Yu C. Liu Tlp3-yakın üretim üzerine erken çalışmaları için teşekkür ediyoruz. Mayra A. Machuca Paraguay Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS doktora burs için borçlu.

1. ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın
<ol><li>150 mL steril Luria-Bertani (LB) suyu 50 µg mL-1 Ampisilin ile BL21-kodon-Plus (DE3) içeren aşılamak - RIPL hücreleri ile ifade onun6pET151/D-TOPO vektör dönüşüm - Tlp3-yakın (amino asit kalıntıları 42-291), ve Bu bir shaker (yörünge çapı, 25 mm) 37 ° C'de 200 d / gecede kuluçkaya.</li>
	<li>800 mL steril LB suyu ve 50 µg mL-1 Ampisilin içeren altı 2 L Erlenmeyer şişe hazırlayın. Her şişesi 20 mL adım 1.1 den elde edilen gecede kültür ile aşılamak. Onları 37 ° C'de sürekli 200 devir / dakikada 600 nm ulaşır 0.6, optik yoğunluk kadar sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL şişe (uninduced denetimi örneğini), bir benchtop santrifüj (13.000 x g, 4 ° C, 10 dk) kullanarak Pelet birinden aliquot almak ve süpernatant atın. Bakteriyel Pelet sonraki SDS-sayfa analizi için-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Protein ifade her şişeyi kültürü ile 1 mM lik izopropil β-D-thiogalactoside (IPTG) ekleyerek teşvik. Şişeler için bir ek 4 h 200 devirde bir shaker 37 ° C'de kuluçka devam edin.</li>
	<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 5000 x g 4 ° C'de 15 dakika, hasat ve süpernatant atın. Not: Bu noktada,-80 ° C dondurucu depolama içine hücre Pelet yerleştirerek yordamı duraklatılmış.</li>
</ol>2. izolasyon ve denatürasyon dahil organlarının
<ol><li>250 mL kabı 1.5. adımda elde edilen tüm hücre topakları nakletmek ve 100 mL (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl) arabelleği A eklemek. Eğer tamamen (dondurulmuş) çözülme hücrelere izin ve Pelet resuspend. Örnek buz üzerinde aksi belirtilmedikçe tutun.</li>
	<li>Yüksek basınç homogeniser ile resuspended hücreleri hücreleri parçalayıcı ve tam genomik DNA kesme emin olmak için üç kez geçmek.</li>
	<li>Lysate, 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi 1 mL örnek süpernatant (çözünür kesir) toplamak ve -20 ° c daha sonraki SDS-sayfa analiz için saklayın. Süpernatant geri kalanı atın ve Pelet Buza koyun. Not: Bu Pelet renk beyazdır (kahverengi gölgesinde olan kırılmamış hücrelerden ismi renkli) ve dahil organları içerir.</li>
	<li>Dahil organları Pelet buz gibi soğuk arabellek B iyice 20 mL resuspend (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM phenylmethanesulfonyl florür (PMSF), % 1 Triton X-100). Bu solubilisation membran ve membran proteinlerinin kolaylaştırır. Resuspension yardım etmek 1-2 min için girdap.</li>
	<li>Örneği ' 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Pelet buz gibi soğuk arabellek B iyice 20 mL vortexing 1-2 dk. Pelet küçük parçalara ayrılır sağlamak için tüp tarafından resuspend. Damlalıklı yukarı ve aşağı Pelet resuspension yardımcı olmak için örnek. Not: İyice organları eklenmesi kirleri ücretsiz almak için Pelet resuspend önemlidir.</li>
	<li>2.5 arasındaki adımları yineleyin. Süpernatant bulutlu veya renkli 2.6 ve (bu sırayla) 2.5 süpernatant kadar adımları yineleyin ise, açık ve renksiz.</li>
	<li>Vortexing 1-2 min için tüp tarafından Pelet buz gibi soğuk arabellek C 20 ml (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM PMSF) resuspend.</li>
	<li>2.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>25 dahil organları Pelet çözülmeye mL buz gibi denaturing arabellek D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M üre, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM PMSF) ekleyin. İyice vortexing kadar Pelet küçük parçalara ayrılır veya 1-2 min için tarafından resuspend.</li>
	<li>Mix süspansiyon tarafından 30-120 dk 4 ° C'de 30 RPM dönüş hızı ile eksenel dönme</li>
	<li>Santrifüjü 30.000 x g, 30 dk için 4 ° C de tarafından denatüre protein çözüm açıklamak, süpernatant Buza koyun ve Pelet atın.</li>
	<li>Bradford tahlil kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek. 24 SDS-jel analiz için bir aliquot alıp -20 ° C'de yerleştirin Not: Bu noktada, yordamı ek-bölünmemeli örnek sıvı azot donma tarafından durduruldu ve depolama için-80 ° C'de tutun.</li>
</ol>3. protein Refolding
<ol><li>250 mL arabelleği E (3 M üre, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.4 M L-Arginin monohydrochloride, 20 mM azaltılmış L-glutatyon, 2 mM oksitlenmiş L-glutatyon) 500 mL ölçek hazırlamak ve arabellek 4 ° c kadar serin</li>
	<li>Onun6içeren denatüre protein karışımı 60 mg eklemek-Tlp3-yakın 500 rpm'de arabellek karıştırarak arabellek E, 2.13-250 mL. adımda elde. Sürekli karıştırarak için 24-48 h 500 RPM ile 4 ° C'de mix refolding kuluçkaya. Bu adımda son protein konsantrasyonu 0.2 mg mL-1olduğunu.</li>
	<li>7 L 8-10 L kovası A arabellekte hazırlamak ve bir sonraki adım (Adım 3.4) için 24-48 h gerçekleşecek hazırlık 4 ° C aşağı soğumaya (akış çizelgesi Şekil1 bakınız).</li>
	<li>Bir ~ 50 cm adet diyaliz hortumunun 28 mm şişirilmiş çapının, molekül ağırlığı kesme, 12-14 kDa 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuzu (EDTA-Na2) 200 mL içine sokmak ve gaz alev üzerinde kaynar kadar ısı. Durulama diyaliz membran ile GKD2O. 200 mL</li>
	<li>Diyaliz boru kapatma ile diyaliz membran bir ucunu kelepçe ve 250 mL karışımı adım 3.2 diyaliz tüp içine elde refolding transfer. Açık ucu başka bir kelepçe ile kapatın. Sızıntı yok emin olmak için membran bütünlüğünü denetleyin.</li>
	<li>3.3. adımda hazırlanan tampon a önceden soğutulmuş 7 L ile diyaliz kovada diyaliz tüpü yerleştirin. Bar, karıştırma sırasında diyaliz boru dokunmayacaksın sağlanması manyetik bir heyecan yerleştirin.</li>
	<li>Örnek 4 ° C'de 500 rpm'de karıştırmaya devam ile dialyse ve arabellek en az dört kez bir süre 12 h içinde değiştirin. Son arabellek değiştirdikten sonra bir gecede dialyse örnek bırakın. Not: yavaş yavaş diyaliz sırasında üre (~ 3 M) fazlalığı sağlar refold protein denatüre protein eriyik--dan kaldırılır. Ağır protein yağış diyaliz sonunda görülebilmektedir.</li>
	<li>Ve 500 mL kabı içeriğini transfer diyaliz tüp kova çıkarın. Protein çözüm buz, aksi belirtilmedikçe tutun.</li>
	<li>Protein çözüm 0.43 µm gözenek boyutu membran aracılığıyla zarlarını protein var kaldırmak için 500 mL cam şişe içine filtre.</li>
</ol>4. arıtma onun6-Metal iyon hareketli benzeşme Kromatografi kullanarak Protein öğesini
<ol><li>
Ücret ve 5 mL prepacked şelat sütun equilibrate.
	<ol>
<li>Sütun bağlayan boru içinde hapsolmuş hava olduğunu kontrol ettikten bir Peristaltik pompa bağlayın.</li>
		<li>Sütun ile 25-50 mL GKD2O. geçirerek yıkama</li>
		<li>Sütun 3 mL 0.1 M NiCl2 yükleme ve sonra GKD2O. 25 mL şarj</li>
		<li>Sütun 25 mL (yükleme tampon, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole) arabelleği F ile equilibrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 3.9 arabellek F kompozisyon 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl ve 2 M imidazole hisse senedi çözümleri 2.5 mL 2.5 mL ekleyerek elde refolded protein örneği ayarlayın.</li>
	<li>Örnek hızı 5 mL/dak veya daha az ve atma akışı aracılığıyla sütuna (ilişkisiz proteinler) yükleyin.</li>
	<li>Sütun olmayan özellikle ilişkili proteinler kaldırmak ve akışı üzerinden atmak için arabellek F 50-100 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Onun6elute-Tlp3-25 mL (elüsyon arabellek, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole) arabelleği G ile yakın ve (Bradford reaktifi kullanılarak belirlenen) protein içeren akış yoluyla kesirler Havuzu.</li>
	<li>Bradford tahlil kullanarak havuza alınan örnek protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük bir aliquot SDS-sayfa analizi ve-20 ° C'de yer almak</li>
</ol>5. onun6-TEV proteaz (isteğe bağlı) kullanarak kaldırma etiketi
<ol><li>Hazırlamak ve aşağı 4 ° C, 4 L (TEV bölünme tampon, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 (v/v) gliserol, 2 mM DTT) arabelleği H serin.</li>
	<li>Yaklaşık 5-7 cm diyaliz Boru kesme (çapı 2-3 cm) ve 200 mL GKD2O. bırakın</li>
	<li>Onun6eklemek-TEV proteaz onun için öğesini6-etiket protein 1 TEV son molar oranı 4.5. adımda hazırlanan: 8 protein.</li>
	<li>Bir ucunu bir Diyaliz boru kapatma ile boru kelepçe ve protein/TEV proteaz karışımı ile doldurun. Diğer ucunu kapatın ve hiçbir sızıntı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Diyaliz öncesi soğutmalı 4 L arabelleği H (Kimden adım 5.1) içine tüp ve sürekli ile 4 ° C'de kuluçkaya yer 2 h. değişiklik arabellek karıştırma ve diyaliz gecede TEV-aracılı bölünme tepki tamamlamak izin vermek için devam edin.</li>
	<li>Bu arada, hazırlamak ve serin (4 ° C) 4 L arabellek ben (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %1 (v/v) gliserol) ertesi gün için hazırlık.</li>
	<li>Gecede diyaliz sonra 5.6 adımda hazırlanan tampon tampon Döviz ve başka bir 1-2 h 4 ° C'de dialyse</li>
	<li>Tüp bir ucunu Açıl ve protein çözüm bir 50 mL Falcon tüp transfer tüp diyaliz kova çıkarın. Çözüm 0.43 µm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre ve aksi belirtilmediği sürece buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Örnek hacmi ölçmek ve arabellek F kompozisyon Tris, NaCl ve imidazole konsantrasyon ayarlayın (örneğin protein çözüm arabelleği J 25 mL için eklemek 0.25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl ve 2 M imidazole 0.25 mL).</li>
	<li>5 mL HiTrap şelat HP sütun 4.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Örnek sütuna yük (akış oranı: 5 mL/dak) ve akış-etiketsiz Tlp3-yakın (artıkları 42-291) içeren aracılığıyla, toplamak. Uncleaved protein, i ciddi onun6-etiket ve onun6- TEV sütun tarafından korunur.</li>
	<li>Tüm etiketsiz protein akışı ve eluate toplamak izin vermek için sütun ile 5 mL arabellek F (yükleme arabellek) yıkayın.</li>
	<li>Havuz eluate 5,11 ve 5.12 adımlarda elde edilen ve protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük bir aliquot almak ve SDS-sayfa analizi için-20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>6. boyut-dışlama Kromatografi (jel filtrasyon) Tlp3-yakın
<ol><li>1 L (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) arabelleği A hazırlamak ve 0.43 µm membran kullanarak filtre uygulayabilirsiniz.</li>
	<li>Arabellek A 4 mL/dk akış hızında bir 26/60 boyutu-dışlama sütun equilibrate.</li>
	<li>3-4 mL 15 mL santrifüj yoğunlaştırıcı bir 10 kDa kesme ile (4 ° C, 4.000 x g) kullanarak bir birimi 5.13. adımda elde edilen protein örnek konsantre.</li>
	<li>Santrifüjü 13.000 x g, zarlarını protein var kaldırmak 30 dk için 4 ° C de tarafından protein çözüm açıklamak.</li>
	<li>Örnek önceden dengelenmiş 26/60 jel filtrasyon sütuna yerleştirin. Kromatografi arabellek A 4 mL/dak monitör UV izleme akış hızında gerçekleştirir. Tlp3-yakın 210-220 mL saklama ses seviyesinde elutes. Tepe kesirler havuz.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu ölçmek. Küçük SDS-sayfa analizi için aliquot al.</li>
</ol>7. SDS-sayfa analiz Protein arıtma çeşitli aşamalarında toplanan örnekleri
<ol><li>SDS-sayfa çalışan arabelleği (arabellek J) 1 L hazırlamak, 25 mM içeren Tris, 250 mM glisin pH 8.3 ve % 0.1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS).</li>
	<li>5 SDS-sayfa yükleme arabellek (arabellek K) x 10 mL hazırlamak, 0.25 M Tris-HCl pH 6.8 içeren, mavi (w/v) % 10 SDS, % 50 (v/v) gliserol, 1 mM DTT ve %0,05 bromophenol.</li>
	<li>İzin arıtma farklı adımları sırasında toplanan aliquots (adımlar 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6,6) çözülme.</li>
	<li>Her örnek için toplam protein 15 µg SDS-sayfa yükleme tampon ve 10 µL GKD2O. için ses seviyesini 5 x 2 µL ile karşılık gelen birim mix</li>
	<li>Örnekleri 5-10dk için 95 ° c ısı, onları 10.000 x g 30 s ve transferi de spin temiz bir tüp içine örnekleri.</li>
	<li>Jel ayıran % 15 polyacrylamide kullanarak bir SDS-sayfa jel hazırlamak (5 mL: 2.5 mL %30 (w/v) BIS-Akrilamid, 1.2 mL için 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1.2 mL GKD2O, 50 µL (w/v) SDS % 10, 50 µL % 20 (w/v) amonyum persülfat (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) ve % 5 polyacrylamide jel istifleme (2 mL: 340 µL % 30 (w/v) BIS-Akrilamid için 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL GKD2O, 20 µL %10 (w/v) SDS, 20 µL %20 (w/v) APS, 2 µL TEMED).</li>
	<li>Elektroforez cihazları monte ve SDS sayfa arabellek üreticisinin tavsiye başı olarak çalıştıran x 1 ile doldurun.</li>
	<li>Protein molekül ağırlığı marker ve 7,5 adımda hazırlanan örnekleri yükleyin. 25 sabit bir akım, Elektroforez gerçekleştirmek anne.</li>
	<li>Jel bir konteyner içine aktarmak ve GKD2O. eklemek 150 mL % 25 (v/v) isopropanol, % 10 (v/v) Asetik asit ve %0.03 (w/v) parlak mavi R-250 içeren çözüm boyama Coomassie mavi ile durulayın. Kapsayıcı bir yatay döndürme platform, oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Jel GKD2O ile durulayın ve %5 (v/v) metanol ve %7 (v/v) Asetik asit içeren destaining çözüm yerleştirin. Yatay döndürme platformu için 1 h kullanarak karıştırma sırasında destain.</li>
	<li>Jel görüntü ve analiz.</li>
</ol>8. dairesel Dichroism (CD) spektroskopi analiz ikincil yapısı refolded saf protein
<ol><li>0.5 - 1 mg diyaliz tüp içine adım 6,6 elde refolded protein aktarmak ve 5 4 ° C'ye precooled L L tamponunun (50 mM sodyum fosfat pH 7,4), içeren bir Diyaliz kova yere koyun Sürekli karıştırarak ile 4 ° C'de örnek dialyse ve en az 3-4 arabellek değişiklikleri gerçekleştirmek üzerinde 2-4 h gecede dialyse örnek ayrılmadan önce.</li>
	<li>Dialysed protein çözüm 10 kDa kesme santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak 0.06 mg mL-1 için konsantre.</li>
	<li>Santrifüjü 13.000 x g, 30 dk için 4 ° C de tarafından çözüm açıklamak.</li>
	<li>Örnek bir spectropolarimeter 20 nm min-1tarama oranı ile kullanarak 200-260 nm dalga boyu aralığı boyunca 25 ° c kadar UV CD spektrum kaydedin. Diyaliz arabellek boş bir denetim olarak kullanın. Nüsha kayıt tekrarlayın ve ortalama spektrum oluşturmak.</li>
	<li>İkincil yapı içeriğini hesaplamak CD deconvoluting tarafından25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk) DichroWeb CDSSTR programdan kullanarak spectra sever.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

İfade ve bakteriyel chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın dahil vücutlarından refolding için basit bir yordam sunulur. Saf protein hazırlanması içerir E. coli, arıtma ve solubilisation dahil organlarının evde beslenen hayvan-plazmid kodlu genin aşırı ifade denatüre protein ve onun arıtma ardışık benzeşimi tarafından refolding ve Boyut-dışlama Kromatografi adımları. Denatürasyon üre kolaylaştırdı ve seyreltme/diyaliz-aracılı refolding protokolündeki optimizasyonu hangi kez dahil or...

Kemotaksis ve motilite bakteri kolonizasyonu ve ana bilgisayar1,2,3işgali teşvik ederek Campylobacter jejuni patogenezinde önemli rol oynamaya gösterilmiştir. Kemotaksis kimyasal sinyalleri tarafından güdümlü olarak bakteri büyüme için en iyi bir ortam doğru taşımak izin verir. Bu işlem chemoreceptors olarak adlandırdığı proteinler veya dönüştürücü gibi proteinler (TIPS) kümesi tarafından tanınması hücre içi ve çevresel kimyasal ipuçları içerir. Çoğu chemoreceptors proteinler membran katıştırılmış bağlayıcı etki alanı (yakın), bir transmembran ve ikincisi olan sinyal iletimi sitozolik sinyalizasyon proteinler ile etkileşim bir sitoplazmik sinyal verme etki alanı, bir extracytoplasmic ligand ile vardır kamçılı motorlar4,5,6,7.
Onbir farklı chemoreceptors C. jejuni genom4,8' tespit edilmiştir. Bugüne kadar bu chemoreceptors yalnızca bazılarını tanımlanabilecek ve Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712ve13 Tlp11 ligand özgüllük bilinmektedir. Bu türler içinde kalan chemoreceptors ve çok sayıda chemoreceptors diğer bakterilerde doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde katlanmış ve son derece saf rekombinant chemoreceptor LBDs14, üretim tarafından kolaylaştırılabilir 15 , 16. ancak, girişimleri heterologously Escherichia coli bakteri chemoreceptors periplasmic LBDs sık sık ifade etmek için neden kendi dahil organları17,18,19 hedefleme . Yine de, bu olay kolay yalıtım ve kurtarma protein el kolaylaştırabilir. Burada, protein kurtarma dahil organları, refolding ve arıtma, C. jejuni chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın bir örnek olarak kullanarak bir yöntem sunulur. Çünkü, iki bileşenli histidin kinaz ve prokaryotlar20,21, chemoreceptors bol bol bulunan algılama etki alanlarının dCACHE aile20 Tlp3-yakın ait bu örnek seçildi 22 , 23.
Bu yaklaşım, pET151/D-TOPO vektör üzerinde alarak ifade inşa bir N-terminal onun6dahil etmek için dizayn edilmiştir-etiket bir tütün tarafından takip etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi, sonraki etiketi kaldırma19. E. coli, yalıtım ve dahil organları ve üre tükenmesi tarafından refolding protein solubilisation üre-aracılı protein overexpression protokolünü açıklar. Refolding, aşağıdaki örnekte benzeşimi Kromatografi, isteğe bağlı etiket kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile tarafından saf. Saf protein katlanmış durumunu dairesel dichroism spektroskopisi kullanılarak doğrulanır. Bu daha önce yeniden elde etmek ve farklı bir chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19yakın arındırmak için geliştirilen yöntem değiştirilmiş bir sürümü var. Şekil 1' de özetlenmiştir bu yordamı, saf, etiketsiz Tlp3-yakın bakteri kültürü, 1 litre başına 10-20 mg protein saflığı verimleri > SDS-sayfa tarafından tahmini olarak % 90'ı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Chemoreceptors ve yapısal çalışmaların ligand özgüllük moleküler temeli aydınlatma amaçlı doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde saf, katlanmış ligand bağlayıcı etki alanları miligram miktarda üretim tarafından kolaylaştırılabilir. Heterologously periplasmic ligand bağlayıcı etki bakteriyel chemoreceptors Escherichia coli (e.coli) sık sık ifade etmek için girişimleri kendi dahil bedenlere hedefleme neden. Burada, bir yöntem dahil organları, onun refolding ve arıtma periplasmic dCACHE ligand bağlayıcı etki Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3, örnek olarak kullanarak, protein kurtarma için sunulmaktadır. Yaklaşım ifade ilgi ile bir yarilabilir protein içerir onun6-etiketi, yalıtım ve dahil organlarının solubilisation üre-aracılı protein üre tükenmesi ve arıtma benzeşme Kromatografi ile refolding etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından takip. Dairesel dichroism spektroskopisi saf protein katlanmış durumunu doğrulamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı genellikle dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki alanından diğer bakteriyel chemoreceptors çözünür ve crystallisable miligram miktarda üretim için yararlıdır kanıtlanmıştır.

Rekombinant ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın protein ifade dahil organlarında sonuçlandı. Onun6yaklaşık 100 mg 1 l bakteri kültürü 2,13 adımda hesaplanan ifade verim yapıldı-Tlp3-yakın dahil gövdelerinde yatırılır. Burada açıklanan ve şekil 1' de, resimli protein yalıtım, solubilisation dahil organları, protein refolding ve arıtma, benzeşim Kromatografi, etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

method-for-efficient-refolding-purification-chemoreceptor-ligand

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.7K Görüntüleme.  Monash Biomedicine Discovery Institute. Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Video: Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Biyokimya

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In plants, freeze damage occurs when extracellular ice crystals grow, resulting in the rupture of plasma membranes and possible cell death. Adsorption of IBPs to ice crystals restricts further growth by a process known as ice-recrystallization inhibition (IRI), thereby reducing cellular damage. IBPs also demonstrate the ability to depress the freezing point of a solution below the equilibrium melting point, a property known as thermal hysteresis (TH) activity. These protective properties have raised interest in the identification of novel IBPs due to their potential use in industrial, medical and agricultural applications. This paper describes the identification of plant IBPs through 1) the induction and extraction of IBPs in plant tissue, 2) the screening of extracts for IRI activity, and 3) the isolation and purification of IBPs. Following the induction of IBPs by low temperature exposure, extracts are tested for IRI activity using a &#39;splat assay&#39;, which allows the observation of ice crystal growth using a standard light microscope. This assay requires a low protein concentration and generates results that are quickly obtained and easily interpreted, providing an initial screen for ice binding activity. IBPs can then be isolated from contaminating proteins by utilizing the property of IBPs to adsorb to ice, through a technique called &#39;ice-affinity purification&#39;. Using cell lysates collected from plant extracts, an ice hemisphere can be slowly grown on a brass probe. This incorporates IBPs into the crystalline structure of the polycrystalline ice. Requiring no a priori biochemical or structural knowledge of the IBP, this method allows for recovery of active protein. Ice-purified protein fractions can be used for downstream applications including the identification of peptide sequences by mass spectrometry and the biochemical analysis of native proteins.

This paper outlines the identification of ice-binding proteins from freeze-tolerant plants through the assessment of ice-recrystallization inhibition activity and subsequent isolation of native IBPs using ice-affinity purification.

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial parameter to compare different ligands, e.g., competitive inhibitors, protein isoforms and mutants, for their binding strength to a binding partner. Dissociation constants are determined by plotting concentrations of bound versus free ligand as binding curves. In contrast, titration curves, in which a signal that is proportional to the concentration of bound ligand is plotted against the total concentration of added ligand, are much easier to record. The signal can be detected spectroscopically and by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This is exemplified in a protocol for a titration ELISA that measures the binding of the snake venom-derived rhodocetin to its immobilized target domain of &#945;2&#946;1 integrin. Titration ELISAs are versatile and widely used. Any pair of interacting proteins can be used as immobilized receptor and soluble ligand, provided that both proteins are pure, and their concentrations are known. The difficulty so far has been to determine the dissociation constant from a titration curve. In this study, a mathematical function underlying titration curves is introduced. Without any error-prone graphical estimation of a saturation yield, this algorithm allows processing of the raw data (signal intensities at different concentrations of added ligand) directly by mathematical evaluation via non-linear regression. Thus, several titration curves can be recorded simultaneously and transformed into a set of characteristic parameters, among them the dissociation constant and the concentration of binding-active receptor, and they can be evaluated statistically. When combined with this algorithm, titration ELISAs gain the advantage of directly presenting the dissociation constant. Therefore, they may be used more efficiently in the future.

A detailed protocol to perform a titration ELISA is described. Moreover, a novel algorithm is presented to evaluate titration ELISAs and to obtain a dissociation constant of binding of a soluble ligand to a microtiter plate-immobilized receptor.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler