın. Dokuyu bir mililitre biyopsi koruma çözeltisine veya BIOPS'a buz gibi bir Petri kabına yerleştirin.
Tümörü her biri yaklaşık 5 ila 10 miligramlık küçük parçalar halinde kesin ve kalan tümör parçalarını buzda tutulan 10 mililitre BIOPS'a geri yerleştirin. Doku bölümlerini bir filtre kağıdına dikkatlice şişirdikten sonra, küçük bir plastik katranlı tartı teknesine yerleştirin ve ilk ıslak ağırlığı kaydedin. Kullanılmayan parçaları, sürekli koruma için BIOPS'un 10 mililitrelik konik tüpüne geri yerleştirin.
Doku bölümlerini MiR05 içeren buz gibi bir homojenizatöre batırın ve kalan ağırlığı tartım teknesinde kaydedin. 0,09 ila 0,16 milimetre boşluk aralığına sahip bir cam pestle kullanarak, beş ila yedi aşağı ve yukarı vuruşları tamamlayarak tümör dokusunu hafifçe bozun. Her vuruş için, pestle'i aşağı iterken üç kez saat yönünde / saat yönünün tersine hareketle döndürün ve pestleyi geri çekerken üç kez daha döndürün.
Dokunun vuruşlar arasında homojenizatörnün dibine yerleşmesine izin verin, ancak köpürmeyi önlemek için pestleyi sıvı hacminin tam üstüne getirmekten kaçının. Homojenatı 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve buza yerleştirin. Pipet bir ila üç mililitre taze MiR05 pestle üzerinde ve homojenizatör içine kalan doku homojenatı yıkamak için.
MiR05 yıkamayı homojenatı içeren konik tüpe dökün. Homojenatın tam aktarımını sağlamak için bu adımı iki ila üç kez tekrarlayın. Doku homojen konsantrasyonu doğru bir şekilde hesaplamak için, homojenizatörü ve homojenatı, bağ dokusunu içeren homojenize olmayan malzeme için dikkatlice inceleyin.
Homojenizatörle ulaşılamayan homojenizatörden homojenizatörden çıkarmak için, homojenizatöre MiR05 ekledikten sonra, doku da dahil olmak üzere hacmi bir pipetle aspire edin ve içeriği bir Petri kabına taşıyın. Konik tüpün dibindeki büyük parçalara ayrılmış homojenize olmayan malzemeyi bir pipetle aspire ederek homojenden uzaklaştırın ve konik tüpün kapağına yerleştirin. Dokuyu Petri kabından veya konik tüp kapağından cımbızla çıkarın ve filtre kağıdına damlatın.
Konik tüp kapağından kalan homojenatı konik tüpe geri ekleyin. Tüpü kaplayın, sonra karıştırmak için ters çevirin. Homojenizatörleri yeniden dinleyin ve homojenize olmayan herhangi bir ek malzeme için homojenize edin ve gerekirse homojenize olmayan malzemeyi çıkarmak için adımları tekrarlayın.
Homojenizatörden elde edilen homojenize olmayan malzemenin kütlesini tartın ve kaydedin. Aktarılan herhangi bir brüt bozulmamış doku için homojen preparatı inceleyin ve homojenize olmayan parçaları çıkarın ve gerektiği gibi tartın. Son numune ağırlığını hesaplamak için tartım teknesinden, homojenizatörden kurtarılan doku ağırlığını çıkarın ve ilk ıslak ağırlıktan homojenatlayın.
Son numune ağırlığını kullanarak, homojenatı istenen konsantrasyona getirmek için ek MiR05 ekleyin. Homojenat tartıldıktan ve hazırlandıktan sonra, mümkün olan en kısa sürede teste geçin. Numuneyi cihaza aktarılana kadar ıslak buzda saklayın.
Cihaz kalibre edildikten ve numune hazırlandıktan sonra, durdurucuları büküm hareketiyle çıkarın ve MiR05'i haznenin içinde maruz kalan zardan kaçınarak odalardan epire edin. Homojenatı iyice karıştırın ve odaya 2,25 mililitre homojen ekleyin. Birden fazla odaya bir homojenat eklendiğini varsayalım, eşit doku dağılımını sağlamak için homojenatı karıştırırken her odaya bir seferde bir mililitre pipet.
Olayı adlandırmak ve zaman damgalamak için F4'e tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın. 50 mililitrelik bir şırıngayı, 18 kalibrelik kör bir iğne kullanarak bir regülatör ve gaz tüpü ile bir oksijen tankından oksijenle doldurun. Oksijeni doğrudan odalara enjekte ederek yaklaşık 500 mikromoler oksijene hiperoksijen hale getirin.
Durdurucuları gevşek bir şekilde yerleştirin ve oksijen yaklaşık 480 mikromolar olana kadar kapanmayı bekleyin. Büküm hareketiyle, odayı yavaşça kapatın ve solunumun yaklaşık 15 ila 20 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin. Gerekirse stoperin merkezi kılcal damarını MiR05 ile doldurun.
Her oda için olayları gerçek zamanlı olarak adlandırmak ve zaman damgalamak için tamamen kapalı odalara substratlar, ayırıcılar ve inhibitörler enjekte etmek için özel mikrosyringes kullanın. Oksijen konsantrasyonu ve oksijen eğimi negatif ölçeklerini gerektiği gibi ayarlamak için F6'yı seçin. Her enjeksiyondan sonra şırınnayı suda çözünür bileşikler için üç kez ve etanol çözünmüş bileşikler için% 70 etanol yıkayın.
Beş mikrolitre 0.8-molar malat ekleyin ve hemen bir sonraki enjeksiyona geçin. Enjeksiyon şırıncığını suda üç kez yıkayın. Hemen beş mikrolitre 1-molar piruvat ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin.
Şırıngayı yıkadıktan sonra, 0,5 molar ADP'lik 10 mikrolitre ekleyin ve ADP yanıtının stabilize olmasını bekleyin. Şırıngayı yıkayın ve beş mikrolitre 2-molar glutamat ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Şırıngayı yıkayın, ardından beş mikrolitre 4 milimoler sitokrom-C ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin.
Şırıngayı yıkadıktan sonra, 20 mikrolitre 1-molar succinate ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Titrat 0.5-1-mikrolitre artışları 1 milimolar FCCP ve her enjeksiyondan sonra solunum stabilize bekleyin. Solunumda ek bir artış olmayana kadar devam edin.
Enjeksiyon şırındını% 70 etanolde üç kez yıkayın. İki mikrolitre 150 mikromoler rotenon ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Daha fazla inhibisyon olmadığından emin olmak için bir mikroliter daha rotenon ekleyin.
Solunumda bir azalma varsa, solunumda bir azalma olmayana kadar ek enjeksiyonlarla devam edin, ardından enjeksiyon şırındını% 70 etanolde üç kez yıkayın. 125 mikromoler antimisin A'nın iki mikrolitresini ekleyin ve solunumun stabilize olmasını bekleyin. Daha fazla inhibisyon olmadığından emin olmak için bir mikroliter daha antimycin A ekleyin.
Solunumda azalma varsa, solunumda bir azalma olmayana kadar ek enjeksiyonlarla devam edin. Şırınnayı% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Odanın oksijen konsantrasyonuna bak.
Konsantrasyon 125 mikromolarının altındaysa, oda havasına reoksijene veya oksijenin solunum akısını sınırlamamasını sağlamak için hafif hiperoksijenat. Beş mikrolitre 0.8-molar askorbat ekleyin. Şırınnayı% 70 etanolde üç kez yıkayın.
Hemen 0,2 molar TMPD'lik 10 mikrolitre ekleyin ve solunumun artmasını bekleyin. Şırıngayı etanol ile yıkadıktan sonra, askorbat TMPD platolarının solunum akısı olduğunda hemen 25 mikrolitre 4-molar sodyum azit ekleyin. Dosya, Kaydet ve bağlantıyı kes'e tıklayarak sonlandırın.
Doku homojenatının mililitresinde 40 miligramın hızlı oksijen tükenmesi ile sonuçlendiği gözlendi. Oksijen tüketimi mililitre doku homojenatı başına 30 ve 20 miligram ile önemli ölçüde yavaşladı, ancak substratların veya ADP'nin yokluğunda kısa sürede hızla azaldı. Doku homojenatının mililitre konsantrasyonu başına 10 miligram optimum oksijen tüketim oranı ile sonuçlandı.
NADH ve süksinit bağlantılı oksidatif fosforilasyon ve elektron transferinin yanı sıra Kompleks IV aktivitesini değerlendirmek için bir SUIT protokolü kullanılmıştır. Sitokrom C salınımı piruvat ve malat veya süksinit ve rotenon varlığında değerlendirildi, her ikisi de homojen preparatın mitokondrilere zarar vermediğini ortaya koydu. Ayrıca EO771 tümörlerinde NADH bağlantılı oksidatif fosforilasyonun ihmal edilebilir olduğu bulunmuştur.
MAKSimal elektron akışını sağlamak için FCCP'nin titrasyonu, EO771 tümörlerinde oksidasyon yerine fosforilasyonun solunumla sınırlı olduğunu ortaya koydu. Tümör homojen solunum profilleri, tümördeki N ve S bağlantılı substratlar tarafından desteklenen azalmış maksimal elektron transferi dışında implante edilmemiş, digitonin permeabilize EO771 hücrelerinin profillerine benzerdi. Süksinit solunum kinetiği, maksimum hıza ulaşana kadar ADP'nin alt doyma titrasyonları ile daha da değerlendirildi.
Süksinit ve rotenon varlığında ADP'nin yarı maksimal konsantrasyonu 37,5 mikromolarken, maksimum oran miligram başına saniyede yaklaşık 10,5 piomole idi. Rutin bakımda kurulan aletler ve doku kullanımı, bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu işlemlerin ardından faiz sorununa dayalı olarak oran normalleşmesine yönelik kitle veya işaretleyiciye özgü diğer yaklaşımlar uygulanabilir.
Yaygın önlemler, sitrat sintazının toplam protein nicelemesini ve enzimatik aktivitesini içerir, ancak model sistemine, istatistiksel tasarıma ve araştırma sorusuna göre değişir.
