VN Royal Society tarafından desteklenmektedir. JPR bir Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Fellow (FT0992129) &#39;dir. Biz eleştirel yazının okunması için Dr Miriam Gifford teşekkür ederim.

Not: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında yapılır. 1.. Bitki Malzeme ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> N. benthamina <ol><li> Agrobacterium (bu örnekte Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG ve bir kontrol olarak boş vektör) 28 ° C&#39;de sıvı kültür (uygun antibiyotikler ile L medium) (200 rpm) çalkalanarak geçici ekspresyon için ilgi tumefaciens büyümek durağan faz kadar C °. </li><li> Toplamak ve santrifüjleme (5 dakika boyunca 3,000 x g) ile Agrobakterium pelet. Süpernatant atın ve sızma tamponu peletlenmemiş Agrobacteria&#39;yı tekrar süspansiyon. </li><li> 600 nm &#39;lik bir emişteki optik yoğunluğun (OD) değeri (Abs 600 nm) elde etmek ile agrobakteri miktarını ölçün. 0,1-0,8 bakterilerin OD ayarlayın. </li><li> 4 haftalık N. Infiltrate han tarafından agrobakteriye ile benthamina bitkiler (22 ° C, 16 saat ışık)(a-1 ml iğnesiz şırınga ile) ya da vakum (% 0.02 v / v yüzey aktif madde ekleyin) d. Not: İlk neredeyse tamamen genişlemiş-yaprak kullanarak, en etkili ve protein ifadesi için iki hemen büyük yaprak. Ubikitinlenmesi veya asetile proteinlerinin tespiti için 100 nM MG-132 ya da 100 ng / ml, Trichostatin A, sırasıyla 1 de ve 2 gün post-infiltrasyon ile yaprakların sızmak. </li><li> Infiltre yaprakları 2-5 gün sonra infiltrasyonu ve sıvı azot içinde dondurularak hasat. -80 ° C derin dondurucuda örnekleri saklamak. Not: önce 5 gün arasında bir süre boyunca numune alma ve immüno-lekeleme ile protein seviyelerini tespit ilgilenilen proteinin ekspresyonu en iyi düzeyde belirler. </li></ol></li><li> A için thaliana kararlı transgenik çizgiler <ol><li> A. büyüyecek 6 oyuklu plakalar içerisinde oyuk başına tohum thaliana Sıvı MS ortamı içinde, 5 ml (v sukroz w /% 1) ile takviye edilmiştir. Transgenik satır beş tohum (sterilize edilir ve tabakalı) için üç koyunfaiz veya kuyu başına dönüştürülmemiş kontrol çizgisinin. Büyüme odaya plaka aktarmadan önce iki gün boyunca 200 rpm&#39;de çalkalayın ve 2 hafta (22 ° C, 10 saat ışık) için bırakın. </li><li> Hasat örnekler ve sıvı azot içinde dondurularak. Not: Bir kontrol olarak, ilgi konusu proteinin aynı etiketi ile ilişkisiz bir proteini ifade eden bir transjenik çizgi kullanabilir. </li></ol></li><li> Tamponlar <ol><li> 1-2 saat boyunca tampon A. De-gaz tamponu hazırlayın (RLKs için, diğer zara bağlı proteinlerin ve nükleer proteinler,% 1 v / v Igepal CA-630 53 ekleyin). Not: süresiz 4 ° C&#39;de Tampon A tutabilirsiniz. Sen Triton yerine IGEPAL CA-360 v / 1% v kullanabilirsiniz. </li><li> Ekstre önce soğuk tampon B en az 1-2 saat 80 ml hazırlayın. Not: ekstraksiyon tamponu genel doku ideal oranı 1:04 (w / v) &#39;dir. </li></ol></li></ol> 2. Protein Ekstraksiyon <ol><li> Hemen önce ekstre soğuk tampon C 80 ml hazırlamak <li> N. 20 g eziyet benthamiana doku (yaklaşık 15 yaprak) veya A. bir havan kullanılarak sıvı azot içinde thaliana fideleri (6-çukurlu plaka başına 2-4 g). </li><li> , Zemin dokusunun 20 g soğuk tampon C 80 ml ilave edilir, iyice karıştırılmakta ve buz üzerinde eritin. Not: Aynı anda (faiz ve kontrol protein) tüm örnekleri öğütün. </li><li> (4 ° C&#39;de önceden soğutulmuş) bir doku homojenleştirici ile tam hızda 10 saniye, her 3 patlamaları ile homojenize edilmiştir. 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 30,000 x g&#39;de 22-25 um bir doku ve santrifüj yoluyla Filtre ° C. Not: Alternatif olarak, yeni bir önceden soğutulmuş havan ve havan tokmağı ile homojenize. </li><li> Afinite matrisi engelleme ve yıkama adımları için, Tampon D&#39;nin 20 ml hazırlamak </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca,% 1 BSA ihtiva eden soğuk tampon D 500 ml kullanılarak uygun bir afinite matrisi Blok 100 mi ° C. Not: Tercih affinity matrisler anti-FLAG M2 agaroz, Streptavidin agaroz, GFP-Trap_A ve anti-HA agaroz içerir. </li><li> 1 ml soğuk tampon D ile yıkayın 3x </li><li> Buz üzerinde yeni bir tüp içine, bir 0.45 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir yaprağı ekstresi ve filtre süpernatantı. Not: özü rengi yeşil ya da sarı olmalı, örnek kahverengiye döndüğünde ise, atın ve yeniden başlayın. </li><li> , Immunoblot için ham ekstraktı atın 5x bir kısım SDS-PAGE yükleme tamponu, girdap ekleyin ve 80-100 ° C&#39;de 10 dakika için kaynatma ile denatüre örnekleri Isı bloğu C °. </li></ol> 3. Protein İmmunopresipitasyon <ol><li> Iki adet 50 ml tüpler içinde protein özü bölünmüş ve her bir tüpe Tampon D içinde süspansiyon haline afinite matrisi 50 ul ekle. 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca yumuşak bir rotasyon ile inkübe Not: uzun inkubasyon verimini arttırmak için bulunmuştur edilmemiştir. </li><li> Eklenmesi ile elüsyon tampon 600 ul (afinite matrisi 6x boncuk hacmi) hazırlanmasıTampon D (nihai konsantrasyonlar):% 0.5 BSA, (anti-FLAG M2 agaroz için) 0.25 mg / ml ya da FLAG peptit (Streptavidin agaroz için), 10 mM D-biotin. Not: Elüsyon GFP-Trap_A ve anti-HA matrislerin durumunda tavsiye edilmez, bu nedenle 1 x SDS-PAGE yükleme tamponu içinde kaynama noktasına kadar doğrudan devam, 3.11 nolu aşama. </li><li> 4 ° C (1000 x g, 5 dakika) santrifüj ile afinite matrisi çöktürün. </li><li> , Immunoblot için bağlanmamış ekstraktının bir tümbölenini al yüzer geri kalanını atmak, tüpün alt yaklaşık 500 ul bırakır. </li><li> Geniş çaplı ucu ile bulamaç solüsyon yeniden süspanse edin. </li><li> Tek bir 1.5 ml tüp iki tüplerden karışık çamur solüsyon aktarın. Not: Şu andan itibaren, mikrofuge&#39;de tüpleri bağlama 1.5 ml düşük protein kullanın. </li><li> Afinite matrisi çöktürmek ve süpernatant kaldırmak için bir masa üstü santrifüj kullanılarak 5 saniye için nabız 3x. </li><li> Yıkamalar arasında, 1 ml soğuk tampon D ile 3-5x yıkayın afinite matri çökeltmekx, daha önce tarif edilen ve süpernatant atılır. Son yıkama bir şırınganın iğne ile fazla Tampon D çıkarın. Not:% 0.1 Igepal ile Tampon D kullanılarak bir son yıkama başka spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için kullanılabilir. </li><li> Sabit şekilde çalkalanarak (anti-FLAG M2 veya Streptavidin agaroz bakınız adım 3.2) uygun bir elüsyon tamponu içinde 200 ul 3x, 5 dakika ile her Zehir. </li><li> Tek bir tüp içinde 3 yıkama sıvıları Havuz. Emme reçine 30 ul kullanılarak proteinleri konsantre edilir. Vortex, 5 dakika boyunca bekletin ve reçine (10.000 x g&#39;de 2 dakika) çökelmesi edelim. Süpernatant atın. Not: GFP-Trap_A ve anti-HA agaroz için, adımları 3.9 ve 3.10 atlayın. </li><li> Çöken afinite matrisi ya da emme reçinesine 1x SDS-PAGE yükleme tamponu 50 ul ekle. 80-100, 10 dakika vorteksleyin ve kaynatma Isı bloğu C °. </li><li> 10,000 x g, 2 dakika için kaynatılmış afinite matrisi ya da reçine santrifüjleyin. Supernatan alikosu 5 ulimmüno-t ve ~ 10 cm uzunluğunda SDS-PAGE jel üzerinde (Şekil 2) üzerine diğer fraksiyonlar ile çalıştırın. </li><li> İlave ayrılma (Şekil 2) gerekli ise, kütle spektrometrisi ile ayrılması ve fosforile edilmiş proteinlerin tanımlanması için, ~ 19 cm uzunluğundaki bir SDS-PAGE jeli üzerine, geri kalan 45 ul yükleyin. Not: Boş bir şerit örnekleri kirlenmesini azaltmak için tüm örnekler arasında dahil edilebilir. </li></ol> 4. Protein Sindirim <ol><li> Coomassie Brilliant Blue (CCBB) boyası ile SDS-PAGE jel leke. Not: keratinlerden ile kirlenmeyi azaltmak için jel kullanımını en aza indirin. Ekipman veya araçlarının hiçbiri imünoblotlarını veya artık protein kontaminasyonu yapmamışlar başka faaliyetler için kullanılan emin olun. </li><li> Su içinde bol yıkanarak, tercihen O / N ile jel destain Temiz bir jilet ile jelden ilgi bant kesin. Not: immunoblot ile jel hizalama halinde necessadoğru alanını bulmak için ry. Fosforilasyon SDS-PAGE üzerinde protein göçünü geciktirme gibi hemen çıkar bant üzerinde ve altındaki alana kesin. </li><li> (Bu jel pipet uçları engelleme olmadan tüp içinde çözümler ile kaplı olmasını sağlar) 2-4 mm&#39;lik küpler halinde jel dilim zar. Bir tüp içinde yerleştirin. </li><li> Jel iyi batık tutmak için gerekli hacmi tahmin. Türevleştirme, proteaz ve peptid çıkarma ile inkübasyon için bu miktarda kullanın, ve sonra yıkama için üçlü hacimleri çift kullanın. Not: Tipik olarak, kesme jel parçalarının yaklaşık olarak 100 ul ile sindirmek yıkama için 500 ul çözeltisi, su kaybı boyunca 2 x 180 ul, indirgeme, alkilasyon için 120 ul ve 120 ul sindirim için 150 ul kullanın. </li><li> (50 mM amonyum bikarbonat, ABC),% 50 asetonitril eklenerek jel parçalarından 2 x 20 dak (veya beneği kadar) yıkanır. Jel parçaları kaldırmak için özen çözüm pipetle. </li><li> % 100 Aceto ile dehydrate5 dakika boyunca nitril ve serbest sıvı boşaltılır. Not: Jel çekmiş ve beyaz görünmelidir. Mavi renk devam ederse, asetonitril / ABC ve / veya yüksek bir sıcaklıkta (45-55 ° C) daha inkübe edilir. </li><li> Su içinde 10 mM DTT eklenerek protein disülfıt bağlarını azaltır ve çalkalanarak 56 ° C&#39;de 30-45 dakika inkübe edilir. Serbest sıvı çıkarın. </li><li> 20-30 dakika boyunca (oda sıcaklığı, karanlık) için (50 mM ABC) 55 mM kloroasetamid eklenmesiyle sistein kalıntısı alkile. Serbest sıvı çıkarın. </li><li> (50 mM ABC),% 50 asetonitril ile jel parçalarından 2 x 10 dakika yıkayın. Serbest sıvı çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 asetonitril ile jel parçaları kurutmak ve serbest sıvı boşaltılır. </li><li> Triptik için, sindirimi tripsin çalışma çözeltisinin 40 ul (sindirim tamponu içinde 100 ng Tripsin: 50 mM ABC, ortalama bir Coomassie boyalı bant boyunca 5% asetonitril) ekleyin. Jel parçaları 10 dakika depoIayabiIirIer izin verin. Gerekirse jel parçaları karşılamak için sindirim tamponu yeterli ekleyin. 37 º C&#39;de inkübeO / N </li><li> Sindirim durdurmak ve jel parçalarından peptidleri özü,% 5 formik asit (% 50 asetonitril) (sindirim hacmi ile aynı hacim eklemek) ekleyin. 5-10 dakika için sonikasyon. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. Ekstraksiyon 3 kez tekrarlayın. </li><li> Liyofilizasyon (tercih edilir) veya (Speed-Vac veya Savant gibi) bir vakum yoğunlaştırıcı ile peptidleri kurutun. -20 º C&#39;de muhafaza </li><li> Kütle spektrometresi için örnek gönderin. Not: Sainsbury Laboratory (Norwich, UK) ile kütle spektrometresi tesisine bizim örnek sundu. Kütle spektrometrisi tesislerinde Protocols ölçüde değişiklik gösterir, ancak tipik olarak peptidler, tandem kütle spektrometrisi-püskürtücü elektro birleştirilmiş bir sıvı kromatografi sistemi üzerine yüklenmeden önce% 2 asetonitril ile% 0.2 trifloroasetik asit içinde çözülmüş olacaktır. </li></ol>

Yazarlar, (mali ya da diğer) herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

PAMPs ve efektörler tarafından reseptör aktivasyonunun mekanizmasını açıklamaya bitki bağışıklığının anlayışımıza büyük katkıda bulunabilir. Son 20 yıl içinde, genetik ve maya iki hibrit ekranlar PRRS ve NB-LRR proteinlerin keşfi için vesile olmuştur. Daha yakın zamanda, kütle spektrometresi tabanlı protokoller 55-58 işaret bağışıklık kendi PTMS 11,33,59,60 boyunca ayrı düzenlenmiş proteinlerin tanımlanması için kurulmuştur, immün komplekslerin 61 ve effektör bileşim 62 hedefliyor. Burada immün komplekslerinin aktivasyonu düzenleyen PTMS belirlenmesi için basit bir protokol açıklar. Daha önce tarif edilen protokol ile karşılaştırıldığında, bu protokol PTMS dinamik değişimlerin ayrıntılı belirlenmesini sağlar. Büyük ölçekli proteomiks yaklaşımların Protokolleri proteinlerin PTMS belirlemek ama sınırlamak nedeniyle PTMS site plastisite ortaya çıkarmak mümkün değildir olabilired protein miktarları. Protein fosforilasyon durumunda, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar tipik olarak sadece baskın fosforilasyon siteleri 11,33,59 belirlemek. Bir protein fosforilasyon durumunun detaylı karakterizasyonu sadece hedef proteinin 47 kısmi saflaştırılması yoluyla elde edilebilir protein bir miktar gerektirir. Protokol, saflaştırılmış proteinin kütle spektrometresi analizi ile, çiftler burada hedef proteinin önemli bir miktar veren bir protein saflaştırma bir yaklaşım tarif. Bu protokol ardından, Pto tek fosforilasyon olay, daha önceden açıklandığı gibi 52 Ser-198 ağırlıklı olarak atfedilen ancak bazı kütle spektrometresi spektrumları da Pr-195 veya Pr-199 üzerinde tek bir fosforilasyon olayı desteklenmiştir. Pto çift fosforlama etkinlik gözlenmiştir zaman başka sitelerde kombinasyonları da gözlenmiştir, ancak, fosforilli amino asitler baskın kombinasyonu (198 ve Ser-Thr-199 idiTablo 1). Bu sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilasyon yeri doldurulan malzeme ve ayrıntılı olarak mümkün olan tüm fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir. Bu protokolün en kritik adımlar şunlardır: proteinlerin 1) yeterli çıkarma; PTMS 2) korunması ve hedef protein 3) yeterli miktarda. İlk olarak, proteinlerin yeterli çıkarılması için, sıvı azot içinde doku öğütmek için ve daha sonra protokolde tarif edildiği gibi bir doku homojenleştirici kullanılması önemlidir. Bir doku homojenleştirici mevcut değilse, bir havan ve havaneli kullanılabilir. Bu, üç (veya dört) ekstraksiyon tamponu hacmi doku gram birinden bir oran kullanmak da önemlidir. Oranını ve öneririz yüksek mukavemetli tampon tampon Bu doku, pH çıkarma işlemi sırasında tarafsız kalmayı sağlayacaktır. Bu A için özel öneme sahip olduğu bulundu thaliana ve domates ekstrahiçbir zaman göz ardı 52. PTMS korunması tüm tampon PTMS kaldırabilir enzimlerin uygun inhibitörleri de dahil olmak üzere elde edilebilir. Bu 4 ° C&#39;de tüm adımları gerçekleştirmek ve tamponlar ve araçlar prechill da önemlidir. Hedef proteinin yüksek verimleri yeterli miktarlarda protein eksprese eden bitkiler kullanılarak, doku (yaklaşık 20 g), yüksek miktarda kullanarak elde edilebilir. Hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek için en önemli adımı, doğrudan immüno-çökeltme ile hedef proteinin konsantre edilir. Bu adımın önemi nedeniyle Yardımcı bağışık çökeltilmiş Pto (Şekil 2B) sınırlı miktarda bir Prf immunoprecipitation sonra Pto PTMS belirlemek için başarısızlık tarafından vurgulanır. Bunun aksine, Pto doğrudan immüno-protein dizisi ve PTMS (Tablo 1) tanımlanması nedeniyle yaklaşık% 80 içerisinde yol açan önemli ölçüde daha fazla ölçülebilir peptidler (Şekil 2C) vermiştir. Biz de strongly protein immunoprecipitation için epitop-etiketleri kullanmanızı öneririz. Proteinler, doğal epitop afinite matrisi karşı ortaya çıkartılan antikorlar ile karşılaştırıldığında, kısmen saflaştırılmış protein yüksek miktarlarda verebilir. Immüno-çökeltme için yerel Pto protein 51 (Şekil 2A) karşı ortaya çıkan bir antikor kullanarak, Pto iki baskın fosforilasyon siteleri tek tek fosforilasyonunu tespit etmek mümkün oldu. Bu protokol, esas olarak N. kısmi saflaştırılması için geliştirilmiştir benthamiana sitoplazmik protein ve fosforilasyon siteleri sonraki tespiti. Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen modifikasyonları kullanılarak, bu protokol kolayca A. için uyarlanabilir thaliana proteinler ve zara bağlı proteinler. Bu protokol ana amacı PTMS tanımlanması için hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek üzere ve karmaşık en yüksek saflık elde etmek için değildir. Eğer daha yüksek saflıktakompleks gereklidir saflaştırılması bir ikinci adım, bu protokol 52 eklenebilir. Bu durumda, bir ilk adım sert elüsyon koşulları gerektiren, yüksek tuzları veya asit kullanımı ve bir sonraki aşamada olmadan afinite matrisinden hedef proteinin elüsyon işlemi ise bir matris gerektirebilir sağlayacaktır. Biz sadece fosforilasyon sitelerinin tanımlanması için bu protokolü test edilmiş ve şu anda ek PTMS ayrıntılı tanımlanması için kabiliyetini test olduğunu olduğunu vurgulamak önemlidir. Bizim için temsili sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilleme alanı plastisite ve fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir. En önemlisi, kütle spektrometrisi ile ve oto-fosforilasyon siteleri tek bir nokta mutasyonu tarafından proteinlerin düşük miktarda güvenmek fosforilasyon siteleri kimlik kafa karıştırıcı sonuçlar verebilir vurgulamak. Biz burada daha önce göstermek 47 </sup&gt; Ser-Thr-198 ve 199 ile ilgili Pto bu çift fosforlama Prf / Pto kompleksinin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bunun aksine, daha önce yayınlanmış sonuçlar 47,63 Ser-Thr-198 ve 199 tek bir nokta mutasyonu kompleks aktivasyonu için bir önkoşul, bu siteye bu fosforilasyonunu gösteren işaret yeteneğine sahip olan, bu sitelerde fosforilasyonunu değildir önleyen, alanine göstermiştir . Bu sonuçlar, şu anda ikincil site Thr-195 fosforilasyonu ile açıklanabilir. Diğer protein kinaz fosforilasyon Alanı plastiklik içine Benzer fikir, bu protokol takip edilerek elde edilebilir. Ayrıca, fosforilasyon bölgelerini kullanan bir birleşik yaklaşım mutasyon, protein kinazların fosforilasyon yer plastisite evrimsel öneminin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır protein immüno ve kütle spektrometre analizleri ile bağlantılı olarak, özel kinazlarının (efektörler) inhibe edebilir proteinlerin etmektedir.

Bağışıklık yollar hızla sinyalleri iletmektedir ve bağışıklık tepkileri 1 aktif hale getirmek için protein çeşitli post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. PTMS protein yapısını, etkinlik, stabilite, yerelleştirme ve protein-protein etkileşimlerini 2-4 etkileyebilir protein yapısının hızlı, tersine çevrilebilir, ve son derece spesifik kimyasal değişiklikler bulunmaktadır. Bitkilerde, PTMS 300&#39;den fazla türleri ubikitinasyon, sumoilasyon, sülfasyon, glikosilasyon ve fosforilasyon 2,5 dahil olmak üzere tespit edilmiştir. Kanıt artan vücut bitki bağışıklık 1,5,6 farklı yönleriyle PTMS önemini vurgulamaktadır. Protein fosforilasyonu, bir serin bir fosfat grubunun tersine çevrilebilir bağlanma, treonin ya da tirosin Tortu, pek çok hücresel bir fonksiyon düzenleyici olup, şaşırtıcı bir şekilde çok yüksek cascades 5-11 sinyal bitki savunma PTM incelenmiştir. Fosforilasyon-bağımlı sinyal bitki defe ayrılmaz bir parçasıdırnse aktivasyon multidomain dayanıklılık proteinleri 5,8 ile transmembran reseptörleri tarafından mikropların hücre dışı algı, ya da hücre içi tanıma sonra başlattı. Bitkiler işgal üzerine, mikroplar örüntü tanıma reseptörleri (PRR&#39;ler) 12 denilen plazma zarı reseptörleri tarafından tespit edilir. Bilinen PRR reseptör-benzeri proteinler (RLPs) ya da reseptör-benzeri kinazlar (RLKs), her ikisi de bir ligand bağlayıcı ektoalan taşıyan ve tek-geçişli bir zar geçiş alanı ya da bulunmaktadır. RLPs aksine, RLKs bir hücre içi kinaz etki alanını 13-15 sahiptir. PRRS of ekto RLKs durumunda, hücre içi etki alanı 6, ​​16 içinde otofosforilasyon ve transfosforilasyonu için, patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPs) olarak adlandırılan lider korunmuş mikrop elisitör moleküllere bağlanır. PRRS algılama indüklediği fosforilasyon bölgesinin aşağısında, 17 kinazlar da dahil olmak üzere, sitoplazmik proteinler daha sonra fosforilasyon, </su&gt; 18 p, 19, E3 ligaz, mitojen tarafından aktive edilen protein kinazları (MAPK &#39;ler) 20, 21, kalsiyum-bağımlı protein kinaz (CDPK) PAMP tetiklenen bağışıklık (PTI) 22, 23 ve 24, transkripsiyon faktörleri, 25 yol açar. PRRS ile hücre dışı algı ek olarak, patojenlerin hücre içi sitoplazmik tanıma reseptörleri yoluyla elde edilir. Bu multidomain direnci (R) proteinlerinin değişken bir N-ucu alanı, merkezi bir nükleotid-bağlayıcı (NB) motifi, ve C-terminali lösin açısından zengin tekrarları (LRR) içerir ve bu nedenle NB-LRR proteinler 26, 27 olarak adlandırılır. R proteinleri, doğrudan veya dolaylı olarak da PRRS ve bağışıklık sisteminin diğer hedef düğümleri için bilinen efektörleri olarak adlandırılan bir patojen kaynaklı hastalık oluşturma molekülleri, tanır. Tanıma efektör-tetiklenen bağışıklık (ETI) 28-31 önde gelen güçlü savunma uyarmaktadır. NB-LRR proteinler müsadere varte NB alanı 30, 32 içindeki motif ATP-bağlama, ancak bunlar bir kinaz sahası yoksundur. NB-LRRS korunmuş etki fosforilasyonu, büyük çaplı bir proteomik diğer 33&#39;te rapor edilmiştir, ancak ETE ile ilişkisi açık değildir. Benzer şekilde PTI için, NB-LRR proteinlerin aktivasyonu MAPK 34-37 ve 38-40 gibi CDPKs sitoplazmik proteinlerin fosforilasyonuna yol açar. En önemlisi, efektör tanıma NB-LRR protein 41 ile doğrudan etkileşim aksesuar proteinlerin fosforilasyonunun yol açabilir. Bazı örnekler NB-LRR proteinleri ile etkileşen proteinleri RIN4 (Arabidopsis thaliana) ve Pto (domates, Solanum lycopersicum) arasında, RPM1 42, 43 ve 44, sırasıyla Prf. Pseudomonas syringae bakterilerin enfeksiyon esnasında, efektör protein AvrB, reseptör-benzeri kinaz RIPK 45, büyük olasılıkla, RIN4 fosforilasyonunu uyarır <sup&gt; 46. Benzer şekilde, domates P. syringae ve AvrPto AvrPtoB Pto 47 fosforilasyonunun uyarılması efektörler. , Bir kinaz sahasına sahip değildir ve trans-fosforile edilmiş olmalı RIN4 aksine, Pto oto-fosforilasyonu 48 ve alt tabakalar 49, 50 trans-fosforilasyonu sahip aktif bir kinazdır. Pto sinyallemesinin efektör bağımlı başlatılması için, bunun kinaz aktivitesini gerektirir, kinaz ölü Pto mutantlar yine bir efektör-bağımsız bir şekilde 51 in sinyal edebiliyoruz. Biz son zamanlarda Prf / Pto karmaşık çoklu Prf içeren, oligomerik ve Pto 52 molekülleri ve aynı kompleks içinde Pto molekülleri 47 birbirine trans-fosforilatlayabilen o göstererek bu gözlemleri açıkladı. Biz, Pto (sensör) bir molekül da ikinci Pto molekül (yardımcı) wit aktive olduğu NB-LRR protein (Prf) bir değişikliğe yol açan konformasyon, efektör protein ile etkileşime girdiği bir model önerilenkarmaşık hin. Daha sonra, yardımcı Pto molekülü sensör Pto karmaşık direnci 47 tam aktivasyonuna yol trans-fosforile eder. Bu örnekler efektör tanınması üzerine immün kompleks bileşenleri ve potansiyel PTMS belirleme sinyalleri aşağı hedeflerine efektör algı transdüksiyona nasıl daha iyi anlaşılmasına yol açabilir göstermektedir. Burada NB-LRR etkileşen proteinler ve bunların PTMS daha sonra tespit edilebilmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Bir model olarak Nicotiana benthamiana ve domates Prf / Pto kompleksi kullanarak, ancak aynı protokolü kolay N. ikinci RLKs uygulanabilir benthamiana ve A. küçük değişikliklerle thalianadan 53 biz protokolü dahilinde açıklamak gibi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

Bitkiler algı ayrıntılı nedeniyle değişen ortamlara ve sinyalizasyon sistemi ile hızlı bir şekilde adapte. Patojen atak sırasında Bitkiler, hızla immün komplekslerin toplama ve etkinleştirme ile enfeksiyona yanıt. Immün komplekslerinin aktivasyonu, fosforilasyon, glikosilasyon ya da ubikitinasyon gibi proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlar (PTMS) ile ilişkilidir. Bu PTMS koreografisini nasıl anlamak direnç elde edilir nasıl daha iyi bir anlayışa yol açacaktır. Burada nükleotid-bağlayıcı lösin açısından zengin tekrar (LRR-NB) etkileşen proteinleri ve post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) sonraki belirlenmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Küçük değişikliklerle, protokol diğer bitki protein komplekslerinin saflaştırılması için uygulanabilir. Yöntem, daha sonra kısmen saflaştırılır ilgilenilen proteinin, b bir epitop etiketli versiyonu ekspresyonuna dayanıry immüno ve etkileşen protein ve PTMS belirlenmesi için kütle spek-trometresine tabi. Bu protokol olduğunu göstermektedir: i.) Fosforilasyon gibi PTMS dinamik değişikliği kütle spektrometresi ile tespit edilebilir, ii). Bu ilgilenilen proteinin yeterli miktarda olması ve bu immünoçökeltme saflık eksikliği telafi edebilir önemlidir, iii). Ilgi konusu bir proteinin PTMS tespit etmek için, bu protein, protein yeterli bir miktarını elde etmek için imüno zorundadır.

Bu stabil bir transgenik A. etiketli proteinlerin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar thaliana çizgiler veya N proteinlerin geçici tanımlamadan sonra benthamina. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, hedef proteinin saflaştırılması etkileşen protein ve hedef proteinin PTMS belirlenmesine olanak sağlamak için, kütle spektrometresi ile birleştirilir. Protokol ve bitki bağışıklığının PTMS kimlik katılan proteinlerin saflaştırılması için tasarlanmıştır, ancak herhangi etiketli bitki proteininin saflaştırılması için uygulanabilir. Bir örnek olarak N arasından Prf / Pto kompleksinin kullanımı arıtma benthamiana. transjenik N. 35S benthamiana satır 38-12 54: Pto, geçici 35S ile transforme edildi: Prf-FLAG ve karmaşık anti-FLAG M2 agaroz (Şekil 2A) ile immüno-çökeltildi. Şekil 2A&#39;da imüno (IB)hedeflenen protein (Prf) çoğu imüno olduğunu göstermektedir. Pto ve etkileşen efektör protein AvrPtoB Prf ile copurified ve (Şekil 2A ve 2B) antikorları ve kütle spektrometre analizi ile tespit edildi. AvrPto ve 35S: AvrPtoB (Şekil 2A) Bu efektör 35S yapıları ile birlikte eksprese olduğunda Prf ile copurified Pto SDS-PAGE jeli üzerinde daha yavaş göç bulundu. Her iki efektör proteinler Prf etkileşen Pto (Şekil 2A) ve daha yavaş göç neden oldu. Bu fosfataz 44 ile işlenerek çıkarılabilir olabilir gibi Pto bu efektör tanıma bağımlı yavaş göç önce fosforilasyon atfedilmiştir. Pto yavaş göç katkıda fosforilasyon bölgelerini tespit etmek için, kütle spektrometresi analizi Prf copurifying Pto tabi tutuldu. Pto yüksek ifadesi ve İmmünoblotların ile kolay tespiti rağmen biz peptidleri c almak olabilirPto dizinin sadece% 57 overing ve herhangi bir fosforilasyon bölgelerini (Şekil 2B) tanımlamak için başarısız oldu. Daha sonra, anti-FLAG. N. ile Pto proteini hedef stratejileri değişti Prf-3HA ve 35S: Pto-FLAG, ya da 35S olmayan: AvrPto ve 35S: benthamiana WT bitkilerin geçici olarak 35S ile dönüştürülmüştür. AvrPtoB Prf-kompleks ile serbest formda hem de içeren Pto protein, toplam miktarı, immüno-çökeltildi anti-FLAG M2 agaroz ve SDS-PAGE fraksiyonasyon, in-jel triptik sindirim ve kütle spektrometrik analizi (Şekil 2C) tabi ile. Bu yaklaşımla onun dizisinin yaklaşık olarak% 80 ve bilinmeyen bir 100 kDa proteinini kapsayan etkileşim Pto peptidler belirlenmiştir. Biz, Pto peptidler 187-202 ve 188-202 (Tablo 1) için tek ve çift fosforilasyon bir dizi tanımlanır. Ser ve Thr-198-199, baskın fosforilasyon bölgeleri, ancak diğer pho idisphorylation siteler de tespit edildi (Tablo 1). Ser ve Thr-198-199 ile ilgili en önemlisi çift fosforlama sadece efektör protein (Tablo 1) ya da varlığında tespit edilmiştir. Yakın zamanda Pto fosforilasyon benzer bir dizi tanımlanır ve 47 sinyal için çift fosforilasyon olayın önemini gösterilen. Burada tarif edilen protokol izlenerek biz hedef proteinin fosforilasyon durumu dinamik değişiklikleri tespit etmek mümkün oldu. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> Şekil 1. Genel deney tasarımı. Hedef protein immüno-çökeltme (IP) için geçici Nicotiana benthamiana veya kararlı biçimde Arabidopsis thaliana, in planta etiketlendi ve ifade edilir. Protein çıkarılması ardındanHedef protein, bir afinite matrisi ile imüno-çökeltilir. Proteinler, elektroforez ile bir akrilamid jeli üzerinde ayrılır. Jel bantlar eksize edilir. Proteinler, jel bantları çıkarıldı ve kütle spektrometreye tabi tutulur. Fosforilasyon siteleri ve etkileşim proteinler tanımlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> Şekil 2. Prf ve Pto immunopresipitasyon. A). Yapı 35S: Prf-FLAG geçici 38-12 hattı (35S: Pto) olarak ifade edilmiştir boş vektör (EV) ile birlikte, 35S: AvrPto veya 35S: AvrPtoB. Üç gün sonrası infiltrasyon Prf anti-FLAG yakınlık matrisi kullanılarak immünopresipite edildi. ImmuPrf, AvrPtoB ve Pto için noblots (IB) yapıldı. Pto immunoblot panelinin altındaki oklar ile belirtildiği gibi, AvrPto ve AvrPtoB) Pto. Bir B yavaş göç neden olur. Yapı 35S: Prf-FLAG geçici 38-12 hattı (35S: Pto) olarak ifade edilmiştir boş vektör (EV) ile birlikte, 35S: AvrPto veya 35S: AvrPtoB. Üç gün sonra infiltrasyonu Prf anti-FLAG agaroz kullanılarak immüno-ve SDS-PAGE üzerinde ayrıldı. Jel, Coomassie Parlak Mavisi (CCBB) ile görünür Prf ile boyanmış, Pto ve AvrPtoB proteinler bantları jelden kesilip çıkarılmış ve kütle spektrometrisi ile analiz edilmiştir. Kütle spektrometresi ile tespit Pto ve Prf dizilerin yüzdesi peptid kapsama belirtilir. C) verdi. Yapıları 35S: Prf-3xHA ve 35S: Pto-FLAG geçici 35S ile birlikte ifade edildi: AvrPtoB, 35S: AvrPto veya N boş vektör (EV) benthamina. Üç gün toplam tutarı sonrası süzülmePto-FLAG agaroz anti-BAYRAK kullanarak immünopresipite ve SDS-PAGE çözüldü. Görünür Pto ve Pto-etkileşimli protein bantları jelden kesilip çıkarılmış ve kütle spektrometrisi ile analiz edilmiştir. Prf (oklarla gösterildiği gibi) biraz daha az görünür ise Pto ve 100 kDa Pto-etkileşimli protein bandı, koloidal Coomassie Brilliant Blue (CCBB)-boyanmış jel üzerinde açıkça görülebilir. IP: İmmunopresipitasyon; IB: Immunoblot; CBB: Koomassie Parlak Mavi boyama; CCBB: Coomassie Parlak Mavi boyaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Prf </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> Pto peptid 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [p T 195] HLSTVVK </td><td&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> Pto peptid 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [p T 199] VVK </td&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Peptidler 187-202 ve 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> İki fosforilasyon olayları ile peptidlerin yüzdesi </td><td> % 0 </td><td> % 26.9 </td><td> % 11.2 </td></tr><tr><td> Pto Dizi Kapsamı </td><td> % 78 </td><td> % 79 </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> Tablo 1, 35S sinyal aktivasyonu üzerine bir çift Pto peptidin fosforilasyonu:.. Prf-3xHA ve 35S: Pto-FLAG geçici em ile birlikte ifade edildiPty vektörü (EV), 35S: AvrPto ya da 35S: N. AvrPtoB benthamina. Üç gün sonra infiltrasyonu Pto-FLAG proteininin toplam miktarı, anti-FLAG afinite matrisi kullanılarak immüno-ve SDS-PAGE üzerinde çözüldü. Coomassie parlak mavi lekeli jel üzerinde Pto görülebilir bantlar kütle spektrometrisi ile çıkarıldı ve analiz edildi. Pto 0 ile özdeşleşmiş peptidler, 1 ve 2 fosforilasyon olaylarının sayısı belirtilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tamponların Tablo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L orta </td><td> Tripton </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> Maya özü </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> D-glikoz </td><td> 1 g / L </td></tr><tr><td> Agro-infiltrasyon tampon </td><td> MgCI2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> PH 5.5 &#39;e ayarlayın </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Asetosiringon (isteğe bağlı) </td><td> 150 uM </td></tr><tr><td> Tampon A </td><td> Tris-HCl pH 7.5 </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Gliserin </td><td> % 5 (v / v) </td></tr><tr><td> Tampon B </td><td> Tampon A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> % 2 (a / h) </td></tr><tr><td> Tampon C </td><td> Tampon B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Ditiyotreitol (DTT) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Plant proteaz önleyici kokteyl </td><td> % 1 (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> Fenilmetilsülfonil florid (PMSF) </td><td> 0.5 mM </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin A </td><td> 50 nM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum flüorür (NaF) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum molibdat (Na 2 MoO 4) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum ortovanadat </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td> Okadaik asit </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Tampon D </td><td> Tampon C PVPP&#39;nin olmadan </td><td></td></tr><tr><td> 5x SDS-PAGE yükleme tamponu </td><td> Tris-HCl pH 6.8 </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> % 2 </td></tr><tr><td></td><td> Gliserin </td><td> % 0.15 </td></tr><tr><td></td><td> Bromophenol Mavi </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td></td><td> DTT (kullanımdan hemen önce ekleyin) </td><td> 50 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Tampon ve medya tarifleri.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes at JoVE.com

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Görüntüleme.  University of Warwick.  Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir. 

Video: Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biyoloji

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...