Yazarlar teknik için cryo floresan örnek sahne, Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Changlu Tao ve Cheng Xu yapımı için Travis Wheeler ve Hücre Biyolojisi Bölümü&#39;nde makine atölyesi ve Fizyoloji, University of Pittsburgh teşekkür etmek istiyorum hizmetleri ve yazının eleştirel okuma Dr Teresa Brosenitsch. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM082251 &amp; GM085043) tarafından desteklenmiştir.

1. Karbon kaplı üzerinde HeLa Hücre Kültürü, Altın EM Bulucu Izgaralar <ol><li> Glow deşarj 25 saniye için 25 mA altında 200-örgü R2 / 2 Quantifoil altın EM bulucu ızgara karbon tarafı. </li><li> Coat 50 mg / ml fibronektin çözümün bir 40 ul damlacık üzerine, aşağı, karbon-yan yüzen fibronektin ile EM ızgara, daha sonra bir doku kültürü kaputu 2 saat UV ışığı altında dezenfekte edin. </li><li> Plaka HeLa bir cam alt kültürü çanağı içinde 2 x 10 4 hücre / ml (toplam 2 ml kültür) bir yoğunlukta ızgara üzerine hücreleri ve DMEM içinde,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de hücrelerin büyümesi 4.5 ile takviye edilmiş yaklaşık 18 saat boyunca g / L L-glutamin ve glikoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin,. HeLa hücreleri O / N kültürden sonra enfekte edilir. </li></ol> 2. HIV-1 enfeksiyonu ve Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> Cam-alt kültür bir floresan hücre izci (Kırmızı CMTPX, 1 ul / 2 ml) EkleÇanak (adım 1.3) ve floresan boya kadar almak izin vermek için, 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe çanak. </li><li> Hücreler PBS ile yıkanır ve 50 ul önceden ısıtılmış taze ortam ilave edin. </li><li> 37 ° C, bir Tebeşir Alan Konfokal tarayıcı mikroskop de, canlı-hücre odası üzerine çanak yerleştirin. Onlar cryoEM yana en yayılma-out ve düz (Şekil 2c ve 2d bakınız), zaman nispeten ince bölgeleri gerektirir iki mitoz faz arasındaki hücreleri ile 1-3 hücre / kare içeren birden çok alan (10-15 pozisyonları), seçin örnek. Gelecekte görüntüleme (adım 2.5) için bu pozisyonları saklayın. </li><li> (Biz p24 40 ng / ml içeren bir numunenin 40 ul kullanın) GFP VPR içeren VSV-G sözde yazılmış HIV-1 parçacıkları ile hücreleri enfekte. Görüntüleme için pozisyon seçili ve saklanan beri çanak alt içine virüs parçacıkları eklerken, EM ızgara rahatsız değil dikkatli olun. </li><li> Hemen virionlar eklenmesinden sonra, Ti toplamak20-40 dakika önce seçilen pozisyonlarda yüksek hızlı 3D konfokal görüntüleri, (adım 2.3 &#39;e) me-sukut. </li><li> Konfokal görüntüleri MetaMorph kullanılarak elde ve Imaris yazılım (Bakınız Şekil 1) kullanarak tek parçacık dinamiği için otomatik 3D parçacık izleme ile analiz edildi. Biz kırınım-sınırlı dinamik davranışı arasında ilişki olduğu için HIV-1 hücresel ince yapı, zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme ve 3D parçacık izleme ile parçacıklar sonuçları için önemlidir. Ancak, büyük ve statik yapısı için, basit bir floresan görüntü (canlı hücre olmadan) karşılıklı analiz için yeterli olacaktır. </li></ol> 3. Dondurulmuş-sulu EM Numune Hazırlama Son konfokal görüntü ve örnek cryo-fiksasyon toplanması arasındaki zaman gecikmesini en aza indirmek için, FEI Vitrobot (ya da diğer vitrifikasyon cihaz) floresan konfokal canlı hücre görüntüleri toplama sırasında başlatılan ve dalma-dondurma için hazırlanmalıdır.<ol><li> Vitrifikasyon cihazı açın ve 22 iklim sıcaklığını ayarlamak ° C,% 100 hedef nem, 7 saniye için kurutma süresi ve bekleme ve 1 sn zaman boşaltın. </li><li> Piston Dewar içinde ızgara saklama kutusu yerleştirin ve soğuk sıvı etan hazırlamak. Vitrifikasyon cihaz üzerine Dewar monte edin. </li><li> Hemen konfokal canlı hücre görüntüleme (bölüm 2) sonra, bir buz soğutmalı bakır blok üzerine kültür çanak yerleştirin ve cryoEM numune hazırlama odasına aktarın. Özel cımbız üzerine EM ızgara yüklemek ve hızlı bir şekilde ızgara üzerinde herhangi bir medya uzak kurulayın. Kurutma 0.2 mikron floresan mikroküreler hemen ızgara yerleştirilir ile 15 nm altın boncuk çözüm 4 ul karışık sonra, filtre kağıdı ile, elle yapılır. Altın boncuklar tomografi veri toplama ve hizalama yardım etmek için indirgeme marker olarak kullanılmaktadır. Floresan mikroküreler (Şekil 2c-2f bakınız) floresan ve cryoEM görüntüler arasında korelasyon yardım için kullanılır. </li><li> Vitrifikasyon cihaz üzerine cımbız yükleyin ve sıvı etan 16 dondurma leke ve atılmak için cihaz talimat. En iyi sonucu elde etmek için optimize kurutma parametreler şunlardır: leke zaman, 7 saniye, leke ofset, 0, drenaj süresi, 1 sn, sıcaklık, 22 ° C ve nem,% 100. </li><li> Daha sonra kullanmak için hemen cryoET görüntüleme için bir cryoEM tutucu, ya da bir sıvı azot depolama Dewar dondurulmuş sulu ızgara aktarın. </li></ol> 4. Cryo-floresan Işık Mikroskopi Bir ev yapımı, cryo-floresan örnek odası ve sahne sistemi (Şekil 3) adımları 4,1-4,10 yürütmek için gereklidir. Sahnenin ayrıntılı özellikleri ve açıklama Haziran ve ark. 15. bulunabilir. <ol><li> En az 2 saat cryo-floresan ışık mikroskobu (Şekil 3a bak) başlamadan önce sıvı azot ile kendinden basınçlı sıvı nitrojen Dewar doldurun. </li><li> Bir homebuilt cryo-f monteBöyle bir Olympus IX 71 olarak ters bir floresan ışık mikroskobu, üzerine luorescence örnek sahne 15 (Şekil 3). </li><li> Kendini basınçlı Dewar için cryo-örnek sahne sıvı azot girişi bağlayın ve uygun bir kabın içine sıvı azot taşma koruması çıkışı yerleştirin. Objektif sıcak ve don serbest tutmak için objektif lens üzerine yerleştirilen bir kol için kuru azot gazı hattı bağlayın. </li><li> Dondurulmuş sulu örnek ızgara yüklemek için cryo aşamalı odasına bir bakır blok platformu (Şekil 3b siyah ok) yerleştirin. Soğumasını ve öz-basınçlı dolum Dewar gelen giriş hattı üzerinden sıvı nitrojen ile cryo-sahne bakır odası doldurun. </li><li> Cryo aşamalı sıvı azot sıcaklığında (~ 4-6 dakika içinde) ulaştığında, cryo aşamalı için ızgara saklama kutusu (adım 3.5 dan itibaren) aktarın. </li><li> Bakır blok EM numune kartuş içine donmuş-sulu örnek ızgara yerleştirin ve g klibiC-ring kullanılarak yerinde kurtulmak, ya da üstüne bir önceden soğutulmuş bakır halka (Şekil 3d siyah ok) yerleştirin, ızgara kolay erişim için de bir yerde ızgara tutmak ve sonra (bir Polara mikroskop kartuş kullanıyorsanız) Cryo-floresan görüntüleme (olmayan bir Polara cryo-elektron mikroskobu için ise). </li><li> Kriyo-aşamada (Şekil 3b&#39;de beyaz ok başı) iç bölmesi içinde kartuşu (adım 4,6) yerleştirin. </li><li> Arama ve canlı hücre görüntüleme verilerden aynı virüs parçacıkları bulmak. EM ızgara bir dizin olduğundan, canlı hücre görüntüleri ve cryo-floresans görüntüler hem de ızgara üzerinde aynı parçacık tespit etmek için basittir. </li><li> Uzun çalışma (2,7-4 mm) objektif lens ile bir ışık mikroskobu kullanarak cryo-koşul altında belirlenen pozisyonlarda cryo-DIC ve GFP görüntüler elde. Cryo floresan görüntüleme sırasında, periyodik olarak, cryo aşamalı ve dolum içinde sıvı azot seviyesini kontrol gerektiği gibi, -170 aşağıdaki örnek sahne tutmak için° C </li><li> Kriyo-floresan görüntüleme tamamlanmasından sonra, dikkatli bir şekilde, bakır blok platformuna örnek kartuşu dönmek ve Polara sistemi ile gelecekteki cryoET analizi için bir sıvı azot Dewar kartuşunu. Olmayan bir Polara cryo-elektron mikroskobu kullanıyorsanız, bakır halka kaldırmak için örnek ızgara almak, bir ızgara saklama kutusu yerleştirin ve numune cryoET tarafından incelenir kadar sıvı azot Dewar içinde numune saklayın. </li><li> Veri analizi için, satın cryo-DIC ve GFP görüntüleri üst üste (adım 4,9, Şekil 4b) ve canlı hücre görüntüleme serisi elde edilen ile cryo floresan görüntü GFP sinyallerin pozisyonları ilişkilidir. </li></ol> 5. Cryo-elektron Tomografi <ol><li> Bu Polara G2 mikroskop gibi bir alan emisyon silah ile donatılmış bir elektron mikroskop cryo-aktarma istasyonuna örnek kartuşu yükleyin. </li><li> 140X, ide bir büyütme altında düşük doz-arama moduntify ve bir sahne dosyasına ilgili ızgara kareler (adım 4.11 &#39;dan itibaren) kaydedin. </li><li> 3.500 X bir büyütmede düşük doz-arama modu altında, bir 100 mikron objektif diyafram, arama eklemek ve bir ikinci aşama dosyaya GFP sinyalleri ile ilişkili tüm pozisyonları kaydedin. </li><li> Önemsiz bir karbon bölgedeki buz uzak yakarak, sahne y işlevini kullanarak, / Å 2 ve eğim ekseni rafine - düşük doz-pozlama modu altında, 1 veya 2 e bir doz ışın yoğunluğunu ayarlamak için boş bir alan bulmak birkaç altın boncuk ile. </li><li> Düşük doz-odak modu altında, ~ 3 mikron olarak odak mesafesini ayarlamak ve eğim eksenine paralel olarak odak yönünü hizalamak için açısını ayarlayın. </li><li> Düşük doz-arama modu altında, (adım 5.3) kayıtlı pozisyonları hatırlamak, örnek eucentric yüksekliğini ayarlayın ve ilgi alanı için eğim aralığı kontrol edin. Expos de, 8 ile 10 mikron bulanıklaştırma az - çok düşük elektron doz (/ Å 2 ~ 1 e) ile bir projeksiyon görüntü eldekriyo-elektron tomografi için ilişkili virüs parçacıkları onaylamak için ure modu,. </li><li> Düşük doz odak moduna geçin. TEM otomatik fonksiyonları menüsünde, otomatik eucentric yüksekliği öncesinde ve odak alanı fonksiyonları odaklanmak. </li><li> Bir eğim serisi elde etmek için parametreleri ayarlayın. / Å 2 toplam doz - Bu yazıda Şekil 4 için, eğim açıları, sırasıyla, 3 ° ve 2 ° eğim artışlarla, °, altında ve üstünde 45 ° ± 70 arasında değişen 6 mikron bulanıklaştırma ve yaklaşık 70 e, kullanılmıştır. </li><li> Tüm kayıtlı pozisyonlar için adımları 5.7 ve 5.8 tekrarlayın. Toplu tomografi yazılım iş verimini arttırmak için çoklu pozisyonlarda otomatik veri toplama için kullanılabilir. </li></ol> 6. IMOD 17 kullanarak üç boyutlu İmar <ol><li> Minimum ve maksimum yoğunluk değerleri ayarlayın ve büyük görüntü değişimine bağlı olarak dışlanacak herhangi bir görünümü var olup olmadığını belirlemek için ham tilt serisi kontrol edin. </li><li> ETomo ve Eksen tipi, piksel boyutu, konvansiyonel indirgeme çapı, vb kullanarak kurulum tomografisinde paneli başlatın. Sonra com komut dosyaları oluşturabilirsiniz. </li><li> Tomografisinde hesaplama birkaç aşamada ayarlanabilir / eş zamanlı olarak takip edilebilir şekilde ana pencere yapılandırın. Gerekli parametreleri değiştirin ve her işlem adım (eTomo öğretici bak, gerekli olan özel programlar yürütmek <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> Son aşamada, tam uyumlu yığını oluşturmak (0.6 daha az bir ortalama kalıntı hata ile) ve IMOD bir ağırlıklı arka projeksiyon algoritması kullanılarak tomografi yeniden. </li><li> Kontrast ve netlik geliştirmek için uygun parametrelerle IMOD uygulanan bir 3D doğrusal olmayan anizotropik difüzyon kenar geliştirme programını kullanarak ilgi potansiyel alanları Denoise. </li></ol>

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarının beyan ederim.

Biz cryoET takip zaman atlamalı konfokal, canlı hücre floresan görüntüleme kullanarak dinamik hücresel olayları analiz etmek için gelişmiş bir karşılıklı bir yaklaşım sağlamak için protokoller basit bir dizi sundu. Yüksek çözünürlüklü cryoET ile 3D canlı hücre görüntüleme ilişkilendirmek için metodolojik geliştirme gibi ana hücreleri ile nadir, dinamik (, ​​daha önce statik rapor değil), ve kırınım sınırlı viral parçacıklar ve etkileşimleri görselleştirme gibi birçok ...

Cryo-elektron tomografi (cryoET) hücre ve dokuların üç boyutlu (3D) görselleştirme izin verir ve bir yakın-fizyolojik durum 1 moleküler çözünürlükte yerli organeller ve hücresel yapıların örgüt haline anlayışlar sağlayan güçlü bir görüntüleme tekniğidir. Ancak, radyasyon duyarlılığı ile birlikte lekesiz dondurulmuş sulu numune, en doğal düşük kontrast zor bir hücre içinde ilgi alanları bulmak ve daha sonra hedef alan zarar vermeden başarıyla eğim dizi performans için yapar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, ışık ve elektron mikroskopi birleştiren bir bağlaşık bir yaklaşım gereklidir. Floresan etiketleme tarafından vurgulanan özgü özellikleri tespit ve floresan ışık mikroskobu ile bulunan ve daha sonra koordinatları yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu yapısal veri toplama için elektron mikroskobu aktarılır edilir. Bu yöntem, bir korelâsyon hedef bulma yardımcıilgi Arıkan ele alınması. CryoEM (&lt;300 nm) numune kalınlığına sınırlama nedeniyle, şu anda, hücrenin, sadece çevre bölgelerinde CryoET ile 3 boyutlu yapısal analizi için uygundur. Ayrıca freze 9 vitreus 8 kesit veya kriyo-odaklı iyon demeti (FIB) tarafından dondurulmuş sulu örneklerin kalınlığı azaltmak bağıntılı görüntüleme yeteneği genişletmek olacaktır. Daha önce, bağıntılı yöntemler öncelikli olarak büyük statik ve yapıları için 10-13 cryoET veri toplama kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Bu çalışmalarda, cryo-aşamaları cryoEM ızgaraları kabul ve dik bir mikroskop ya da ters bir mikroskop 10,11,14 ya sığacak şekilde uygulanmıştır. Izgaraları geçiş kendi tasarımları oldukça basit görünse de, EM ızgara için ilgili adımları transfer ızgara, deforme hasar ve kontamine olabilir şansı artan ek vardır. Biz son zamanlarda bir teknik ilerleme gösterdibize doğrudan enfeksiyon 15 erken aşamalarında, HIV-1 ve konak hücre etkileşimleri olarak yakalamak için doğası gereği zordur dinamik olaylar, görüntülemenizi sağlar bağıntılı mikroskobu. Böylece korelasyon kolaylaştırmak, ızgara kullanım nedeniyle örnek hasarı en aza indirmek için bir kartuş sistemi adapte bir cryo-ışık mikroskobu örnek sahne tasarımı ve uygulayarak bu başarılı. Tasarım her iki kriyo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu böylece karşılıklı süreç düzene, örnek transferi olmadan, aynı numune tutucu üzerine, sırayla, yapılacak sağlayan, entegre örnek kartuş tutucu içerir. Buna ek olarak, aynı zamanda indirgeme belirteçleri olarak floresan lateks boncukları kullanılarak doğru ve güvenilir bir korelasyon işlemi uygulanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Cryo-elektron tomografi (cryoET) yakın-to-fizyolojik durumu 1 moleküler çözünürlükte hücresel yapıların 3 boyutlu görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, cryoET ile ev sahibi hücresel ortamda ayrı ayrı virütik kompleksleri, doğrudan görselleştirme özellikle HIV-1 durumunda, viral giriş seyrek ve dinamik yapısı nedeniyle, 2 zordur. Zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme HIV-1 3-7 yaşam döngüsü birçok yönleri hakkında bilgi büyük bir vermiştir ise, çözünürlük canlı hücre mikroskobu sağladığı (~ 200 nm) sınırlıdır. Çalışmalarımız, canlı hücre floresan ışık mikroskobu birleştirerek cryo-floresan mikroskop ve cryoET tarafından HIV-1 enfeksiyonu erken olayların doğrudan görselleştirme izin veren bir korelasyon yöntemi geliştirmeyi amaçlıyordu. Bu şekilde, canlı hücre ve kriyo-floresan sinyalleri doğru cryoET içinde numuneleme yönlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, yapısal bilgi cryoET olabilir b eldedinamik fonksiyonel verileri ile tamamlanmaktadır E floresan etiketli hedef canlı-hücre görüntüleme ile kazandı. Bu video makalede, biz yapısal HIV-1 araştırılması ve 3D karşılıklı yüksek hızlı canlı hücre görüntüleme ve yüksek çözünürlüklü cryoET yapısal analizi ile konak-hücre etkileşimleri için detaylı yöntem ve protokolleri sağlar. HIV-1 ile enfekte olmuş partiküller HeLa hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi ile ilk olarak karakterize edilmiştir, ve aynı viral partikül içeren bölgesi, daha sonra 3 boyutlu yapısal detayları için kriyo-elektron tomografi ile analiz edilmiştir. Görüntüleme verileri, optik görüntüleme ve elektron görüntüleme, iki takım arasındaki ilişki bir ev yapımı cryo-floresan ışık mikroskobu sahne kullanılarak elde edilmiştir. Burada ayrıntılı yaklaşım virüs-konak hücre etkileşimleri çalışma için değil, aynı zamanda hücre sinyal, membran reseptör ticareti gibi hücre biyolojisi daha geniş uygulamaları, ve diğer birçok dinamik hücresel süreçleri için değil sadece, değerli olacaktır. &lt;/ P&gt;

Virüs partiküllerinin dinamik davranışını karakterize etmek için, HIV-1 ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde yüksek hızlı canlı hücre konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir ve partikül hareketleri (Şekil 1) otomatik 3 parçacık izleme ile analiz edilmiştir. Son konfokal canlı hücre görüntü toplama ve dalma-dondurma (ki yeterince ilişkili HIV-1 parçacıkların kaybetmek olabilir), bir cryo-floresan ışık mikroskobu aşamada (Şekil 3 arasında oluşabilir ...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions at JoVE.com

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Medicine. Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Video: Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Biyomühendislik

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Sinirsel implantları yumuşatma davranışını tahmin etmek için çevre dinamik mekanik analiz

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...