Jennifer Deke ve Urszula Zarzenska onların bilimsel destek için teşekkür ederiz. Bu eser mali bir kariyer Tümleştirme Grant (çiğ, PCIG14-GA-2013-63 0734) tarafından 7 çerçeve programı, Litvanya-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburg) hibe ve DFG hibe (DFG KE 856_6-1) Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen JK için verilmiştir.

1. örnekleme ve B. napus SAP'den phloem hazırlanması bitkiler 4,8,20
<ol><li>Örnekleme phloem sap için iyi sulanan 8-hafta-yaşlı kullanın B. napus polen contaminations önlemek için bu gösteri sadece ilk çiçekli bitkiler.</li>
	<li>Bir şırınga iğnesi kullanın (Ø 0.8 mm) ve punctate önümüzdeki birkaç kez kaynaklanıyor. Birkaç diğer önümüzdeki kaynaklanıyor ve yeterli phloem sap (şekil 2a) elde etmek için diğer bitkiler üzerinde yineleyin. Not: karmaşık analiz için phloem sap en az 600 µL ile başlatmak için önerilir. 4-5 bitkiler phloem sap 200 ila 700 µL arasında ortaya çıkarır.</li>
	<li>Filtre kağıdı ile yaralı sitelerden ilk damla yok etmek. Bu damlalar esas olarak yaralı doku çevreleyen yüksek oranda kirlenmiş malzeme içeren ve atılacak gerekiyor.</li>
	<li>Pipetting tarafından aşağıdaki damla toplamak ve toplanan çıktı önceden soğutulmuş konik 1,5 mL tepki tüp buz bir soğutma sistemi kullanarak-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Yok daha fazla damla oluşumu gözlemlenebilir ama 1 saat daha uzun kadar toplama devam. Bu yordamı, toplanan phloem sap önemli kaybı olmadan iki gün sonra tekrar edilebilir. Not: Toplanan phloem sap hemen kullanılabilir veya ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolanan. -80 ° C depolama için şok-tepki tüp sıvı azot kıpırdama.</li>
	<li>Phloem örnek yaklaşık 1/6inci santrifüj yoğunlaştırıcıları (MWCO) 10.000 Dalton (Da) kesilmiş bir molekül ağırlığı ile kullanarak ilk birim için konsantre. Konsantre örnek 4 ° C ve 20.000 x g toz parçacıkları kaldırmak en az 15 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Phloem sap toplama önemli bir protein kaybına yol açmaz.</li>
	<li>Daha sonraki karmaşık analiz için adım 3.1 ile devam edin.</li>
</ol>2. ters transkriptaz PCR (RT-PCR) 4,8,20 ile phloem sap saflık kontrolü
<ol><li>--Dan phloem su sıvı madde için standart bir RNA ayıklama yöntemini kullanan toplam RNA izole (örneğin TRIzol veya fenol kloroform çıkarma isopropanol yağış sulu faz ve adımları göre yıkama etanol tarafından takip üreticinin iletişim kuralı). Dikkat: Fenol kloroform zehirlidir. Uygun bireysel koruma araçları ile bir örtünün altında çalışır. Ayıklanan RNA etanol-80 ° C'de altı aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Dnaz ile sindirim tarafından DNA'ın kirlilik ben (1 u/µg) için 45 dk 37 ° C'de ve enzim için son bir konsantrasyon 5 mm EDTA ekleyerek devre dışı bırakın ve örnek için 10 dk. 75 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Saf RNA almak için arındırmak ve örnek bir arıtma adım (RNA Temizleme kitleri, üreticinin yönergelerine göre kullanarakörneğin ) tarafından konsantre ol.</li>
	<li>Ters transkriptaz PCR (RT-PCR) cDNA sentezi için 150 kullanarak cDNA sentez kiti ile gerçekleştirmek ng saf RNA'ın üretici tarafından açıklandığı gibi protokol. Not: CDNA-20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanır.</li>
	<li>CDNA 5 µL yuvası özel transkript yükseltmek ve özel Jel Elektroforez tarafından kontrol için üretici tarafından belirtildiği gibi standart bir PCR reaksiyon için şablon olarak kullanın. Phloem örnekleri saflığı örneğin rubisco küçük alt birimi, thioredoxin h ve polen kat protein (Şekil 1b, Tablo 1) için primerler kullanılarak onaylayın.</li>
</ol>3. mavi yerel sayfa 4,25,26,31
<ol><li>Ya kendi kendine döktü yerli degrade jelleri açıklandığı gibi başka bir yerde27 veya ticari Bis-Tris degrade jelleri kullanın.</li>
	<li>En az 20-30 µg yoğun protein örneği iyi jel üzerine başına triplicates yük.</li>
	<li>4 ° C ve 150 V jel çalışmasını Örnek 1/3rd jel (yaklaşık 20-30 dk, şekil 3a) geçti kadar koyu mavi katot tampon B ve anot tampon (Tablo 2) kullanarak. Not: Kuzey kurutma için bir tek jel lane, süre 3D sayfa ve kütle spektrometresi daha az bol protein konsantre olmaya en çok on jel şerit aynı gruptan birleştirmek için önerilen protein kompozisyon analizi için yeterlidir.</li>
	<li>Çalıştır duraklatmak ve ışık mavi katot ile Satım koyu mavi katot tampon B B/10 (Tablo 2) tampon ve Çalıştır devam. Mavi açık dışarı jel (ca. 120 ile 180 dk, şekil 3a) elute başladığında Çalıştır jel bitirmek. Not: Bitmiş mavi yerli jel en az bir hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama bantları diffüz yol açabilir ve kaçınılmalıdır. Koyu mavi arabellek B yeniden kullanılabilir.</li>
</ol>4. isteğe bağlı: Mavi yerel Kuzey kurutma 4 kullanarak RNA tespiti
<ol><li>Farklı bantları kesip veya tüm jel şeritli mavi yerli jel gelen kullanın onları yarı kuru 3,5 mA/cm2 60 dk için kurutma tarafından bir naylon membran transfer ve membran (şekil 4a) üzerinde bir kalem ile alt ve üst jel sınır işareti.</li>
	<li>Kurutma sonra membran DEPC tedavi su ile yıkayıp kurulayın arasında iki filtreyi bildiri.</li>
	<li>UV-zenginlikte membran ile 120.000 µJ/cm2 polietilenin gerçekleştirmek (85 Crosslinker Malzemeler tablokullanıyorsanız s).</li>
	<li>Membran hibridizasyon fırında (şekil 4a) 68 ° C'de 60 dk için hibridizasyon arabellek (ticari veya kendi kendine yapılan) 6 mL ile önceden melezlemek.</li>
	<li>Hibridizasyon arabellek 3'-biotinylated sondalar 4 µL içeren bir ek 1 mL ekleyin (100 nM).</li>
	<li>Membran ile probe gecede, 68 ° C fırında 37 ° C'ye soğutma kuluçkaya</li>
	<li>Membran unspecifically bağlı probları kaldırmak için oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC ve % 0.1 SDS içeren bir arabellek ile yıkayın. Dikkat: SDS tahrişleri neden olabilir. SDS ve çözümler içeren SDS ile çalışırken eldiven ve önlük giymek.</li>
	<li>3'-biotinylated sondalar tespiti membran örneğin Streptavidin-HRP-eşlenik ve luminol ile hassas bir chemiluminescent reaksiyon (şekil 4a) kaynaklanan bir horseradish peroksidaz (HRP) substrat olarak gerçekleştirin.</li>
</ol>5. ikinci Boyut: Tris-Tricine-üre sayfa 4,28
<ol><li>Mavi yerli jel tek grup tüketim. Paralel şerit karmaşık proteinleri (şekil 5) daha fazla konsantrasyon ulaşmak için çalıştırmak örnekleri grup birleştirin. Not: 4 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar tek tepki tüplerde eksize gruplarından saklanabilir</li>
	<li>% 12 Tris-Tricine-üre jel dökmek (kalınlığı 1 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)). 10 mL jel çözeltisi A ayıran jel (Tablo 2), için hazırlamak pour iki cam levha ve yerleşimi ile isopropanol arasında. Ve 4 mL jel ve 10 de tarak Ekle üzerine jel çözeltisi B (Tablo 2) yığın jel için transfer polimerizasyon tamamlandıktan sonra isopropanol çıkarın. Dikkat: Unpolymerized Akrilamid Nörotoksik olabilir ve TEMED Eğer inhale zararlıdır. Her zaman bireysel koruma araçları giymek ve bir başlık altında çalışma.</li>
	<li>Eksize jel bantları 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak ve SDS örnek arabellek için denge jel adet (şekil 5, Tablo 2) x 2 1 mL ekleyin.<ol>
<li>Örnekleri, oda sıcaklığında (95 ° C) bir Isıtma blok veya bir mikrodalga kaynar önce 10 min için kuluçkaya ve başka bir 15 dakika oda sıcaklığında tekrar örnekleri kuluçkaya.</li>
		<li>Aynı kompleks bir tek jel cebine temsil eden birkaç dengelenmiş jel adet yığını.</li>
		<li>Anot ve katot arabellekleri koşma vasıl 150 V 45-60 dk kullanarak Elektroforez gerçekleştirmek ve bütün jel lane tüketim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asidik arabellek (100 mM Tris, 100 mM Asetik asit) içinde 20 dk için kesme şerit kuluçkaya ve 125 mm Tris-HCl, pH 6.8 için başka bir 20 dk (şekil 5) equilibrate.</li>
</ol>6. üçüncü Boyut: SDS-sayfa 4,32
<ol><li>Jel Laemmli32 göre ayıran bir % 15 SDS dökün (kalınlığı: 1.5 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)) (Tablo 2) ve ince bir tabaka halinde % 4 jel yukarıdaki istifleme ekleyin. Dikkat: SDS, Akrilamid ve TEMED zehirli ve zararlı. Bir başlık altında iş ve kişisel koruyucu donanımları.</li>
	<li>Dengelenmiş jel lane SDS jel üzerine transfer ve jel bromophenol mavi (şekil 5) izleme ile desteklenmiş arabellek çalışan 1 x SDS % 0,5 (w/w) özel ile kaplayın.</li>
	<li>Arabellek önceden jel yükleme özel mikrodalga ile çalışan SDS kaynatın.</li>
	<li>Moleküler ağırlık tek bileşenlerinin tahmin etmek için bir protein marker çalıştırmak, özel katılaşmış kadar jel bir ucunda filtre kağıt yerleştirin veya genellikle IPG jeller için kullanılan özel bir tarak kullanın.</li>
	<li>Jel 150 V 60 dk ve leke için çalıştırılacak jel ile kolloidal Coomassie, gümüş leke veya herhangi bir diğer yöntemi daha sonraki kitle spektrometrik analiz için uygun boyama.</li>
	<li>Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma gibi kitle spektrometrik yaklaşımlar kullanarak görünür protein noktalar analiz zaman uçuş (MALDI-TOF) veya LC-MS/MS kütle spektrometresi. Not: Zaten olarak açıklanan33boyama kolloidal Coomassie kullanmak için önerilir. Bizim ellerde daha az bol protein yeterince Boyanabilen ve makul veri kalitesiyle bir kitle spektrometrik analiz sağlar.</li>
</ol>

<ol><li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01007704">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li>
<li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li>
<li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li>
<li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+Transit%3A+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li>
<li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Bio%22%5BJournal%5D)">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li>
<li>Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDinant%2C+S+%22Plant+Mineral+Nutrients%22">Plant Mineral Nutrients</a>. 953, 185-194 (2013).</li>
<li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v171/n4351/abs/171528a0.html">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528(1953).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li>
<li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution%2C+glutathione%2C+and+glutathione+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li>
<li>Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+biologies%22%5BJournal%5D)">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li>
<li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111(2013).</li>
<li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+%28Solanum+lycopersicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+%28Lupinus+albus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).</li>
<li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+%28Lupinus+albus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li>
<li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li>
<li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li>
<li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li>
<li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Rais, I., Karas, M., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+PAGE+in+plants%3A+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11(2005).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+traffic+in+the+fast+lane%3A+long-distance+signalling+by+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li>
<li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li>
<li>Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypyrimidine+tract+binding+protein%2C+pumpkin+RBP50%2C+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Photoassimilates için ana ulaşım yol teşkil eder ve aynı zamanda uzun mesafe farklı bitki parçaları9,20,34arasındasinyal için önemlidir beri phloem bir kompartıman yüksek ilgi var, 35. Küçük moleküller yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi phloem bakım ve sinyal4,7,8ile karıştığı olmuştur. Phloem kompozisyon analizi tarafından sınırlı erişilebilirlik çoğu bitki türü phloem örnekleri için sınırlıdır. Böcek stylet tekniği yaygın olarak uygulanabilir, ancak deneysel olarak talep ve phloem örnekleri11çok küçük miktarlarda. Phloem örnekleme için kullanılan bir kolay EDTA kolaylaştırdı reaksiyon12tekniğidir. EDTA divalent iyonları kalsiyum gibi chelates ve böylece P-proteinler ve callose elek plakaların kapanış engeller. Bu kullanımı kolay, ancak kirlenme hasarlı hücreleri tarafından eğilimli ve örnekleri seyreltilmiş. EDTA tarafından divalent iyonları tüketen da varolan kompleksleri bir arıza neden olabilir. Ancak, örnekleme tür model bitki A. thaliana15dahil geniş bir dizi sağlar. İn phloem su kendiliğinden reaksiyon yalnızca az sayıda bitki türleri içinde oluşur. Bitki doku10önemli yaralanma içerir invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda şehirlerarası ulaşım4,8,20eğitim için bir modeli tür olarak B. napus kurulmuş. Burada, phloem sap küçük kesik, yaralama etkileri ve kirlenme kaynakları azaltan tatmak mümkündür.
Farklı örnekleme teknikleri kullanarak, farklı bitki türü phloem örnekleri Proteom son yıllarda7,8,17,36,37içinde, araştırmış 38,39. Bu Proteom çalışmalar için proteinler çıkarılan ve koşulları denaturing altında çöktürülmüş ve bu nedenle protein: protein ve protein hakkında sonuçlar izin verme: nükleik asit etkileşimleri mevcut yerel koşullar altında. Co-immunoprecipitation (COIP) ve bindirme deneyleri belirtilen büyük Ribonükleoprotein karmaşık phloem sap kabak40mevcut, ama o herhangi bir makromoleküllerin kompleksleri içinde yerel koşullar altında bulunduğunu gösterilmiştir değil phloem sistemi.
Schägger ve ark. tarafından tanıtılan mavi yerel sayfa 26, sonraki yüksek çözünürlüklü Jel Elektroforez adımları ile birlikte büyük protein kompleksleri her bileşeninin ayrılması etkinleştirin. Yerel B. napus 3D-sayfa analizleri kullanarak phloem çıktı, biz son zamanlarda göstermek birkaç yüksek molekül ağırlıklı protein: protein ve RNP kompleksleri phloem örnekleri var ve enzimatik aktif4vardır. RNPs yanı sıra protein kompleksleri boyutu dışlama Kromatografi gibi izole etmek için alternatif yöntemler var ama BN-sayfasına göre çözünürlük açısından başarısız. Ayrıca, karmaşık ayrılık makul kalitesi için boyutu dışlama sütun matrisler soruşturma altında genel olarak karmaşık moleküler ağırlık göre adapte olmak zorunda. Farklı büyüklükte konut projeleri analiz bu nedenle yoğun maliyet ve BN sayfası olarak yüksek odaklama gücü olarak izin vermez sütunları farklı türde talep edecek.
Kompleksleri B. napus üzerinden analiz etmek için kritik adımlar phloem sap malzeme başlangıç olarak kullanılan toplam miktarı içerir. Phloem örneği en az 600 µL gerekli olan ve beş iyi sulanan bitkilerden elde edilebilir. 3D-sayfa ve BN Kuzey kurutma için ilk BN jel phloem örnekleri yeterli miktarda ile başlatmak gereklidir. 20-30 µg protein her içine de ve en az yüklenebilir kadar bunu başarmak için phloem örnekleri triplicates aynı örneği paralel olarak çalıştır yoğunlaşmıştır. Çok düşük veya çok yüksek konsantrasyonları kompleksleri (şekil 3) algılanmasını azaltır. Phloem örnekleri içine buz üzerine tepki boruları toplanması ve daha sonra kullanmak üzere protein yıkımı ve ciro önlemek donmuş muhafaza edilmelidir. Proteaz inhibitörleri analiz bütün phloem proteomes bulduk, ama aynı zamanda tam etkin bir proteasome B. napus4phloem içinde tanımlanmıştır. Ayrıca, birim ve phloem örnekleri bileşimi örnekleme süresi-noktası ve çevre koşulları10bağlıdır. Bu nedenle benzer koşullar altında günün aynı zamanda toplamak için özen göstermelidir. Stres Tedaviler (örneğin kuraklık) toplanabilir phloem miktarını azaltabilirsiniz. Tek proteinler tarafından kütle spektrometresi tanımlamak için olası keratin contaminations tarafından giyen eldiven her zaman sınırlamak için zorunludur. Keratin ek sinyallere kitle spec Çözümleme sırasında yol açar ve protein kimlik engellemektedir. BN-sayfa daha yüksek bir voltaj veya ortam sıcaklığı çalışan Isıtma kırılgan kompleksleri sökme içinde sonuçlanabilir jel yol açabilir.
Burada sunulan Protokolü protein: protein kompleksleri analiz için uygundur. Ayrıca paralel komplekslerinde yer alan belirli RNA'ların algılamak için kullanılabilir gösterir. Bunu başarmak için biz yeni bir protokol BN4kurutma Kuzey tanıttı. RNA'ların RNAse contaminations tarafından bozulması yatkındır. Bu tür bozulma sınırlamak için DEPC-tedavi, su kullanılmalıdır.
Sunulan yönteminin ana sınırlamalarını boyut, şekil ve ardından değişiklikleri kompleksleri31bile geçiş davranışını bağlıdır beri BN-PAGE tarafından ayrılmış protein kompleksleri molekül ağırlığı tahmini dahil, 41. RNP kompleksleri boyut tahmini nükleik asitler etkisi geçiş davranışı nedeniyle daha karmaşıktır. Bu da kompleksleri aynı boyutta bir tek grupta birlikte geçirmek önlenebilir değil. Bu karmaşık besteleri hatalı tahmin için yol açabilir. Bu nedenle tamamlayıcı teknikleri ile gözlenen etkileşimleri doğrulama, örneğin fonksiyonel deneyleri4,-ebilmek var olmak gerekli. Ayrıca sadece zayıf veya geçici bir makromoleküllerin karmaşık ilişkili proteinler kullanılan BN arabellekte kaybetmiş. Bunu önlemek için örnekleri çapraz, ne de eserler neden olabilir ya da protein tanımlama, engel olabilir veya arabellek koşulları optimize edilebilir.
Klasik 2D-sayfa, aksine kasanın üre SDS sayfa, hydrophobicity ve molekül ağırlığı isoelectric noktası (PI) ve molekül ağırlığı 28yerine göre ayırma verir ve proteinler için ayırma sınırı yok bir belirli pI aralığı. Benzer Klasik 2D sayfa, ayrılmış proteinler, ama tek noktaları olarak görünür bir çapraz çizgi 4,28 (şekil 5, şekil 6). Hidrofilik proteinler daha satır28bulunur, ancak daha fazla hidrofobik proteinler bu çapraz, yukarıda noktalar görünür. Bu protokol için kullanılan polyacrylamide konsantrasyonları proteinler arasında 25-80 kDa de ayıracak. Bir ayrılık daha küçük veya daha büyük proteinlerin polyacrylamide izin vermek için konsantrasyon değiştirilebilir veya Degrade jelleri üçüncü boyutu kullanılabilir. 3D-sayfa (şekil 6) tarafından ayrılmış bileşenleri karmaşık IV (şekil 3) dışarı, sindirmek ve kütle spektrometresi tarafından analiz tripsin kesilmiş. Bu birkaç tRNA ligazlar tanımlaması içinde sonuçlandı. Diğer kompleksleri bileşenlerinin olmuştur son 4yayınlandı. 3D SAYFAMIZI farklı ligazlar, yani aspartat, asparagine, treonin, benzer moleküler ağırlıkları (Tablo 3) ile lizin ve glisin ligazlar ayrılması etkin. Metiyonin tRNA özgü sonda kullanarak, biz karmaşık IV içinde potansiyel olarak ilişkili tRNA algılamak başardık, ama tam uzunlukta tRNA veya tRNA parçaları karmaşık ise kullanılan problar ile ayrımcılık yapamam. Nükleik asitler gerçekten kompleksi içinde ilişkili ve eş geçirme iseniz, proteaz phloem sap sindirilmiş kontrol etmek için örnekleri uygun geçiş denetimleri hizmet verebilir.
Bu daha önce hemen hemen çoğu bileşen tüm ribozom hem de uzatma faktörlere phloem örnekleri4,7' bulduğumda protein çeviri phloem elek tüpler içinde oluşabilir spekülasyonlar. Bizim bulma tRNA ve tRNA ligazlar bu fikri destek gibi görünüyor. Ancak, tRNA parçaları kabak phloem örnekleri mevcut çeviri42 güçlü inhibitörleri olduğu gösterilmiştir ve fonksiyonel ribozomlara çeviri yer alamaz düşündüren4, görünmektedir.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan Protokolü yerli protein: protein ve phloem örnekleri ve ayrılık bile RNP kompleksleri ayrılması ve yüksek çözünürlüklü bireysel bileşenleri tanımlaması sağlar. Bu yöntemin uygulama keşif phloem örneklerinde RNP kompleksleri ve roman protein sağlar ve bu nedenle bu çok özel bitki yerde yeni işlevler aydınlatmak.

Phloem uzun mesafe hatları daha yüksek bitkilerde organik besin tahsisi için gerekli olan, ama aynı zamanda birçok farklı işlemler önemli büyüme ve kalkınma, patojen savunma ve adaptasyon için olumsuz düzenlenmesinde katılmaktadırlar çevre koşulları. İyonlar, etki veya metabolitleri kendileri gibi küçük effectors yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi son zamanlarda potansiyel sinyaller olarak ortaya çıkmıştır.
Çalışmalar proteinlerin phloem yükleme boyutu bağımlı ve dışlama boyutunda (SEL) eşlik eden hücreler (CC) bağlanma gözenek plasmodesmal birimleri tarafından kontrol olduğunu göstermiştir ve elek genellikle 10 aralığındaki öğeleri (SE) > 67 kDa1 , 2 , 3. ancak, rağmen bu boyutu sınırlamaları daha büyük protein ve protein kompleksleri boyutu dışlama4fikri zor phloem sistemi içinde bulundu ve se CC den proteinlerin bile nonspesifik kaybı önerilen5 oldu .
Multiprotein gibi büyük Ribonükleoprotein kompleksleri içinde biyosentezi ve hücre6yapısal bütünlüğünü korumak çok önemli rol oynarlar. Phloem-mobil protein-protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri4,7, mevcut kanıt ama bugüne kadar onların işlevi hakkında az şey bilinmektedir. Phloem elek elemanları uzun mesafe taşımacılığı ve / veya sinyal8,9ile protein: protein ve RNP kompleksleri karıştığı. Değişen altında çevre onların kompozisyon translocated kompleksleri fonksiyonları çözmek veya stres koşulları gereklidir. Bunu başarmak için yerel kompleksleri izole olmak zorunda ve bileşenlerinin yeterli çözünürlükte ayrılması gerekiyor.
Yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri phloem dan izole etmek için yeterli kalite ve miktar sap örneklerini almak için ilk gerekli olduğunu. Phloem örnekleme için kullanılan teknik faiz bitki türü üzerinde bağlıdır. Phloem su elde etmek için üç ana yöntem mevcut 10: böcek stylectomy11, EDTA kolaylaştırdı reaksiyon12ve spontan reaksiyon13.
Phloem örnekleri Arabidopsis thaliana (A. thaliana), laboratuvarlar dünya çapında, büyük modeli fabrikasında sadece EDTA kolaylaştırdı reaksiyon veya yaprak biti stylectomy14,15tarafından elde edilebilir. Her iki yöntem son derece seyreltik phloem sap veya çok düşük örnek tutarlar için yol. EDTA kolaylaştırdı reaksiyon da kontaminasyon için eğilimli ve gerçek phloem kompozisyon16gösterebilir değil. Spontan phloem reaksiyon nereye çıktığını bitki parçalar keserek kolayca toplanan13,17,18olabilir phloem sap spontan bir emisyon için cucurbits, lupine veya avize, gibi tür bitki sınırlıdır, 19. Son zamanlarda phloem analiz için uygun modeli sistemi olarak yağlı tohum tecavüz (Brassica napus) kurulmuş, ondan beri onun ' A. thaliana yakın akrabası ve birkaç microliters in phloem su için gösterilen küçük insizyon elde edilebilir yüksek saflıkta4,8,20olması. Ayrıca, B. napus genom sırası 201421yılında yayımlanmıştır.
Yaprak biti stylectomy dışında doku örnekleme sitesinde çevreleyen zarar açıklanan tüm phloem toplama yöntemleri içerir ve phloem sap bileşimi yaralanma yanıt olarak değişebilir. Bu nedenle phloem örnekleri, ne olursa olsun uygulanmış örnekleme kalitesini kontrol etmek için esastır. Toplanan phloem sap, örneğin belirlenmesi RNase etkinliği22,23, RT-PCR ile astar Rubisco8,24karşı veya şeker analizi tarafından kalite kontrolü için farklı yöntem vardır kompozisyon8.
Yalıtmak ve protein kompleksleri ayırmak için farklı yöntemler uygulanabilir, boyutu dışlama Kromatografi, sukroz yoğunluğu ultrasantrifüj veya örnek filtrasyon farklı molekül ağırlığı kesim ile membranlar yoluyla dahil olmak üzere off. Ancak, bu yaklaşımların yüksek çözünürlüklü izin vermez. İlk Schägger ve arktarafından açıklanan mavi yerel sayfa (BN SAYFALIK) olarak adlandırılan teknik. 25, çözünürlük açısından üstün. Bu şekilde büyük yerli protein kompleksleri çeşitli organelleri veya hücresel lysates ve onların göreceli zenginliği26,27moleküler ağırlıkları belirlemek için kullanıldı.
Daha fazla protein kompleksleri karmaşık bileşimi aydınlatmak için koşullar, karmaşık bileşenleri tam demontaj için önde gelen denaturing altında tek tek bileşenleri ayırmak gereklidir. Bu ikinci boyutu SDS-sayfa 28,29 veya isoelectric (yardımcı) odaklanan ikinci bir boyuta göre ardından SDS-sayfa30 third dimension ve sonraki tanımlaması daha yüksek çözünürlük elde etmek için elde edilebilir Kütle spektrometresi kullanılarak proteinler.
Bu protokol için saf phloem sap B. napus bitkilerden örnekleme ve protein kompleksleri BN-sayfa Tris-Tricine-üre-sayfa ve SDS-sayfa ile birleştiren bir 3D elektroforetik yaklaşım kullanarak böyle phloem örneklerinden analizini açıklar. Ayrılmış protein karmaşık bileşenleri daha sonra kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, biz mavi yerel Kuzey büyük RNP kompleksleri4' te, RNA'ların algılanmasını sağlayan bir yöntem olarak kurutma tanıtmak yaklaşımının uygulanabilirliği genişletme.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL reaction tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96 % Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium peroxodisulfate (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal concentrators &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography papers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging system &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Heating block TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; GFL Hybridization Incubator 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle (0.8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG gel comb, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Labeling of RNA &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;Biotin 3&#039;end DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Native gradient gel &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Novex NativePAGE 4&amp;ndash;16% Bis-Tris protein gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nylon membrane &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-phosphoric acid</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler prestained protein ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Power supply for Gel electrophoresis EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>available from GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot &lt;em&gt;e.g&lt;/em&gt;. Fastblot 43B semi dry Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Synthesis of cDNA &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate dihydrate</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Vertical electrophoresis apparatus &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System</td><td>Thermo Fisher Scientific or BioRad</td><td>EI0001 or 1658004</td><td></td></tr><tr><td>Wipers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; KIMWIPES Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes

Phloem daha yüksek bitkilerin örnekleme kez zahmetli ve önemli ölçüde bağlı olarak bitki türü. Ancak, koşullar denaturing altında Proteom çalışmaları farklı bitki türü içinde elde edilebilir. Yerli protein: protein ve protein: nükleik asit kompleksleri phloem örneklerinden henüz pek analiz, her ne kadar onlar bu özel bölümü bakım veya uzun mesafeli sinyal önemli roller oynamak. Büyük moleküler gruplar mavi yerli Jel Elektroforez (BN-sayfa) kullanarak ayrılmış olabilir. Protein bileşenleri bir sonraki Sodyum Lauryl Sülfat (SDS-sayfa) tarafından ayrılabilir. Ancak, protein benzer moleküler ağırlıkları ile ne tarafından kütle spektrometresi protein kimlik engel olabilir ortak göç eder. İki farklı denaturing Jel Elektroforez adımları ile yani Tris-Tricine-üre ve SDS-sayfa, BN-sayfa birleştirerek proteinler onların hydrophilicity/hydrophobicity göre ek ayrılması sağlar ve böylece çözünürlük ve başarı artırır protein tanımlaması. Hatta sadece onların ardından değişikliklerini farklı proteinler ayırt sağlar. Ayrıca, mavi yerel Kuzey kurutma makromoleküllerin komplekslerinde RNA bileşenlerini belirlemek için uygulanır. Bizim iletişim kuralı protein ve RNA bileşenlerini yerli protein: protein ve phloem örneklerinde meydana gelen Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri çözülmeye uygun olduğunu göstereceğiz. Bir mavi birleştirerek iki farklı denaturing sayfa adımlar ile yerel sayfa büyük protein kompleksleri farklı türde ayırmak için yardımcı olabilir ve ayrıca tarafından kütle spektrometresi bileşenlerinin bir artan tanıma oranı sağlar. Ayrıca, aynı anda tek protein kompleksleri içinde potansiyel olarak ilişkili nükleik asitler algılamak için sağlam bir protokoldür.

Burada protein: protein analizi sağlayan bir protokol mevcut yanı sıra protein: RNA kompleksleri Brassica napusphloem örnekleri içinde. İş akışını şekil 1' de gösterilmiştir. B. napus diğer canlılar bir büyük avantajı nispeten kolay phloem örnek koleksiyon önümüzdeki kök küçük delikler imkanı vardır. Bu saf phloem örneklerini nispeten büyük miktarda almak için sağlar. Phloem örnekleme zaman, her zaman contaminations için örneğin RT-PCR8tarafından kontrol etmek için tavsiye edilir. Saf phloem örnekten elde edilen bir temsilcisi sonuç Şekil 2' de tasvir edilir. Sinyal rubisco ve polen kat protein için görünmelidir ise sigara-kirlenmiş phloem örnekleri thioredoxin h, görünür bir bantını göstermelidir. Rubisco küçük alt birim bir denetim yaprakları, örnekleri olarak hizmet verebilir önümüzdeki kaynaklanıyor olsa veya polen. Polen kat protein transkript sadece çiçek tomurcuk örneklerinde görünür gerekirken onun mRNA farklı tür, phloem içinde bulundu beri Thioredoxin h tüm örnekleri, tespit olmalıdır. Contaminations phloem örnekleme tam çiçekli bitkiler (polen kat protein) veya delikler örnekleme phloem gelen ilk damlacıkları düzgün atılır değil gerçekleştirildiğinde oluşabilir (rubisco).
BN-sayfa önce phloem sap konsantre zorunluluğu vardır. 20-30 µg protein iyi kullanarak, en az dört büyük protein karmaşık bant B. napus phloem sap, çok düşük BN sayfa sonra görünür hale gelir veya çok yüksek konsantrasyonda kompleksleri (şekil 3) net bir ayrım izin vermiyor. Bu aynı kompleks bir tek cep daha da aşağı akım işleme ve sonraki kitle spektrometrik kimlik tek her karmaşık gelen proteinler konsantre için ikinci boyut jel içine temsil eden birkaç jel bantları yüklemek için tavsiye edilir.
Phloem makromoleküllerin kompleksleri bireysel bileşenlerini belirlemek için biz ilk BN SAYFALIK bir ikinci boyut Tris-Tricine-üre ile kombine ve bir üçüncü bir ayrılık tek protein elde etmek için SDS-sayfa boyut. Burada, yüksek çözünürlüklü bir ayrılık nedeniyle de üre ve SDS-sayfa jelleri farklı protein geçiş davranışları görülebilir. Genellikle, proteinler için tek bir kompleks ait jel arasında çapraz bir çizgi görünür. Proteinler sınırının altında daha hidrofilik olanlar28 (şekil 5, şekil 6) temsil ise proteinler bu çizginin üzerinde artan bir hydrophobicity var.
RNP kompleksleri karakterizasyonu için BN Kuzey kurutma gerçekleştirmek için BN-sayfa jel bir parçası kullanılır. Bütün sokağın üstüne bir naylon membran ve çapraz UV radyasyon kurutma sonra RNA RNA özgü probları şekil 4' te gösterildiği gibi kullanarak görüntülenmeyecektir. Burada belirli bir tRNA sadece belirli bir kompleks mevcuttur gösterilir. Bu tRNA-bağlama kompleks protein bileşenleri yukarıda açıklanan 3D jel yaklaşım kullanarak daha fazla araştırılması. Kitle spektrometrik analizi bu tesis ne BN Kuzey Blot tarafından bulundu tRNA bağlama etkinliği onaylar özellikle tRNA ligazlar içerir gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı Ribonükleoprotein kompleksleri analiz yağlı tohum tecavüz phloem sap. Örnekleme ve phloem örnekleri hazırlanması sonra BN-sayfa yerel kompleksleri ayırmak için gerçekleştirilir. Böyle BN-sayfa jelleri nükleik asitler BN Kuzey Blot tarafından paralel analizi ve kütle spektrometresi tarafından kompleksleri protein bileşenlerinin tanımlaması izin verir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig2.jpg"> Şekil 2: örnekleme ve saflık kontrolü B. napusözlerinin phloem. 8-10 haftalık yağlı tohum tecavüz bitkiler steril bir şırınga iğnesi ile önümüzdeki kök delinme sonra çıktı bir pipet ile toplanır ve RT-PCR gerçekleştirilen phloem örnekleri saflığı onaylamak için bir buz gibi tepki tüp için (a) transfer, thioredoxin h, rubisco küçük alt birim ve polen kat protein özel doku örneklerinde (b) transkriptaz olmadan RT-PCR transkript yükseltecek denetimi (-) olarak gerçekleştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig3.jpg"> Şekil 3: BN-sayfa. Mavi yerel sayfa şematik gösterim konsantre phloem örnekleri ile B. napus. (a) 15-20 µL in konsantre phloem su ile degrade protein jel yükleme sonra BN-sayfa 1 x koyu mavi katot arabellek B 150 V 20-30 dk soğuk bir odada ile gerçekleştirilir. Daha sonra arabellek karşı 1 x ışık mavi katot tampon B/10 değiştirilir ve sayfa açık çalışır jel dışında çalışan koyu mavi kadar 150 V 120-180 dakika bitti. BN-sayfa jelleri dört farklı yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri temsil eden dört farklı bant göster. (b) (c) çok az veya çok fazla (d) phloem proteinler yükleniyor bireysel kompleksleri görünürlüğünü azaltır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig4.jpg"> Şekil 4: BN Kuzey Blot. BN Blot yöntemi Kuzey şematik gösterimi. (a) bir lane BN sayfasının naylon membran yarı kuru Blot tarafından aktarılır. UV-çapraz ve öncesi hibridizasyon sonra membran biotinylated hibridizasyon fırında 3'-son gece boyunca olan RNA belirli problar (burada metiyonin tRNA özgü sonda), ile inkübe. Ücretsiz probları adımları yıkayarak kaldırılır ve RNA tespiti streptavidin-HRP eşlenik ve luminol tarafından yapılmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, biz BN sayfasından karmaşık IV metionin içerir gözlenen tRNA. (b) lekeli Coomassie jel ve tRNA leke geçiş farklılıkları önlemek için paralel olarak çalıştır iki farklı jel şeritli benzer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig5.jpg"> Şekil 5: 3D-sayfa. 3D-sayfa yaklaşım şematik gösterimi. Aynı kompleks birkaç grup BN-sayfa jel eksize, arabellek yüklenirken inkübe ve ikinci boyutu Tris-Tricine-üre-sayfa bir kuyunun içine aktarılır. Elektroforez sonra bütün jel şerit kesip, asidik asit arabellekte yıkanmış, equilibrated ve % 15 SDS-sayfa jel yerleştirilir. Üçüncü boyut sayfa sonra lekeli ve kütle spektrometresi tarafından analiz Coomassie ayrılmış proteinlerdir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig6.jpg"> Şekil 6: temsilcisi sonuçlar 3D-sayfa sonra. İlk boyut BN-sayfa içinde birkaç kompleksleri ortaya çıktı. Protein bileşenleri daha fazla bir diyagonal nokta şeklinde sonuçlanan iki sonraki denaturing sayfaları tarafından ayrılmış. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sonda</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thioredoxin h</td>
			<td>
 İleri: CTCAAGGCAGCCAAAGAATC geriye doğru: ATGGCCTGAACATCGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rubisco küçük bir zincir</td>
			<td>
 İleri: TTCACCGGCTTGAAGTCATC geriye doğru: CCGGGTACTCCTTCTTGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polen kat protein BRU77666</td>
			<td>
 İleri: TCAGAACTGGAGCTTCAACG geriye doğru: TTCCTTAATGGCCTCAGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: phloem örnek saflık kontrolü için kullanılan astar. Phloem örnek saflık onaylamak için astar rubisco küçük bir zincir, thioredoxin h ve polen kat protein için özel cDNA amplifikasyon için kullanılabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Arabellekleri ve çözümleri</td>
			<td colspan="2">İçerik</td>
			<td>Yorum</td>
		</tr>
<tr>
<td>koyu mavi katot arabellek B</td>
			<td colspan="2">15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,02 (w/v) Coomassie mavi G250</td>
			<td>tarifi Fiala vd. 17 uyarlanmıştır pH 7,0 için ayarlanması gereken Arabellek 10 x stok olarak yapılabilir</td>
		</tr>
<tr>
<td>hafif mavi katot arabellek B/10</td>
			<td colspan="2">15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,002 (w/v) Coomassie mavi G250</td>
			<td>Arabellek katot katot arabellek Coomassie olmadan B önbellekle sulandrarak hazır olun</td>
		</tr>
<tr>
<td>anot arabellek</td>
			<td colspan="2">
 50 mM Bis-Tris pH 7,0</td>
			<td>Arabellek 10 x hisse senedi çözüm olarak hazırlanan</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS örnek arabellek x 2</td>
			<td colspan="2">
 125 mM Tris-HCl pH 6.8 %4 SDS % 20 gliserol 0,2 M DTT %0,02 (w/v) bromophenol mavi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktarım arabellek 1 x TBE arabellek</td>
			<td colspan="2">
 89 mM Tris pH 7,6 89 mM Borik asit 2 mM EDTA</td>
			<td>TBE tampon yapılan ve 5 x veya 10 x hisse senetleri depolanan. Kullanım RNase free deiyonize su için önemlidir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>SSC arabellek x 2</td>
			<td colspan="2">
 300 mM NaCl 30 mM Na3sitrat pH 7,0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x jel arabellek</td>
			<td colspan="2">
 3 M Tris 1 M HCl %0,3 SDS pH 8.45</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine jel çözüm A</td>
			<td colspan="2">
 10 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 3.34 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 3.34 mL % 70 gliserol 1.4 mL GKD2O 10 mL için eklemek % 10 APS 40 ΜL TEMED 4 ΜL</td>
			<td>6 M üre ağırlık ve 3 x jel arabellek, Akrilamid-bisacrylamide çözüm ve % 70 gycerol ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine jel çözüm B</td>
			<td colspan="2">
 6 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 0.8 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 1,5 mL GKD2O 6 mL için eklemek % 10 APS 45 ΜL TEMED 4.5 ΜL</td>
			<td>6 M üre ağırlık ve 3 x jel tampon ve Akrilamid-bisacrylamide çözüm ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine çalışan arabellek (anot) x 1</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 22.5 mM HCl pH 8,9</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine çalışan arabellek (katot) x 1</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 100 mM Tricine % 1 SDS pH 8,25</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asidik arabellek</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 100 mM Asetik asit</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>%4 SDS yığın jel</td>
			<td colspan="2">
 2 mL için: GKD2O 1.4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 0.33 mL 1 M Tris pH 6.8 0.25 mL % 10 SDS 20 ΜL % 10 APS 20 ΜL TEMED 2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Jel ayıran % 15 SDS</td>
			<td colspan="2">
 10 mL için: GKD2O 2.3 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 5 mL 1.5 M Tris pH 8,8 2.5 mL % 10 SDS 100 ΜL % 10 APS 100 ΜL TEMED 4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS çalışan arabellek x 1</td>
			<td colspan="2">
 25 mM Tris 192 mM glisin %0.1 SDS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm boyama Coomassie</td>
			<td colspan="2">
 %5 (w/v) alüminyum sülfat-(14-18)-hidrat % 10 (v/v) etanol (% 96) %2 (v/v) dezenfektan maddeler (% 85) %0,02 (w/v) Coomassie parlak mavi G-250 
			 </td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ULTRAhyb vericiyi hibridizasyon arabellek</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Ambion, yaşam teknolojileri</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: çözümler ve arabellek tarifleri. Liste-in tüm arabellekleri ve çözümleri 3D-sayfa analizi için gerekli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hayır nokta.</td>
			<td>MW obs. [kDa]</td>
			<td colspan="2">Kimlik</td>
			<td>Organizma</td>
			<td>Hayır katılım.</td>
			<td>MW [kDa]</td>
			<td>Maskot puanı</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_1</td>
			<td>130</td>
			<td colspan="2">Sözde hastalık direnci protein At4g19050</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>CDX78917</td>
			<td>131.1</td>
			<td>110</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_2</td>
			<td>130</td>
			<td colspan="2">Sözde hastalık direnci protein At4g19050</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>CDX78917</td>
			<td>131.1</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_3</td>
			<td>100</td>
			<td colspan="2">Isı şok 70 kDa protein 14 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_013748865</td>
			<td>89.9</td>
			<td>113</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_4</td>
			<td>90</td>
			<td colspan="2">Ökaryotik uzama faktör 2 Hücre bölünmesi kontrol protein 48 homolog A</td>
			<td>B. napus B. napus</td>
			<td>CDX90241 CDY41316.1</td>
			<td>89,5 89,5</td>
			<td>111 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_5</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="2">Isı şok protein 90-2-gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009132342</td>
			<td>79,8</td>
			<td>172</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_6</td>
			<td>80</td>
			<td colspan="2">Treonin--tRNA ligaz Glisin--tRNA ligaz</td>
			<td>B. oleracea B. napus</td>
			<td>XP_013599115 CDY43195</td>
			<td>81,5 80.8</td>
			<td>110 88</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_7</td>
			<td>70</td>
			<td colspan="2">Isı şok protein 70 kDa Lizin - tRNA ligaz benzeri</td>
			<td>B. oleracea B. napus</td>
			<td>XP_013685267 XP_013747530</td>
			<td>67,8 69.9</td>
			<td>230 150</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_8</td>
			<td>65</td>
			<td colspan="2">Myrosinase Aspartat--tRNA ligaz 2 Asparagine--tRNA ligaz 1</td>
			<td>B. napus B. napus B. napus</td>
			<td>ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126</td>
			<td>60.6 61.6 63,5</td>
			<td>183 141 153</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_9</td>
			<td>60</td>
			<td colspan="2">Myrosinase</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>ABQ42337</td>
			<td>60.6</td>
			<td>164</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_10</td>
			<td>55</td>
			<td colspan="2">Adenosylhomocysteinase 2 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009135865</td>
			<td>53.1</td>
			<td>139</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_11</td>
			<td>55</td>
			<td colspan="2">Uzama faktör 1-alfa 1-gibi</td>
			<td>B. oleracea</td>
			<td>XP_013586115</td>
			<td>51,9</td>
			<td>161</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_12</td>
			<td>50</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_013653143</td>
			<td>48.1</td>
			<td>237</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_13</td>
			<td>44</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>213</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_14</td>
			<td>38</td>
			<td colspan="2">Fruktoz-bisphosphate aldolaz</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009115993</td>
			<td>38.4</td>
			<td>226</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_15</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_16</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>CDY69765</td>
			<td>46.9</td>
			<td>209</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_17</td>
			<td>38</td>
			<td colspan="2">Fruktoz-bisphosphate aldolaz</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009115993</td>
			<td>38.4</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_18</td>
			<td>18</td>
			<td colspan="2">Peptit-prolyl CIS-trans izomeraz CYP18 3 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_009101932</td>
			<td>18,3</td>
			<td>128</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_19</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>177</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: tanımlanan protein bileşenler karmaşık IV. Birkaç tRNA ligazlar ve daha fazla protein tRNA bağlayıcı kompleksi içinde bulunan 3D-sayfa sonra kitle spektrometrik analizi MALDI-TOF kullanarak.

Watch this Scientific Journal Video about Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

Protein ve Ribonükleoprotein Komplekslerinin 3D-PAGE'i için Brassica napus'tan Floem Sap Örneklemesi | Biyoloji | Video

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

13.8K Görüntüleme.  Universität Hamburg. Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Video: Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Çevre

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Biyokimya

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, allergy-provoking immune responses. In addition, carbohydrate structures also play a critical role in plant metabolism. Here, we present a simple and rapid method for preparing and analyzing N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus) using an N-glycanase specific for the release of plant-derived carbohydrate structures. To achieve this, crude trichloroacetic acid precipitates of radish homogenates were treated with PNGase H+, and labeled using 2-aminobenzamide as a fluorescent tag. The labeled N-glycan samples were subsequently analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) separation and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for a detailed structural evaluation and to quantify relative abundancies of the radish-derived N-glycan structures. This protocol can also be used for the analysis of N-glycans from various other plant species, and may be useful for further investigation of the function and effects of N-glycans on human health.

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

We describe a simple and rapid method for the preparation and analysis of N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus).

N- glukanlardir Raphanus sativus çeşitlerin kullanarak PNGase h+ Analizi

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of tissue specific expression is limited because of problems in dissecting individual tissues. Expression data needs to be confirmed and complemented with expression patterns using e.g. in situ hybridization, a technique used to localize cell specific mRNA expression. The in situ hybridization method is laborious, time-consuming and often requires extensive optimization depending on species and tissue. In situ experiments are relatively more difficult to perform in woody species such as the conifer Norway spruce (Picea abies). Here we present a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including P. abies. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, we could use the protocol to study tissue specific expression of homologous genes in male reproductive organs of one gymnosperm and two angiosperm species; P. abies, Arabidopsis thaliana and Brassica napus. The protocol worked equally well for the species and genes studied. AtAP3 and BnAP3 were observed in second and third whorl floral organs in A. thaliana and B. napus and DAL13 in microsporophylls of male cones from P. abies. For P. abies the proteinase K concentration, used to permeablize the tissues, had to be increased to 3 g/ml instead of 1 g/ml, possibly due to more compact tissues and higher levels of phenolics and polysaccharides. For all species the RNase treatment was removed due to reduced signal strength without a corresponding increase in specificity. By comparing tissue specific expression patterns of homologous genes from both flowering plants and a coniferous tree we demonstrate that the DIG in situ protocol presented here, with only minute adjustments, can be applied to a wide range of plant species. Hence, the protocol avoids both extensive species specific optimization and the laborious use of radioactively labeled probes in favor of DIG labeled probes. We have chosen to illustrate the technically demanding steps of the protocol in our film.
Anna Karlgren and Jenny Carlsson contributed equally to this study.
Corresponding authors: Anna Karlgren at Anna.Karlgren@ebc.uu.se and Jens F. Sundstr&#246;m at Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

We describe a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including Norway spruce. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, the protocol may be used in studies of different tissues and species.

Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

Biyoloji

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet