Mickael Lelek, Orestis Faklaris ve verimli tartışma için Nicolas Bourg, Andrey Aristov ve Elena Rensen süper çözünürlük tekniği ile ilgili yardım ve Shailaja Seetharaman şekilde alt alta yazılmalıdır dikkatli okumak için teşekkür ederiz. Minnetle anıyoruz Institut Pasteur UtechS fotonik BioImaging (Imagopole) Citech (Paris, Fransa) yanı sıra Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR-10-INSB-04; tarafından desteklenen Fransa-BioImaging altyapı ağı Yatırımlar gelecek için) ve Région Ile-de-France (Domaine d programı ' Intérêt Majeur-Malinf) Elyra mikroskop kullanımı için. Bu eser tarafından desteklenmiştir Ligue Contre le kanser ve Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR-16-CE13-0019).

1. Coverslips hazırlık (gün 1, 30 dk)
<ol><li>18-mm nº1.5H (+/-5µm 170 µm) cam coverslips plastik bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Aseton ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL ölçek rafa koymak.</li>
	<li>Raf mutlak etanol ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL kabı aktarın.</li>
	<li>Ultrasonik temizleyici cihazda kabı yerleştirin ve raf mutlak etanol ile dolu yeni bir 100 mL kabı transfer (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında. "Tarih" basın ve 10 min için bekleyin.</li>
	<li>Laminar akış başlık altında rafa koymak ve kuru veya filtre uygulanmış hava akımı ile coverslips kuru coverslips yapalım.</li>
	<li>Coverslips ile raf bir plazma temizleyici cihazı yerleştirdim. Vakum pompası üzerinde geçiş, kapıyı kapat, vakum yapmak ve kısa bir süre sonra temizlendikten sonra plazma 1 dk. kullanım coverslips geçiş için 3 dakika bekleyin. Onları saklamak değil.</li>
</ol>2. hücre kaplama (gün 1, 20 dk)
<ol><li>Gliyal hücre kültürünü U373 içinde en az gerekli orta (MEM) % 10 Fetal sığır Serum, %1 penisilin-streptomisin ve % 1 gerekli olmayan amino asit ile 10 cm Çap plastik kabında büyümek.</li>
	<li>12-şey plakaları laminar akış başlık altında temiz cam coverslips yerleştirin ve Önceden ısıtılmış cep orta iyi başına 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO2) hücreleri içeren bir tabak al.</li>
	<li>Orta kaldırın ve 10 mL PBS ekleyin.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA.</li>
	<li>Kuluçka makinesi 2-3 dakika içinde geri çanak yerleştirin.</li>
	<li>Yemek olarak 37 ° C'de ısıtılmış sıcak orta 10 mL ekleyin ve hücreleri resuspend.</li>
	<li>Coverslips içeren 12-şey tabak (hücre ~ 150 µL) kuyuya başına tohum yaklaşık 100 000 hücre.</li>
	<li>En az 6 h (ya da bir gecede) hücre yayılmasını sağlamak bekleyin.</li>
</ol>3. hücre fiksasyon (2 gün, 2 saat)
<ol><li>80 mM borular, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, sitoiskeleti önbellekle hazırlamak ve pH 6,9 için ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS kaldır ve yavaşça çıkarma/fiksasyon çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin (%0.25 oxazolidin, % 0.3 Triton X-100 sitoiskeleti arabelleği) 37 ° C'de ısıtılmış</li>
	<li>60 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Çözümü kaldır ve yavaşça sitoiskeleti arabellekte seyreltilmiş Önceden ısıtılmış ve taze hazırlanmış %4 PFA (paraformaldehyde) çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin. Uyarı: Kimyasal başlık altında iş ve eldiven kullanabilirsiniz.</li>
	<li>12-şey plaka da kuluçka 37 ° C'de 10 dakika geri koyun.</li>
	<li>PFA kaldırın ve PBS 3 mL iyi başına ekleyin. Not: Eldiven ile kimyasal başlık altında iş ve geri dönüşümlü PFA belirli bir depo gözünde koymak.</li>
	<li>İki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve oxazolidin gelen autofluorescence gidermek için PBS içinde seyreltilmiş taze hazırlanmış 10 mM NaBH4 çözüm ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 7 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Geri dönüşümlü NaBH4 belirli bir depo gözünde koymak.</li>
	<li>Üç kez 5 dk PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve engelleme çözüm (PBS içinde %5 BSA çözelti) ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (veya gecede 4 ° C'de) 1 h için kuluçkaya. Not: Sitoiskeleti arabellek oda sıcaklığında birkaç ay depolanabilir. İngiltere'de yılın, NaBH4 ve oxazolidin özel bakım (başlık, eldiven ve belirli geri dönüşüm kutuları) ile ele alınmalıdır. Çözümler eklenir ve yavaşça hücrelerin bütünlüğünü korumak için kaldırıldı. Kuru hücreleri izin önemlidir.</li>
</ol>4. Immunostaining (gün 2, 5h)
<ol><li>Birincil antikorlar anti-vimentin ve anti-tübülin 1:500 seyreltme engelleme çözümde bulunan kullanılarak çözüm hazırlamak.</li>
	<li>Seyreltilmiş birincil antikorlar 100 µL damla parafin film tabakası üzerinde koymak ve onları üstüne coverslips hücrelerle aşağı bakacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>2 h. PBS ile coverslips geri bir 12-şey tabak içinde dolu koymak için birincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez.</li>
	<li>Bu arada, ikincil antikorlar çözüm engelleme çözümde bir 1:1, 000 seyreltme adlı Anti-fare Alexa647 ve anti-sıçan Alexa555 kullanarak hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. 4.2 gibi devam edin. hücrelerin ışıktan korunması.</li>
	<li>Coverslip geri PBS ile dolu bir 12-şey plaka koymak. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez. PBS kaldırmak ve 0.5 mL 0,1 µm tetraspeck boncuk 1 µL ile karışık PBS ekleyin.</li>
	<li>Wells bir orbital Çalkalayıcı 30 dk. durulama PBS ile koymak. PBS kaldırmak ve hücreleri bir % 4 İngiltere'de yılın çözümde PBS ile 5 min için kuluçkaya. Üç kez PBS durulayın. Not: Birkaç hafta içinde PBS 4 ° C'de sabit hücreleri saklanabilir Immunostaining son anda yapılmalıdır.</li>
</ol>5. numune hazırlama (gün 3, 5 dk)
<ol><li>Aliquots MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glikoz oksidaz (100 x, 50 mg/mL), katalaz (500 x, 20 mg/mL) bir buz sepete koy.</li>
	<li>Tris-NaCl arabelleği 50 mL hazırlamak (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) glikoz (100 mg/mL) % 10'u ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Arabellek hemen önce 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glikoz oksidaz, 40 µg/mL katalaz (80-200 U/mL) ile görüntülemede görüntüleme 1.2 mL % 10 glikoz Tris-NaCl önbellekle hazırlayın.</li>
	<li>Manyetik örnek kutusunda (örneğin chamlide odası) etiketli hücreleri içeren coverslip dağ ve tamamen odası doldurmak için görüntüleme tampon ekleyin. Kapak koyun ve hiçbir hava kabarcığı görüntüleme arabellek ve kapak arasında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mutlak etanol ile örnek alt temiz ve sızıntı olmadığını doğrulayın. Düzgün gerekirse örnek sahibi imzalamaya yağ kullanın. Not: MEA çözüm (HCl kullanarak ayarlanır pH 8.3), glikoz oksidaz 50 mg/mL, hisse senedi ve katalaz, 20 mg/mL su stokunun 1 M stok hazırlamak, aliquots yapmak ve bana ve glikoz oksidaz ve katalaz için bir yıl için bir ay için-20 ° C'de depolayabilirsiniz. Aliquots refreeze değil. Tris-NaCl arabellek önceden hazırlamak ve birkaç ay için oda sıcaklığında saklayın. Glikoz deney (Adım 5.3) günü ekleyin.</li>
</ol>6. resim alma (3. gün, ~ 1h hücre başına)
<ol><li>Mikroskobunun geçin. Satın alma yazılımı geçin ve sistem Starttuşuna basın.</li>
	<li>Satın alma sekmesini genişletme Imaging kurulum aracı Kur Yöneticisi aracını grubunda seçin. Satın alma lazer WF (geniş alan) modunu seçin. 100 X NA 1.46 hedefi seçin. Aydınlatılmış görüş alanı azaltmak için bir kolimatör kullandığı TIRF u-HP modunu seçin ve lazer enerji daha küçük bir alanına konsantre. 100nm piksel boyutunu verir optovar 1.6 x objektif kullanın.</li>
	<li>Saat serisi aracını seçin ve zaman atlamalı 50 000 çerçeveler ve çerçeveler arasında 0.0 ms ayarlayın. Kanalları aracını edinme parametre araç grubunda genişletin ve "Tümünü göster" seçin.</li>
	<li>Alexa647 parça ayarla: 642 ve 405 lazer uyarma hatlarında ve bunları açmak için kabul kontrol edin. "655 LP" emisyon filtre Görüntüleme kurulumuseçin. "647" yeniden adlandırın.</li>
	<li>Tıklayın '+' kanalları aracı başka bir ışık geçişi eklemek ve modu seçin "makas her: çerçeve" Imaging kurulum aracında. 561, 488 ve 405 lazer satırları kontrol edin ve bunları açmak için kabul edin. Seçin "BP 570-650 + LP750" emisyon filtre ve kullanma optovar lens 1.6 x. TIRF-uHP modu işaretli olup olmadığını denetleyin. Parça "555" yeniden adlandırın.</li>
	<li>Toplama modu aracını seçin ve çerçeve boyutu 200 x 200 piksel olarak ayarlayın. Odak aygıtlar ve strateji aracını seçin ve (Eğer bir odak kilidi sistemi) 1.000 kişi karelere kesin odağı ayarlayın.</li>
	<li>Petrol hedefte ve örnek koydu. Yerleştirme sekmesini seçin ve floresan lamba çekim açın. Odağı bulmak ve hücrenin mercek kullanarak görüntüye bakın. Joystick kullanarak görüş alanı ortasına koymak.</li>
	<li>Geri alma moduna gitmek için satın alma sekmesini seçin. "647" dersi seçin, 642-lazer güç %0,2 olarak ayarlarsanız, 405-lazer güç 0 olarak ayarlayın, pozlama süresi 50 ms ve 50 kazanç için ayarla. Hücrenin üstünde belgili tanımlık perde gözlemlemek için sürekli Alım modunu seçin. Odağı ayarlayın. Görüş alanı içinde en az bir tetraspeck boncuk olduğundan emin olun, gerekirse görmek için kontrastı arttırmak. Bir Otomatik ölçek modu için kullanın. Snap tıklatarak vimentin ağ geniş alanlı epifluorescence görüntüsünü almak ve kaydedin. TIRF aydınlatma kontrol etmek için TIRF üzerinde tıklatın, aydınlatma ve/veya Kolimatör açısını aydınlatma homojen bir alanınız ve kaydetmek ayarlayın. Not: TIRF ve epifluorescent görüntüleri raw veri toplama başlamadan önce kaliteli olmalarını önemlidir. İş öğelerinin sürekli olmayan, non-birörnek etiketli filamentler neden kalitesiz dSTORM resimlere olmaktadır.</li>
	<li>"647" parça işaretini kaldırın ve seçin ve "555" parça. Mikrotubul ağ epifluorescence görüntüsünü alın ve kaydedin. TIRF görüntü çekmek ve çok kaydedin.</li>
	<li>"555" parça işaretini kaldırın, seçin ve "647" parça kontrol ardından süreklibasın. Kazanç 0 olarak koymak ve pozlama süresi 10 Bayan için 642-nm lazer güç Alexa647 boyalar en karanlık durum (~ 2 kW/cm2) pompa için % 100'e ayarlayın. Yanıp sönen fluorophores başladıktan sonra 15 ms maruz koymak ve 300 için kazanç. Aydınlatma TIRF modunu seçin. Olmadan otomatik ölçek aralığı gösterge modu tek molekül sinyalleri (kırmızı renkle gösterilir) kamera emdirmek değil doğrulamak için kullanın. Bu durumda, doygunluk kaybolana kadar kazanç azaltın. Tetraspeck boncuk satın başında doymuş kalacaktır. Hücre sürekli gözlem durdurmak için Dur tuşuna basın.</li>
	<li>Online işleme Aracı'nı genişletin ve fırtına görüntü alma sırasında görselleştirmek için PALM işleme Online kontrol edin. Aşağıdaki parametreleri kullanın: 9 için en yüksek maskesi boyutu (9 piksel çapı) ve en yüksek yoğunluk gürültü için 6. Tezler parametreleri (örtüşen yeterince parlak ve değil) işleme dikkate alınıp molekülleri tanımlayabilirsiniz. PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafikve çubuk grafik kaynak: hassas. Satın alma Başlattuşuna basın.</li>
	<li>Satın alma sırasında gerekirse (hiçbir odak kilidi aygıt varsa) yönlendirmesi. (Pozlama, lazer gücü) parametrelerini ayarlamak ve sonunda (%0,001 fluorophores bir Orta yoğunluk 1 µm tek molekül arasında en az bir mesafe ile tutmaya başlayan) 405 nm lazer çizgi geçiş (> 9 piksel 100 nm, tepe maskesi boy) ( Şekil 1A-B). Molekül yoğunluğu biraz çok yüksek ise, TIRF yerine aydınlatma HILO (son derece eğimli ve lamine optik levha) modunu kullanın. Bu lazer güç % 20 oranında artacak. Yeniden oluşturulan resmi aşağıda histogramı yerelleştirme hassas zirvesine çevresinde veya altında 10 ortalanır emin olun nm. Not: Genellikle zamanla molekülleri sayısını azaltır ve 405 nm lazer gücü yavaş yavaş buna göre artar. Yerelleştirme duyarlık (süper çözümleme görüntüsünün altında görüntülenen çubuk grafik) altında 10 bir tepe ile mümkün olduğu kadar azaltmak için hedeftir nm (şekil 1 c). Gerekirse, çok fazla parlak boncuk alanında varsa PALM resmin zıtlığını artırın.</li>
	<li>10'dan fazla6 yerelleştirmeler (genellikle 40 000 kare sonra) ulaştığında film durdurmak için Dur tuşuna basın. Lazerler %0,2 geri koymak (642 nm) ve 0 (405 nm). Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin. Parça "647" kanalları aracında, işaretini kaldırın ve seçin ve parça "555".</li>
	<li>Pozlama süresi için 25 ms ayarlayın ve 0'a kazanç. Sürekli düğmesine basın ve pompa Alexa555 boyalar karanlık durumuna (~ 2 kW/cm2 her) için % 100 488 ve 561 lazerler ayarla. Yanıp sönen, kazanç 250 için koymak fluorophores başladıktan sonra HILO aydınlatma modu kullanın ve tek molekülleri kameranın ölçüm göstergesi modu ile emdirmek değil olduğunu kontrol edin. Bu durumda, kazanç azaltın. Durtuşuna basın. 488-lazer gücü % 50 azaltmak.</li>
	<li>Satın alma Başlattuşuna basın. Satın alma sırasında giderek her zaman doygunluk limitte olmak kazanç artırın. Adım adım tek molekül bir Orta yoğunluk görüş alanı içinde (bkz: adım 6,18) tutmak için 405 nm lazer gücünü arttırın. 405 lazer 15 daha yüksek olduğunda % 20-30 488 lazer gücü azaltın. Sonra yavaş yavaş 488 molekülleri mümkün olduğunca hızlı yanıp sönen tutmak için 405 lazer çizgi artırırken azaltın. 405 lazer çizgi sadece üzerinde oranını artırır, ancak maksimum yoğunluk, 561 uyarma lazer ile birleştiğinde 488 lazer çizgi hem açık hem de kapalı fluorophores oranda artırır.</li>
	<li>Yok daha fazla molekül yanıp fazla 500 000 yerelleştirmeler (yaklaşık 20 000 kare sonra) ulaştığında satın alma ya da daha fazla durdurur. Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin. Not: Her zaman diğer renkler (veya etkinleştirme) ağartma önlemek için daha yüksek dalga boyu ile başlar. Chamlide odası kapalı değil beri görüntüleme arabelleğin düzenli olarak, örneğin değiştirmek mümkündür farklı tampon koşullarda test etmek için. Alexa 555 boyalar tüketmek için 488 lazer çizgi kullanarak yalnızca 561 lazer güç (100 mW lazer ile) sınırlı olduğunda gereklidir.</li>
</ol>7. resim yeniden yapılanma (5 dk)
<ol><li>PAL-Drift Aracı'nda, 8 en fazla olacak boyutunu ile otomatik parçalarla modeli tabanlı düzeltme türünü kullanın. Drift düzeltilene kadar Uygula birkaç kez üst üste basın. Bu modeli tabanlı düzeltme drift düzeltir çapraz korelasyon analizi üzerinde alan bir algoritma uygular.</li>
	<li>PAL-filtresi araçlarını kullanarak, fırtına görüntünün görünümünü hangi en iyi lokalize molekülleri seçerek geliştirin. Örneğin, 30 Yerelleştirme kesinlik sınırı nm ve 120-180 nm için PSF.</li>
	<li>Piksel çözünürlüğe sahip 5 veya 10 nm PAL-render aracın yanı sıra bir Gauss görüntüleme modu, bir genişleme faktörü 1 seçin PSF Render auto dinamik alan HR %95 değeri ve Render auto dinamik alan SWF %90 değeri ile kullanın. Render en iyi Kalite'yi seçtiğinizde.</li>
	<li>PALM dönüştürmek, işleme sekmesi (son işlem modu) PALM menüsünden seçin. Seçin ve ardından Uygulatuşuna basın. Oluşturulan görüntü ile bir biçimde kaydedin. LSM (ve değil .czi, çok önemli). Not: Görüntü yeniden hemen satın alma veya sonraki satın alma yazılımı görüntü işleme modunu kullanarak sonra gerçekleştirilebilir. İşlem modu sonrası kapalı hattında yığınlar parametreleri (en yüksek maskesi boyutu, gürültü en yüksek yoğunluk) farklı değerlerle yeniden Çözümle mümkündür. Her zaman "örtüşen molekülleri atmak" ve "yerelleştirme önce ortalama değil" seçin.</li>
</ol>8. bir fırtına görüntü (10 dakika) yerelleştirme duyarlığını tahmini
<ol><li>Fırtına ham veri açın ve görüntü işleme sekmesini PALM yöntem ve sonra PALM tekrar kullanın. Seçtuşuna basın.</li>
	<li>9 ve 6 (veya görüntü için seçtiğiniz parametreleri) gürültü için en yüksek yoğunluk en yüksek maskesi boyutunu kullanarak yeniden başlatmak için Uygula tuşuna basın.</li>
	<li>Dikdörtgen grafik aracını seçin ve raw görüntü tek bir molekül cam yüzeyinde mevcut çevresinde bir dikdörtgen çizin. Genellikle bir kaç tek molekülleri orada vardır.</li>
	<li>Basın Uygula tekrar ve yalnızca dikdörtgen bölgesini içine mevcut molekülleri incelenecek.</li>
	<li>PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafik ve çubuk grafik kaynak: X pozisyon ya da pozisyon histogramlar görselleştirmek için Y konumu.</li>
	<li>Görüntüleri aşağıda solda yerelleştirmeler listesi ile tabloyu kaydedin.</li>
	<li>Veri analizi, bir yazılım kullanarak oluşturmak histogramlar x ve Y konumları (şekil 1 d).</li>
	<li>Dağıtımları bir Gauss tarafından uygun ve σX ve σY değerlerini kaydedin. Yerelleştirme hassas σSMLM (σX *σ tarafındanY) tahmini ^ 0,5.</li>
	<li>Mümkün olduğunca çok sayıda molekülleri üzerinde 8.3-8.8 adımı yineleyin ve σSMLM ortalama
</li>
</ol>9. kanal kayıt (5 dk)
<ol><li>Fiji (görüntü J) yazılımını kullanarak her renkte fırtına görüntüyü açın.</li>
	<li>Her tetraspeck boncuk konumlarını ölçmek için Değnek aracını seçin.</li>
	<li>Her boncuk X ve Y tıklatınÇağrı hesaplamak ve onları ortalama.</li>
	<li>İkinci görüntü ile hesaplanan çevirmek için "Tercüme" komutunu kullanın X ve Y vardiya.</li>
	<li>Kanalları Birleştir komutunu kullanarak iki resim birleştirme.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herrmann, H., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+Filaments:+Structure+and+Assembly.">Intermediate Filaments: Structure and Assembly.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).</li><li>Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+crosstalk:+when+three+different+personalities+team+up.">Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).</li><li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+in+cell+migration+and+invasion:+the+unusual+suspects.">Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Gevaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prize+in+Chemistry:+seeing+the+nanoscale.">Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale.</a> Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+samples+for+optimizing+STORM+super-resolution+microscopy.">Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Dempsey, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+localization-based+super-resolution+fluorescence+imaging.">A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+neuronal+microtubule+organization+and+microtubule-associated+proteins+using+single+molecule+localization+microscopy.">Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy.</a> Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).</li><li>Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy.">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li><li>Eliasson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filament+protein+partnership+in+astrocytes.">Intermediate filament protein partnership in astrocytes.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).</li><li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microtubule-associated+motors+drives+intermediate+filament+network+polarization.">Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization.</a> J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+Intermediate+Filaments+Template+Microtubule+Networks+to+Enhance+Persistence+in+Cell+Polarity+and+Directed+Migration.">Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration.</a> Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).</li><li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-Orientation:+Quantifying+Simultaneous+Co-Localization+and+Orientational+Alignment+of+Filaments+in+Light+Microscopy.">Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy.</a> PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).</li><li>Yang, Z., Wang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+from+intermediate+filament+assembly+and+gliosis+to+neurobiomarker.">Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker.</a> Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).</li><li>Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symptomatic+spinal+metastases+of+intracranial+glioblastoma:+clinical+characteristics+and+pathomechanism+relating+to+GFAP+expression.">Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression.</a> J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).</li><li>Hol, E. M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+and+the+astrocyte+intermediate+filament+system+in+diseases+of+the+central+nervous+system.">Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytoma+grade+IV+(glioblastoma+multiforme)+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins.">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li><li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment.">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li><li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy:+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters.">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924 (2015).</li><li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers.">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy.">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933 (2015).</li><li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy.">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

İletişim kuralı kritik adımlar
Burada hangi mikrotübüller dSTORM görüntülerini eserleri ve IFS gliyal hücreler içinde en aza indirgemek bir iletişim kuralı mevcut. Eserler numune hazırlama ve görüntüleme her adımda oluşturulan: engelleme, fiksasyon, immunolabeling, drift satın alma sırasında uygun olmayan yanıp sönen koşulları23. Biz en kritik adımları listelenmektedir.
Coverslips temizlik fluoroph...

Sitoplazmik ara filamentler (IFS) 10 nm-çapı homo - ya da eğer proteinlerin hücre türü belirli alt heteropolymers vardır. IFS çok sayıda hücre hareketliliği, yayılmasını önleme ve stres yanıt gibi hücresel işlevler katılmak. Onların önemli rol ile 90'dan fazla insan hastalıkları doğrudan Eğer proteinlerde mutasyonlar neden aslında vurgulanır; Örneğin, eğer bileşiminde değişiklikler tümör büyüme ve1,2,3yayılan eşlik eder. İşbirliği-e doğru kontrol hücresel fonksiyonları hücre polarizasyon, bölünme ve geçiş2,3gibi üç sitoiskeleti sistemi çalışmalarında kanıt orada büyüyor. Kayma mimarisi ve işlevler arasında sıkı bir bağlantı olduğundan, bu anlayışı ile diğer filamentler Eğer yapısal organizasyonu içine alın ve hücre iskeleti çapraz-hadis daha iyi anlamak çok önemlidir. Bu makalede süper çözünürlük tekniği çift renkli dSTORM (doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu)4 ve arasındaki etkileşimi araştırmak için nasıl kullanıldığına ve mikrotübüller gerçekleştirmek için bir protokol sağlar sabit, kültürlü hücreler 2 boyutlu (2D).
Geçtiğimiz birkaç süper çözümleme teknikleri geliştirilmiştir on yıl ve orada keşifler Nobel Kimya Ödülü kökeni 20145idi. Tüm bu tekniklerin arasında tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri kullanan photoswitchable floresan proteinler, PALM gibi6 (Photo-Activated yerelleştirme mikroskobu) fırtına7 fluorophores veya dSTORM4 çift ile yatıyor geleneksel fluorophores ile. Tüm bu yöntemler (i) anahtarı floresan gazetecilere çoğunun "kapalı" bir duruma oluşan aynı ilkeye dayanır"(non-floresan), (II) bir alt kümesini bir floresan içine Stokastik aktivasyonu devlet yerelleştirmek için onların uzamsal konumu nanometre doğruluk ve (III) fluorophores mümkün olduğunca çok sayıda alt kümeleri etkinleştirmek için bu işlem tekrarı. Son görüntü etkin moleküllerin ~ 20-40 yanal çözünürlük sağlayan tüm yerelleştirmeler kullanarak yeniden düzenlenir nm. Birkaç ticari optik sistemleri PALM/fırtına izin şimdi biyologlar rutin deneyler için kullanılabilir. Burada, böyle bir sistem mikrotübüller ve IFS yapısal Derneği Eğitim için kullanıldı. Çok ince lamel bölgeleri gözlemlemek için de uygundur çünkü tüm tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri arasında çift renkli dSTORM tekniği, seçildi (< 1 µm) yapisan hücre ve görüntü çözünürlüğü ile önemli gelişme sağlayabilir en az zaman ve para yatırım. Gerçekten de, dSTORM hücresel boyama ve ayirt için rutin olarak kullanılan standart organik Boyar maddeler ile uyumlu bir çok uygun ve çok yönlü bir tekniktir.
Bir renk dSTORM görüntüleri fluorophore Alexa6478kullanarak elde etmek nispeten basit olmakla birlikte, özellikle ne zaman var sınırlı iki boya düzgün seçilmiş arabellekte yanıp böylece deneysel koşullar optimize etmek için çift renk dSTORM gerektirir lazer güç. Mükemmel kağıtları zaten yöntemlerde çok renkli görüntüleme dSTORM9,10,11,12,13ile ayarlamak için kullanılabilir ve bu belgeleri açıklamak içinde ayrıntı olası kaynakları eser ve bozulmuş görüntü çözünürlüğü yanı sıra nasıl bunların üstesinden. Bu makalede, en iyi deneysel koşullar açısından hücreleri fiksasyon, immunostaining, numune hazırlama, görüntüleme edinme ve görüntü yeniden yapılanma yoğun sitoplazmik Eğer ağlar ve mikrotübüller içinde görüntüleri elde etmek için açıklanmıştır Çift renkli dSTORM gliyal hücrelerle. Kısaca, Chazeau ve ark12 ' açıklanan çıkarma/fiksasyon yöntemi gliyal hücreler için adapte oldu ve sonrası fiksasyon adım ile en iyi duruma getirilmiş antikorlar konsantrasyon kullanılan, 10 mM ile bir fırtına tampon MEA Dempsey9 oldu vd. tarif örnek türü ve deneysel kurmak için en uygun bulunmuştur.
Gliyal hücreler esas olarak hızlı Eğer proteinlerin üç türü: vimentin, testin ve GFAP'nin (gliyal asidik fibrillary protein). Bu üç proteinler astrocytes14' te ortak polimerize gösterilmiştir. Biz daha önce yapılandırılmış süper çözünürlük aydınlatma mikroskobu (SR SIM) bu üç Eğer proteinler aynı tek Eğer filaman içinde bulunabilir ve bunlar gliyal hücreler 15dakika içinde benzer dağıtım ve dinamik görüntüler gösterdi. Üç Eğer proteinler arasındaki benzerlikleri nedeniyle vimentin boyama tüm Eğer ağ için muhabir olarak kullanıldı. DSTORM kullanarak, biz nasıl eğer form demetleri kırınım ile mümkün değildi mikrotübüller boyunca mikroskobu teknikleri15sınırlı gidermek başardı. Bu gözlemler vimentin IFS şablon mikrotübüller nasıl anlayabilirim ve hücre göç16sırasında bir polarizasyon ekseni bakım teşvik onların büyüme yörünge düzenleyen yardımcı olabilir. Süper çözünürlük fotoğraf anahtar bilgileri iki hücre iskeleti alt sistemlerin karşılıklı etkileşimi üzerinde sağlanan ve kayma Derneği ve hücre tipi belirli17olabilir yerel işlev arasındaki bağlantıyı bir anlayış getirdi. Genel olarak, iyi immunostaining koşulları yoğunluğu ve özgüllük açısından ulaşmış olması koşuluyla çift renkli dSTORM hücre iskeleti elemanları veya organelleri, diğer türleri arasında çapraz karışma eğitim için kullanılabilir. Bu teknik daha iyi astrogliosis sırasında ve glioblastoma sitoiskeleti değişiklikleri tanımlamak yararlı olacak, burada eğer proteinlerin deyimidir merkez sinir sisteminin en yaygın ve en kötü huylu tümör 18 değişmiş ,19,20,21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41090-028</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
			<td>cell culture 1/100e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>cell culture 1/100e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>cell culture 1/10e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td>11540486</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip 18 mm n&#176;1,5H</td>
			<td>Marienfield/Dominic dutsher</td>
			<td>900556</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (PFA) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>non ionic surfactant. Used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>sample passivation 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6630</td>
			<td>primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti alpha tubulin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MCA77G</td>
			<td>primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10635923</td>
			<td>secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10226162</td>
			<td>secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide magnetic chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine (MEA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30070</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td></td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (trizma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash-N-Dry&#160;coverslip rack</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z688568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-335-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intermediate filaments and microtubules with 2-dimensional direct stochastic optical reconstruction microscopy

Aktin microfilaments, mikrotübüller ve ara filamentler (Eğer), oluşan sitoiskeleti hücre şekil, polarizasyon ve motilite kontrol önemli bir rol oynar. Aktin ve Mikrotubul ağları organizasyonu kapsamlı eğitim gördü ama bu IFS değil henüz tam olarak karakterize edilir. IFS hücre sitoplazma uzanan bir ağda bir ortalama çapı 10 nm ve formu vardır. Onlar fiziksel olarak aktin ve mikrotübüller moleküler motorlar ve hücre iskeleti halkalı ile ilişkilidir. Bu sıkı ilişki çoğu hücre fonksiyonları için gerekli üç hücre iskeleti ağ koordine Yönetmeliği sağlamak düzenleyici mekanizmaları kalbinde olduğunu. Bu nedenle IFS yalnız ve aynı zamanda ağların her biri diğer hücre iskeleti ile birlikte görselleştirmek önemlidir. Ancak, eğer ağlar, birçok hücre türü, özellikle gliyal hücreler, içinde son derece yoğun çözünürlüğü standart floresan mikroskobu ile ulaşmak çok zor kılan (lateral Görüntü çözünürlüğünün ~ 250 nm). Doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (dSTORM) bir kazanç bir büyüklük yanal çözünürlük sağlayan bir tekniktir. İşte, lateral dSTORM çözünürlüğü yoğun organizasyon Eğer ağlar ve özellikle, eğer demetleri mikrotübüller çevreleyen gidermek için yeterli olduğunu göstermektedir. Böyle sıkı dernek bu iki ağ ve Mayıs koordine yönetmelikte katılmak, açıklamak olasıdır nasıl vimentin IFS şablon Mikrotubul organizasyon stabilize ve Mikrotubul bağımlı veziküler kaçakçılığı etkileyebilir. Daha genel olarak, biz nasıl iki hücre iskeleti bileşeni çift renkli dSTORM tekniği ile gözlenmesi karşılıklı etkileşimlerini içine yeni bir bakış açısı getiriyor gösterir.

Mikroskop 512 x 512 kamera, bir alfa planı Apo 100 X 50 mW 405 nm ve 100 mW 488, 561 ve 642 nm katı hal lazerleri, bir EMCCD ile donatılmış / 1,46 objektif ve grubu 570-650 Pass / uzun 655 emisyon filtreler geçiş temsilcisi sonuçları aşağıda sunulan için kullanıldı.
Şekil 1A raw resim alma sırasında kullanılması gereken gürültü oranı sinyal ve molekül yoğunluğu bir örnek ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy at JoVE.com

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için vermektir

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Görüntüleme.  Institut Pasteur. Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için vermektir

Video: Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...