Yazarlar çeşitli kaynaklardan İngiltere'de mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (refs ver. dahil olmak üzere mali desteği kabul EP/K011685/1, 1/K024485/EP) ve yüksek lisans öğrencilik için JH; Leverhulme güven (RPG-2014-292); Wellcome Trust kurumsal stratejik destek fonu (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); ve University of Manchester Üniversitesi Manchester Araştırma Enstitüsü (UMRI pompa astar Fonu) ve SW teknik yardım Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) tarafından başkanlık doktora burs için de minnetle kabul edilmektedir.

<ol>
	<li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Strategies+in+Nanolithography.">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).</li><li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Approaches+to+Nanofabrication:+Molding,+Printing,+and+Other+Techniques.">New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques.</a> Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).</li><li>Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Scanning+Probe+Lithography.">Advanced Scanning Probe Lithography.</a> Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).</li><li>Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-Pen"+Nanolithography.">"Dip-Pen" Nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Dip-Pen+Nanolithography.">Applications of Dip-Pen Nanolithography.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fountain+Pen+Nanochemistry:+Atomic+Force+Control+of+Chrome+Etching.">Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching.</a> Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).</li><li>Kim, K. -. H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nanofountain+Probe+with+Sub-100+Molecular+Writing+Resolution.">A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution.</a> Small. 1, 632-635 (2005).</li><li>Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM+as+a+Lithography+Tool+in+Liquid:+Spatially+Controlled+Deposition+of+Fluorescent+Nanoparticles.">FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).</li><li>Salaita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+with+55+000-Pen+Two-Dimensional+Arrays.">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).</li><li>Huo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Pen+Lithography.">Polymer Pen Lithography.</a> Science. 321, 1658-1660 (2008).</li><li>Shim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hard-Tip,+Soft-Spring+Lithography.">Hard-Tip, Soft-Spring Lithography.</a> Nature. 469, 516-520 (2011).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Force-Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Arrays+in+Polymer+Pen+Lithography.">"Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography.</a> Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).</li><li>Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Scanning+Probe+Nanolithography+Facilitated+by+Automated+Alignment+of+Probe+Arrays.">Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays.</a> RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).</li><li>Noh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Multipoint+Force+Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Tip+Arrays+in+Scanning+Probe+Lithography.">"Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography.</a> Small. 11, 4526-4531 (2015).</li><li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder.">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li><li>Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-Bioelectronics+via+Dip-Pen+Nanolithography.">Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography.</a> J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).</li><li>Giam, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe-Enabled+Nanocombinatorics+Define+the+Relationship+Between+Fibronectin+Feature+Size+and+Stem+Cell+Fate.">Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).</li><li>Eichelsdoerfer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Molecular+Patterning+with+Polymer+Pen+Lithography.">Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography.</a> Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+Direct+Bonding+of+Nanoporous+Polymer+Membranes+to+PDMS+or+Glass+Microdevices.">Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices.</a> Lab Chip. 10, 548-552 (2010).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-+and+Time-Dependent+Feature+Size+and+Shape+Control+in+Molecular+Printing+via+Polymer-Pen+Lithography.">Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography.</a> Small. 6, 1082-1086 (2010).</li><li>Sheehan, P. E., Whitman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Diffusion+and+The+Role+of+Humidity+in+"Dip+Pen+Nanolithography".">Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography".</a> Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Metal+Nanowires+Using+Microcontact+Printing.">Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing.</a> Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).</li><li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates.">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li><li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour:+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine.">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li><li>Davey, M. R., Anthony, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Cell Culture: Essential Methods. , 153-172 (2010).</li><li>Brinkmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdigitated+Multicolored+Bioink+Micropatterns+by+Multiplexed+Polymer+Pen+Lithography.">Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography.</a> Small. 9, 3266-3275 (2013).</li><li>Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-Assisted+Dip-Pen+Nanolithography+of+Oligonucleotides+and+Proteins.">Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins.</a> ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).</li><li>Carnally, S. A. M., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Catalysis+to+Enhance+Scanning+Probe+Nanolithography.">Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography.</a> Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).</li></ol>

Hizalama algoritma ve yazılım tarafından geliştirilmiş ve Manchester Üniversitesi için özeldir. Http://www.click2go.umip.com/ indirmek için kullanılabilir.

Bu protokol kullanıcılara hızlı bir şekilde yüksek homojenlik ve kontrol edilebilir özelliği boyut üzerinde büyük biçimlenme nanolithographic gerçekleştirmek için uygun bir metodoloji sağlamak için hizmet vermektedir (cm2) alanları. Bu geniş bir alan nanopatterns taşıyan yüzeylerde sonra daha da çeşitli uygulamalar için gelişmiş. Bu teknolojinin bir büyük uygulama nanofabricated yüzeyler üretimi için hücre yüzeyine etkileşim çalışmaları mevcuttur. Bu raporu hMSC morfoloji kontrolünü nanofabricated yüzeylerde tarafından gösteren bu malzemeler, hücre kültürü bazı açıklayıcı örnekler gösterir.
Bu protokol anahtar enabler yüzeylerde, hücre kültürü deneyleri hızlı ciro sağlayan nano çözünürlük aşağı özellikleri son derece düzgün ve yüksek üretilen iş üretimini sağlayan otomasyon hizalama yordam (adım 4) olduğunu. Bu hizalama algoritma kullanılarak yapılan polimer kalem litografi yaklaşık 30 dakika içinde Nano özellikleri oluşturmak yapabiliyor. Tekrarlanabilirlik ve otomatik hizalama doğruluğunu ve böylece desenli özellikleri tekdüzelik olduğunu ancak eleştirel üretilen bağımlı olan sonda dizilerin kalitesi için (adım 1 ve 2). Künt, kırık veya eksik probları neden herhangi bir kusurları onların hazırlık; gibi kapana kısılmış hava kabarcıklar (adım 1.5) veya sondalar uygunsuz ayrılması (adım 1.8) yöneticisinden yanlış hizalama ve kalitesiz litografi neden olabilir.
Bu yöntem bir sınırlama güç geribildirim güvenmek diğer hizalama yöntemleri ile ortak hisse bildirdi. Sondalar yüzeyi ile temas olduğunda doğru belirlenmesi arka plan titreşimler ortam çevrenin ve örnek sahne hareketinin neden olduğu için hesap gerektiğinden sınırlıdır. Genel olarak, sensörler bir kuvvet duyarlılık µN rejimi (Bu durumda 2 µN) var, ama hizalama algoritma yalnızca herhangi bir 'yanlış mutlak' resul önlemek için sondalar ve yüzey arasında kesin ilgili kişi olarak en az 490 µN bir kuvvet kaydetmek için tasarlanmıştır arka plan gürültü ting. 13 böylece, bu yöntem büyük özellikleri (1-2 µm) üretmek eğilimi gerekir sondalar genişletilmiş beri büyük bir mesafe üzerinde z-eksen (bir kuvvetle sonucu daha yüksek) amacıyla ilgili kişi kayıt. Telafi etmek için zazaltarak daha küçük özellikler oluşturulabilir-eksen mesafe seyahat sırasında litografi adım (5 mikron yerine 3 µm olarak adım 5.2.3.2 'Siyah' ayarı girerekÖrneğin,).
Hizalama, daha önce en zaman zorlu ve imprecise adımda olduğu gibi yine de, bu sınırlama ile otomasyon algoritması paralelleştirilmiş tarama prob litografi yöntemleri, uygulamada önemli bir özelliği hitap edebilmektedir Bu tekniklerin uygulanması. Şimdi bu Otomasyon imalat işleminin hızı sınırlaması adımı tekniğinde kendisi yazma için hizalama geçer. Bu iletişim kuralı bu hizalama yordamını uygulama PPL gösterir iken, çerçeve lipid-DPN26 ve matris destekli litografi27 yanı sıra potansiyel gelecek katalitik gibi SPL teknikleri bir dizi için uygulanabilir sonda sistemleri. 28

Nanoteknoloji bağlı olarak verimli ve güvenilir bir şekilde nano Özellikler yüzeylerde imalatı yetenekli yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde çalışıyor. 1 , 2 ancak, böyle üreten ve güvenilir bir şekilde geniş alanlara (birden çok cm2) özellikleri olmayan önemsiz bir çaba, nispeten düşük maliyetli. Yarıiletken Endüstrisi türetilmiş çoğu mevcut teknikleri 'sert' malzeme imal etmek ablatif fotolitografi güveniyor. Daha yakın zamanlarda, taş teknikleri prob mikroskobu (SPM) tarama elde edilen nano tasarımları hızlı prototipleme için kullanışlı ve çok yönlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. 3 SPM tabanlı teknikleri rahat ve hızlı bir şekilde 'herhangi bir kullanıcı tarafından tanımlanan desen yazmak ' edebiliyoruz. En iyi bilinen bu Mirkin vd., nerede bir tarama sonda 'kalem' moleküler 'mürekkep' bir şekilde yazmaya benzer özellikler üreten yüzeye aktarmak için kullanılan4 tarafından öncülük daldırma-kalem nanolithography (DPN), olduğunu. Bir sonda bir yüzey üzerinde taranmış ortam koşulları altında 'mürekkep' molekülleri yüzey yolu ile için transfer formları sonda ve yüzey (Şekil 1) arasında bir su menisküs. DPN böylece malzemeler, polimerler ve biomolecules gibi "yumuşak" malzemeler de dahil olmak üzere geniş bir nanolithographic birikimi sağlar. 5 ilgili teknikleri sıvı tesliminde kanalları ile mühendislik probları kullanarak çeşitli anılacaktır 'nanopipettes' ve 'nano-Çeşme kalemler' da bildirilmiştir. 6 , 7 , 8
SPM kaynaklı litografi daha geniş uygulama için ana engel çıktı, tek bir sonda ile desen santimetre çaplı alanlara aşırı uzun bir zaman gerektirir gibidir. Bu sorunu gidermek için erken çabaları ile her ikisi 'tek-boyutlu' ve 'iki boyutlu' (2D) prob diziler santimetre büyüklüğünde alanlar litografi için bildirilen konsol tabanlı DPN parallelization üzerinde duruldu. 5 , 9 ancak, bu konsol diziler oldukça karmaşık multistep imalat yöntemleri ile üretilen ve oldukça kırılgandır. Polimer kalem litografi (PPL) icadı yumuşak siloxane elastomer probları cam slayda gümrüklü 2D bir dizi standart SPM cantilevers değiştirerek bu sorunu ele aldı. 10 bu basit sonda kurulumu önemli ölçüde geniş alanlar, nanolithography daha geniş bir uygulama yelpazesi için açılması biçimlenme karmaşıklığını ve maliyetini azaltır. Bu konsol ücretsiz mimarisi de ipucu zor yumuşak-bahar litografi, yumuşak kullanılarak üretilen modelleri ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş çözünürlük vermek zor silikon ipuçları ile yumuşak elastomerik destek melez sağlayan11 genişletildi Elastomer ipuçları.
Önemli bir faktör bu 2D array teknolojilerin yürütülmesine böylece litografi kullanılmaktadır zaman tüm probları yüzey temas gelen sonda dizi aynı anda tam olarak yüzey substrat paralel olması gerektiğidir. Diğerleri daha sonra veya hiç kişiye gelecek iken bazı probları ile temas yüzeyi daha önce dizi, iniş sırasında gelecek bu yana bile küçük bir kayma özelliği boyutu büyük bir fark dizinin bir taraftan diğerine, neden olabilir. 12 tam hizalama nerede temas yüzeyi daha önce probları sıkıştırılır, PPL ile özellikle yumuşak elastomer probları deformasyon nedeniyle önemlidir yüzeyinde büyük bir ayak izi bırakarak.
PPL erken çalışmaları tamamen görsel muayene olarak onlar temas yüzeyi getirilen piramit probları deformasyon gözlemlemek için dizinin monte edilmiş bir kamera ile hizalama işlemi size yol istihdam. 10 hizalama sondalar hangi tarafında ilk, yüzeyi ile temas geldi gözlemleyerek sonra açı ayarlama ve sonda her tarafında temas halinde aradaki fark kadar yordamı yinelemeli bir şekilde yinelenen karar oldu gözünün içine bakarak ayırt edilemez. Öznel görsel denetim işleci tarafından bu hizalama yordamı kullanır gibi tekrarlanabilirlik düşüktür.
Daha sonra temas yüzeyi probları, üzerine uygulanan kuvvet ölçmek için belgili tanımlık substrate altında monte bir kuvvet sensör oluşan daha objektif bir yaklaşım geliştirilmiştir. 12 hizalama böylece hangi tüm probları aynı anda temas halinde olduğunu göstermiştir sarf, kuvvet en üst düzeye çıkarmak için tilt açıları ayarlayarak elde edildi. Bu yöntem yüzey paralel 0,004 ° içinde için hizalama mümkün olduğunu gösterdi. Bu 'güç geribildirim tesviye' Şimdi iki bağımsız raporlar tam otomatik sistemlerine uygulanmıştır. 13 , 14 hem kuvvet sensörleri substrat altında veya üstünde dizi takılı bir üçlü kullanın ve temas yüzeyi ve sonda diziler arasında üzerine sarf güç miktarını ölçmek. Bu sistemler yüksek hassasiyetli, 1 cm uzunluk ölçek,14 veya ° sağlamak bu otomatik hizalama sistemleri aynı zamanda 1.4 cm.13 üzerinde büyük tasarruf Operatör süresinin ve tamamlamak için geçen toplam süre ≤ 0,0003 misalignments ≤0.001 ° raporlama vermek taş baskı işlemi.
Bir büyük yüksek üretilen iş yüzey imalat bu teknoloji tarafından etkin hücre kültür yüzeylerde nesil uygulamadır. Şimdi de kurulan bu hücre fenotip hücreler ve yüzey özellikleri arasındaki ilk etkileşim kontrol ederek manipüle edilebilir ve bu-ebilmek var olmak arttırmak nano. 15 özel olarak, tarama prob litografi yöntemleri gibi hücre kültürü deneyleri için nanofabricated yüzeyler çeşitli üretmek için uzun facile yöntemi gösterilmiştir. 16 Örneğin, nano şekillerinin kendi kendine monte monolayers ve hücre dışı matriks proteinleri şablonu esas alan PPL ve DPN nano değiştirilme tarihi malzemeleri malzeme potansiyelini çalışmaya kullanılmıştır sunulması yüzeyler farklılaşma indüklenen. kök hücreler. 17
Bu iletişim kuralı geniş alan PPL sağlar değiştirilmiş atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sistem kullanımını açıklar. Sonda-yüzey teması, yinelemeli hizalama işlemini otomatikleştiren bir algoritması ile birlikte belirleme aracı olarak birden fazla kuvvet sensörleri kullanarak güç tespiti detay. Bu desen hücre dışı matriks proteini fibronektin ile sonraki functionalization ve insan mezenkimal kök hücre (hMSC) kültürü açıklanmıştır, PPL fabrikasyon yüzeyler hücre kültürü için uygulanan bir gösteri olarak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZ&#920;&#934;) translation and goniometer stage</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>P40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM control software</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>C3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z225568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaFlo</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-FMG-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Dry Oxygen Service Pump</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-OPE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ015WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Humidity Generator</td>
			<td>proUmid</td>
			<td>MHG32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline Plus Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon masters</td>
			<td>NIL Technology</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright snapshot fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>10x and 60x UPlan FLN &#8734;/-/FN 26.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright bright field microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 2500M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Ultrawave Ltd.</td>
			<td>U95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34863</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Sildes, Clear, Ground</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(7&#8211;8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>VDT-731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT7900.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>479527</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(25&#8211;35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>HMS-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat 100 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BALI828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KS230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ST10-031T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Carbon Tape</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGG3939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-Mercaptohexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448303-1G</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>643203</td>
			<td>Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529303</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84415</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675105</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) nitrate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203106</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/0840/53</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>&#34;Detergent&#34; in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10253041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10790113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cantilever</td>
			<td>BudgetSensor</td>
			<td>ContAl-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-area scanning probe nanolithography facilitated by automated alignment and its application to substrate fabrication for cell culture studies

Prob mikroskobu tarama çeşitli yöntemler nanometre-ölçek özellikleri yapıcı ('katkı') yukarıdan aşağıya imalatı için oluşturulmasını sağlamıştır. Tarihsel olarak, sonda litografi tarama büyük bir dezavantaj tek sonda sistemlerin özünde düşük işlem hacmi oldu. Bu artan nanolithography üretilen iş etkinleştirmek için birden çok probları bir dizi kullanımı ile ele vardır. Böylece tüm Probe prob paralelleştirilmiş böyle nanolithography uygulamak için substrat yüzeyli sonda dizilerin doğru hizalama, çok önemlidir aynı anda tekniğinde desenlendirme başladığında yüzeyi ile temas. Bu iletişim kuralı polimer kalem litografi sonda dizileri hızlı, doğru ve otomatik hizalama için bir algoritma kullanılarak kolaylaştırdı, santimetre büyüklüğünde alanlar üzerinde nanometre-ölçek özellikleri üretmek için kullanımını açıklar. Burada, thiols altın yüzeyler üzerinde nanolithography özellikleri nesil ile yüksek homojenlik göstermektedir. Bu kalıpları sonra yüzey Yönetmen: hücre morfolojisi çalışmaların içeriğinde fibronektin ile functionalized.

Otomatik hizalama başarılı olmuştu olup olmadığını denetlemek için hizalama (elektronik tablodaki verilerde adım 4.8) üzerinden çizilen grafikleri incelenmiş. Hizalama işlemi başarılı olmuştu nerede hangi tarafından örnek sahne θ ve φ eksenleri hareket ettirildiğinde açı karşılık gelen iki araziler yükselen ve azalan veri noktaları bir dizi gösterdi. Her araziler, veri noktalarının iki doğrusal uyar iyi tanımlanmış bilgisayar'ın "en büyük zgösteren zirve" gösterdi-uzantısı ve hizalama olduğu karşılık gelen açısı elde (Şekil 4A ve 4B). Bu süreçtir tekrarlanan dört kez (yani, her eksen için iki kez) ve dört koordinatları kümesi olarak çizilen. Koordinatları her çift kesişim böylece genel olarak optimum açı (Şekil 4 c) gösterir. 13 içinde hal nereye hizalama başarısız oldu, bu onların karşılık gelen θ ve φ açısı araziler iyi kalitede doğrusal uyar vermeyin veya (Şekil 5) kesişmiyor görülebilmektedir. Böyle başarısız hizalamaları normal sonucu olarak varlık düzgün kesilmiş ya da sonda sahibine (adım 1.7, 1.8 ve 2.2) monte diziler uygulanır. Bu gibi durumlarda, diziler atılan yeni bir hazır ve (adım 1 ve 2) monte ve hizalama işlemi (adım 4) tekrarladı.
Başarılı hizalama ve litografi MHA PPL tarafından ile desenli altın yüzeylerde sonra ifade yerini almıştı olup olmadığını incelemek için yanal kuvvet mikroskobu kullanarak görüntüsü. Daha büyük bir alan İnceleme yazdırılan yüzeyler, aynı zamanda dağlama yatırılan thiol (Şekil 6 ve Şekil 7) tarafından korunmamasına altın sonra yüzeylerde optik mikroskobu tarafından yapılmıştır. Ancak, kabartma desen daha fazla functionalization için kullanılamaz ve yalnızca yazdırılan yüzey yüzeylerde toplu temsilcisi örnekleri üzerinde desenlendirme onaylamak için kullanılmalıdır. Baskılı desenler bireysel kalemler (Şekil 8) karşılık gelen boş alanları gösterirsen, bu sonuç ve sonda diziler üretimini başarıyla yapıldı değil ki bazı probları hasarlı veya eksik olduğunu gösterir. Sondalar bu inhomogeneity nerede perfluorinated kaplama yıpranmış uzak (adım 1.3), bir eski ana kullanımı nedeniyle olabilir dizi asıl ayrıldığında uzakta paramparça bazı probları sonuçlanan. Bu gibi durumlarda, yeni bir ana kullanılmalıdır. Ayrıca hava varlığı nedeniyle kabarcıklar yedekleme cam ve master (adım 1.5) arasında sıkışıp, ya da sonda dizi temiz bir şekilde asıl slayttan (adım 1.8) kür sonra ayrılmış değil eğer kaynaklanıyor olabilir.
Floresan mikroskopi görüntüleri inkübe hMSCs da vardı fibronektin functionalized yüzeylerin (Şekil 9) toplanan. Genel olarak, tüm yüzeylerde vitro kültür ortamında istikrarlı ve hücreler yapıştırılır ve yazdırılan desenlere daha küçük izole 20 x 20 düzenlemek-in şekil halinde onların morfolojisi adapte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Şekil 1. Polimer kalem litografi moleküler mürekkep taşıma yolu ile su menisküs sonda ucunda gösterilen şematik gösterimi. (A) yan görünüm ve (B) yukarıdan polimer kalem dizi sonda dizi ve yüzey substrat tam hizalandığında, tüm Probe prob ile temas yüzeyi aynı anda, paralelleştirilmiş litografi kaynaklanan geldiğini gösterir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Şekil 2. Polimer kalem litografi Şematik diyagramı ayarla yukarıya (A) nerede hazırlanan soruşturma dizi tutucu soruşturma için bağlı ve AFM tarayıcıya monte deneysel ayarlarý genişletilmiş yan görünüm. Belgili tanımlık substrate sahne alanı'nda yer alıyor, hangi bulunan aşağıda üç kuvvet sensörleri. (B) bir temsili örnek sahne göre AFM tarama baş gösteren birleştirilmiş araçları. (C) alt görünümü kuvvet sensör yerini gösteren. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Şekil 3. Şematik Gösterim hizalama yordamını spektroskopisi programinda resmeden. AFM tarayıcı 10 µm 100 ms içinde düzenlenen 250 ms'ye konumundaki 100 ms içinde 10 µm retraksiyon arkasından ve retrakte konumundaki 250 ms için düzenlenen bir mesafeye göre örnek doğru sonda taşımak için ayarlanır. Hareket daha sonra hizalama süreci boyunca tekrar edilir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Şekil 4. Başarılı bir hizalama gösteren grafikler. ● gerçek değerleri ölçülür ve + en iyi nerede gösterir z konumunda tilt açıları (A) çap ve φ (B) başarılı bir hizalama için grafikleri en küçük kareler yöntemi ile uygun. (C) grafiği φ θ karşı açıları nerede en büyük z-pozisyon ulaşıldı dört puan ile donatılmış. İşaretlenmiş kesişim noktasını her iki eksen son optimum tilt açıdır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Şekil 5. Başarısız bir hizalama gösteren grafikler. ● gerçek değerleri ölçülür ve + en iyi nerede gösterir z konumunda tilt açıları (A) çap ve φ (B) başarısız bir hizalama için grafikleri en küçük kareler yöntemi ile uygun. (C) grafiği φ θ karşı açıları nerede en büyük z-pozisyon ulaşıldı dört puan ile donatılmış. Hiçbir açık OPTIMA veya kavşak noktası gözlenen ve bu nedenle optimum hizalama açıları değil çözümlenir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Şekil 6. Açıklayıcı optik mikroskobu ve atomik kuvvet mikroskobu ile MHA hizalanmış PPL dizileri tarafından desenli ve sonra kazınmış altın yüzeylerde görüntülerini. (A) ve (B) ardışık olarak büyütülmüş optik mikroskobu görüntüleri baskılı desenler vardır; (C) bir AFM topografya tek ızgara desen görüntüdür. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Şekil 7. MHA ile hizalanmış PPL dizileri tarafından desenli ve sonra kazınmış altın yüzeylerde görüntülerini açıklayıcı optik mikroskobu. (A) ve (B) ardışık olarak büyütülmüş optik mikroskobu görüntüleri baskı kalıplarının ve (C) geniş alana homojen desen gösterir daha düşük bir büyütme resim. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Şekil 8. Düzensiz MHA ile desenli ve sonra kazınmış altın bir substrat açıklayıcı optik mikroskobu görüntüsü. (İlave gösterilen) amaçlanan desenleri ızgaralar zartırarak üretilen her iki satır ile 20 satır düzenlenen 20 nokta satır yinelenen-eksen uzantısı 1 µm (5-5 µm arasında değişen) tarafından. Bazı bölgelerde hiçbir desen, o konumlardaki eksik probları nedeniyle oluşturulan olduğunu görebilirsiniz. Alanlarda nerede nokta sadece iki satır üretilmektedir, bu sonuç bir prob var ancak dizi için tam zgenişletildiğinde sadece mevduat özellikleri tam olarak işleyen probları aynı yüksekliğine değil gösterir-ekseni uzaklığı. Bu görüntüde, kontrast bilinçli gözlem kısmen yazdırılan alanların etkinleştirmek için değiştirilmiş. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Şekil 9. Epifluorescence mikroskobu görüntüleri fibronektin diziler şablonu esas alan PPL tarafından kültürlü hMSCs. (A) ve (B) yüksek büyütme gösteren tek tek hücreler görüntülerdir. (C) bir örnek desen bir yapışık olmadan fibronektin dizinin hücre ve (D) (Yazdırılan deseni şematik de kakma gösterilir) bir kılavuz düzenleme kültürlü hücreleri bir geniş alan görüntüsünü gösterir. Hücreleri ve hücre çekirdeği (mavi) fibronektin (kırmızı), F-aktin (yeşil) göstermek için lekeli. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies at JoVE.com

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Burada için geniş alan tarama prob nanolithography sonda diziler yinelemeli hizalama gibi hücre yüzeyine etkileşim çalışmaları için taş desen kullanımı tarafından etkinleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Otomatik hizalama ve substrat imalat hücre kültür araştırmaları için uygulama tarafından kolaylaştırdı geniş alan tarama prob Nanolithography

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

large-area-scanning-probe-nanolithography-facilitated-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Görüntüleme.  University of Manchester. Burada için geniş alan tarama prob nanolithography sonda diziler yinelemeli hizalama gibi hücre yüzeyine etkileşim çalışmaları için taş desen kullanımı tarafından etkinleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Biyomühendislik

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

Kültürler Hücre Şok Dalga Uygulama

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

Küçük Ölçekli Hücre İşleme için Otomatik Karşı Akım Santrifüj Sistemi

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...