Bettine Gibbs teknik yardım kabul etmek istiyoruz.

Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük bu protokol için tüm yordamları gerçekleştirirken her zaman giymek. Konteyner/tüpler fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif içeren yalnızca bir Sertifikalı hood ve dispose fenol atık belirlenmiş bir kap içinde açılan emin olun. Dnaz/RNAse-Alerjik steril tüpler, ipuçları ve Kimyasalları kullanın.
1. hücre kültürü
<ol><li>HeLa hücre satır ve iki süspansiyon manto hücre Lenfoma hücre hatları, Granta-519 ve Jeko-1, % 10 içeren DMEM büyümek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir kuluçka Hücreleri 1:10 sulandırmak ve parçacık sayaç14kullanarak say.</li>
	<li>RNA çıkarma için 500.000 hücreler/iyi 6 iyi plaka (2 mL medya iyi başına) plaka. 24 h için kuluçka sonra RNA hücrelerden toplamak.</li>
</ol>2. RNA çıkarma
<ol><li>Hücre hasat Not: Santrifüjü adım dışında bir doku kültürü hood kısırlık korumak için listelenen adımları gerçekleştirin.<ol>
<li>Süspansiyon hücreleri (Jeko-1 ve Granta-519):<ol>
<li>Hücreleri (birlikte medya 2 mL) 15 mL tüp için transfer ve 5 dk. aspiratı medya 1,725 x g, santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tüpün dibinde bırakın.</li>
			<li>Hücre Pelet 1 fosfat Buffered Saline (PBS) x 50 µL resuspend. Monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp her örnek ekleyin. Mix iyi ve her 1 dk. terk microcentrifuge tüp ters çevirme sırasında oda sıcaklığında (RT) 5 min için.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(HeLa) yapışık hücreleri için:<ol>
<li>Her şey hücre kültür ortamından Aspire edin. Enkaz yıkamak için her şey için PBS 1 mL ekleyin.</li>
			<li>PBS kaldırın ve her şey için monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL ekleyin.</li>
			<li>RT hafif sallanan ile 5 min için kuluçkaya. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre lizis<ol>
<li>Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı 1 h için-20 ° C'de dondurmak. Not: Mix-20 ° c gece veya ihtiyaç kadar bırakılabilir.</li>
		<li>Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı buz çözme. Kloroform 100 µL PCR başlıklı microcentrifuge tüp ekleyin. Girdap karışımı pembe ve opak kadar 10-15 s için örnek. Örnek 15 dakika (4 ° C'de) buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Örnek 20,800 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatli bir şekilde çıkarın üst renksiz sulu faz (~ 200 µL) ve yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA Yağış<ol>
<li>İsopropanol eşit bir hacmi her örnek için ekleyin. Coprecipitant 1 µL ekleyin (her bir taşıyıcı RNA olarak davranmaya örnek ve sonraki adımda RNA görselleştirmek yardımcı Malzemeler tablobkz:). Örnek-80 ° c en az 4 h için kuluçkaya. En iyi sonuçlar için gecede-80 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Örnek için soğutmalı santrifüj aktarın. 20,800 x g, 35 dk santrifüj / 4 ° C; RNA tüp altındaki mavi bir nokta görünür. Dikkatli bir şekilde alınan örneğin isopropanol çıkarın. 500 µL % 80 etanol ekleyin ve kısa bir süre için 3 vortexing tarafından Pelet resuspend s.</li>
		<li>5 dakika süreyle santrifüj örneği de RT 20,800 x g ' örnek tüm etanol kaldırın. Let örnek kuruması için RNAse free su 35 µL içinde örnek yaklaşık 10 dk. Resuspend. RNA tam çözümde olduğundan emin olmak 5 min için bir ısı blok (65 ° C) yerleştirin ve hemen tüp Buza koyun.</li>
		<li>Toplam RNA daha önce açıklanan, RNA Örnek 1,5 µL yerine 1 µL15kullanmak dışında bir Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirlemek. İsteğe bağlı olarak, toplam RNA'ın 1 µg RNA bütünlük belirlemek için % 1'özel jel üzerinde çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dnaz tedavi
<ol><li>Sonra miktar RNA'ın Dnaz tedavi genomik DNA aşağılamak için toplam RNA üzerinde gerçekleştirin. Her örnek için bir ayrı microcentrifuge tüp içinde karıştırın bir 20 µL Toplam tepki yapmak RNAse free Dnaz Takımı'ndan aşağıdaki reaktifler ekleyin:<ol>
<li>Mix 2 µL Dnaz 10, reaksiyon arabellek X 4,4 µg toplam RNA ile. Su ile 14 µL toplam getirmek.</li>
		<li>Dnaz RNase free 2 µL ekleyin. RNase inhibitörü (ters transkripsiyon takımı)'ndan 30 dakika 2 µL huzurunda 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Dnaz enzim devre dışı bırakabilirsiniz için 70 ° c 10 min için bir ısı blokta 2 µL çözüm durdurmak ve ısı ekleyin. Not: Dnaz tedavi seçime bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cDNA sentezi
50 µL son tepki hacmi için:
<ol><li>50 µL son tepki hacmi için: Transfer 22 µL Dnaz, yeni tüp veya transfer 4 µg yeni bir tüp için 22 µL toplam hacmiyle ekledi su ile toplam RNA'ın RNA tedavi. T7 oligo dT25 astar 2 µL 10 µM astar çözümden ekleyin. 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 sırasıdır T7 oligo dT25 astar için '.</li>
	<li>Ters transkripsiyon teçhizat--dan 2 µL RNase inhibitörü (20 U/µL), 5 x reaksiyon arabelleğinin 8 µL, 10 mM dNTPs 4 µL ve transkriptaz (200 U/µL) 2 µL ekleyin. Not: bir tepki ters transkriptaz olmadan bir negatif kontrol hareket için ayarlayın.</li>
	<li>42 ° c için 1 h. Transfer doğrudan buz kuluçkaya. Tüp 5 min için 75 ° C'de ısı ve tüp Buza koyun.</li>
</ol>5. Astar arama Fusion Gene transkript için
<ol><li>
Astar tasarım
	<ol>
<li>CDNA sıra Ensemble genom tarayıcı (ENST00000360839.6/NM_017747) indirmek ve hedef transkript (ANKHD1) akıntıya karşı kodonu ORF içinde bir bölge tanımlar. Kopyalama ve yapıştırma dizisi akıntıya karşı kodonu içine astar tasarım yazılımı sıra giriş bölgesi içeren tüm bölgenin (700 nukleotid) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Göster özel tasarım seçeneğini seçip 10 astar sayısı için sistem (sonuçlar dönmek için) üretmek ve tüm diğer parametreleri ayarla varsayılan olarak bırakın.</li>
		<li>Beş ileri astar ve örtüşmeyen iki ters astar seçin. Astar sipariş ve RNAse/Dnaz-ücretsiz su 10 µM son bir konsantrasyon ile yeniden oluşturma. PCR için genel astar tasarım hakkında daha fazla bilgi başka bir yerde kaplıdır16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR kullanılmak üzere sonraki 3' yarış potansiyel astar tanımlamak için Not: tepki olarak kullanmak için son ileri astar, tasarlanmış astar PCR başlıklı düzenli PCR ileriye ve geriye doğru astar farklı birleşimlerini ayarlayarak sınayın.<ol>
<li>CDNA (2 µL) taze 0.5 mL PCR tüp aktarın. 1 µL ileri astar ve 1 µL ters astar (bir çözümden 10 mM astar) ekleyin. İlâ 12.5 µL 8,5 µL nükleaz ücretsiz su ekleyerek getirin. 12.5 µL PCR jel Master Mix x 2 ekleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki PCR termal bisiklet koşullarını kullanın: 95 ° C için 2 dk ardından 29 devredir 30 95 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 1 dk. için 7 dk. 68 ° C'de son döngüsü ayarlamak.</li>
		<li>PCR sonra ürünler arasında etidyum bromür ile lekeli bir % 1'özel jel çalıştırın. Elektroforez ayrıntılarını daha önce bir kaç değişiklik17ile açıklanmıştır.<ol>
<li>Özel Tris-asetat (TAE) arabellekte bir 250 mL şişe 100 ml 1 g geçiyoruz. Bir mikrodalga fırında kaynatın.</li>
			<li>1 dakika serin ve etidyum bromür çözüm (10 mg/mL stok) 7.5 µL duman mahallede eklemek için izin. De şişeye dönen tarafından mix ve bir yatay jel aparatı dökün. RT duman mahalle kuvvetlendirmek jel izin vermek en az 30 dk için bırakın.</li>
			<li>Jel 1 x TAE arabellek ile kapak ve 10 µL PCR ürünü özel jel ile birlikte 3-5 µL DNA molekül ağırlığı merdivenin üzerine yükleyin. 10 dk. görselleştirmek için bir görüntüleyici kullanarak ürün 175 V çalıştırıyorsa ve daha fazla ürün ayrılması gerekiyorsa, ek bir 5-10 dk için jel.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İç içe geçmiş astar için 3' ırk seçimi
	<ol>
<li>Farklı, güçlü ve tek PCR müzik grubunuz mu var astar seçmek için PCR özel jel sonuçlarını çözümlemek. 5'-en astar kullanmak (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') ile birlikte çalıştırmak ilk PCR T7 oligodT25 astar.</li>
		<li>Nehrin aşağısında bulunduğu ilk astar iç içe geçmiş astar seçin (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') ve T7 astar ile kullanabilirsiniz (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR reaksiyonları ikinci kümedeki.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 3' yarış 3' UTR iki farklı enzimler kullanarak eşleştirmek için en iyi duruma getirme
Not: PCR için kullanılan DNA polimerazlar çeşitliliği bir artış olmuştur; Bu nedenle, farklı enzimler 3' için yarış PCR reaksiyonları kullanırken bile uygulanan standart koşullar belirlemek istedim. Herhangi bir transkript için ters astar sabit tutulur; Tek değişiklikler için hedef transkript özgü iç içe ileri astar bulunmaktadır.
<ol><li>
1:3 protokol ' den Pyrococcus furiosus (Pfu) değiştirilmiş DNA polimeraz kullanarak yarış
	<ol>
<li>İlk PCR<ol>
<li>CDNA 1 µL PCR tüp aktarmak ve 10 x Pfu tepki arabelleği 5 µL ekleyin. İlk iç içe ileri astar 1 µL, 1 µL T7 oligodT25 astar ve dNTPs 1 µL (10 mM eriyik--dan) ekleyin.</li>
			<li>49 µL Toplam hacim 40 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 1' de PCR profili kullanarak PCR çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İkinci PCR<ol>
<li>2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarmak ve 10 x PfuUltra II tepki arabellek 5 µL ile karıştırın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL, 1 µL T7 astar ve dNTPs (10 mM çözüm) 1 µL ekleyin.</li>
			<li>49 µL toplam reaksiyon cilt 39 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 1) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2:3 protokol ' için Pyrococcuserimiş bir DNA bağlayıcı etki oluşan chimeric DNA polimeraz kullanarak yarış-polimeraz PCR ana mix yazım denetleme gibi
	<ol>
<li>İlk PCR<ol>
<li>CDNA 1 µL PCR tüp aktarın. 1 µL ilk iç içe ileri astar ve T7 oligodT25 astar 1 µL ekleyin. En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin.</li>
			<li>25 µL PCR Master Mix x 2 ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 2' de açıklanan PCR bisiklet koşullarını kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İkinci PCR<ol>
<li>2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL T7 ters astar ile birlikte 1 µL ekleyin.</li>
			<li>En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin. 25 µL PCR Master Mix X 2 ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 2) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ikinci PCR ürünü olan 3' yarış doğrulayın.
<ol><li>Almak 5-10 µL ikinci PCR ürünü (yanı sıra ürün Eğer transkript bol ifade PCR ilk turda) ve bir özel jel kaçıyor. Jel ayarla ve daha önce açıklandığı gibi Elektroforez (Adım 5.2.3.1-5.2.3.3) çalıştırın. Bir Imager sonuçlarına görselleştirin.</li>
</ol>8. ürün arıtma ve sıralama
<ol><li>Jel ve PCR parçası DNA temizleme sistemi başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanarak ikinci PCR jel PCR Urun arındırmak.</li>
	<li>Sanger gerçekleştirmek sıralama (alternatif olarak, jel saf PCR ürün örnekleri ve uygun sıralama astar bir sıralama laboratuara gönder). Sanger sonra sıralama verileri analiz sıralama.</li>
	<li>Sıra analiz yazılımı indirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve izleme dosyaları yazılım alın. Kullanım bireysel saf Bankası QVs (Kalite Bankası elde etmek için değerler) bilgi18ara. Kromatografik ile yüksek kaliteli izlemeler görüntülemek için indirin. İsteğe bağlı: Jel arıtılmış ürün uygun bir klonlama kiti ve Sanger için gönderilen izole klonlar kullanma klonlanmış sıralama.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+mRNA+processing:+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease.">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals.">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+3&#8242;+cDNA+ends+(3&#8242;-RACE).">Rapid amplification of 3&#8242; cDNA ends (3&#8242;-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function.">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li><li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Biology+in+Medicine:+The+polymerase+chain+reaction:+the+revolution+within.">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li><li>Bertioli, D., White, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+cDNA+ends.">Rapid amplification of cDNA ends.</a> PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).</li><li>Freeman, L. A., Freeman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5'+and+3'+RACE.">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).</li><li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1/MRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma.">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li><li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma.">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li><li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+conjoined+genes:+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes.">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).</li><li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer.">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters.">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data.">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li><li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+better+probes:+Effect+of+probe+size,+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays.">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li><li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays.">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li><li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hairpin+structure+on+PCR+amplification+efficiency.">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li><li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-template+polymerase+chain+reaction.">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir gen gen olarak büyük paralel sıralama teknolojileri gelişiyle rağmen 3' yarış PAS ve nükleotid Poli(a) kuyruğu bitişik tanımlamak için en kolay ve en ekonomik yöntem kalıyor. Burada açıklanan adaptasyon kullanarak 3' yarış hem yükseltmek ve ORF, kodonu ve tüm 3' UTR ANKHD1 mRNA transkript, bir bölümünü içeren dizileri eşlemek için genişler. 3' yarış bir büyük avantajı birkaç küçük uyarlamalar ile diğer vektörel çizimler aşağı akım sorgulama işlevinin miRNA hedefle...

3' ucu oluşumu pre-mRNA aşağı Poli(a) kuyruğu1,2olun ~ 250 untemplated adenines ilavesi ve ardından bir pas bölünme oluşur mRNA olgunlaşma önemli bir adım var. Poli(a) kuyruğu Poli(a) bağlayıcı protein (PABP) bağlanır ve bu mRNA transkript bozulma korur ve çeviri1kolaylaştırır.
Mevcut tahminlere insan genlerinin % 70'i birden çok giriş ve böylece alternatif Poliadenilasyon, birden fazla 3' biter3' te sonuçlanan geçmesi öneririz. Böylece, nerede Poli(a) kuyruğu kalan 3' UTR verdiği tanımlamak gibi PAS tarafından verilen herhangi bir transkript kullanılan belirlemek önemlidir. Yeni nesil sıralama gelişiyle 3' eşzamanlı kimliği içinde UTRs ve genler binlerce PASs sonuçlandı. Bu artış sıralama özelliği, 3' uç alternatif Poliadenilasyon içeren verileri çözümlemek için bioinformatic algoritma geliştirme gerektirmiştir. De novo algılama veya PAS doğrulanmasını ve dolayısıyla 3' ucu bireysel genlerin büyük ölçekli sıralama veri eşleme için 3' yarış yönteminin seçimi4,5kalır. Normalde, 3' yarış cDNA ürünleriyle birlikte sıraları yalnızca bir bölümünü 3' Poli(a) kuyruğu, bölünme sitesi, PAS ve akıntıya karşı dizisi PAS içerir UTR'nin içerir. Tasarım ve gen belirli ileriye ve geriye doğru astar kullanımını gerektiren PCR 3' yarış sadece iki gen belirli iç içe ileri astar gerektirir. Dolayısıyla, PCR nükleotid dizisi güçlendirilmiş4,6olmak gen büyük bir bölgeye ilişkin daha ayrıntılı bir bilgi gerektirir. 3' yarış başlandığından beri aynı Poli(a) kuyruğu poliadenile RNA transkriptlerinizin için hedefleri, yalnızca ileri astar gen belirli, böylece, yalnızca mRNA önemli ölçüde daha küçük bir bölge bilgisi gerektiren gerekir astar ters. Bu kimin dizileri değil tam olarak karakterize4,7olan bölgelerdeki amplifikasyon sağlar. Bu 3' yarış sadece bir gen 3' sonu belirlemek için aynı zamanda belirlemek ve büyük bölgelerinde akıntıya karşı önemli bir kısmını 3' UTR formu PAS karakterize için kullanılmak üzere izin verdi. 5' ile değiştirilmiş 3' büyük bazı bölümleri 3' UTR ve kanat bölgeleri içeren yarış yarış birleştirerek, tamamen sıra ya da onun 3' son85' uç üzerinden tüm bir mRNA transkript klon mümkündür.
Son kimliği roman CCND1-MRCK füzyon gen transkript Mantle hücreli Lenfoma hücre satırlarından ve kanser hastaları bu uygulanması değiştirilmiş 3' yarış bir örnektir. 3' UTR üzerinden CCND1 ile MRCK gen dizilerinin oluşuyordu ve miRNA Yönetmeliği9' a inatçı. İki iç içe geçmiş CCND1 belirli ileri astar hemen bitişik ve CCND1 kodonu aşağı bölgeye tamamlayıcı. Her ne kadar bütün transcriptome sıralama belirli bioinformatic araçları ile birlikte gene füzyon103' UTR içinde algılamak için kullanılan, birçok labs mali kaynak veya yapmak için bioinformatic uzmanlık eksikliği bu teknoloji kullanın. Bu nedenle, 3' yarış de novo tanıma ve onaylama 3' UTR içeren roman füzyon genlerin yerine kullanılabilir. Köklü bildirilen füzyon genlerin sayısını artırmak gibi transkript okuma göz önüne alındığında, 3' yarış gen dizileri11,12karakterize güçlü bir araç haline gelmiştir. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu farklı diziler içinde 3' UTR yanı sıra uzunluğu 3' UTR mRNA transkript istikrar, yerelleştirme, translatability ve işlev13etkileyebilir göstermiştir. Kısmen artan ilgi nedeniyle transcriptome eşleme, orada laboratuar olarak kullanılmak üzere geliştirilen farklı DNA polimerazlar sayısındaki bir artış olmuştur. Ne tür değişiklikler 3' için DNA polimerazlar kullanılabilir repertuar yararlanmak için sipariş yarış protokolünde yapılabilir belirlemek önemlidir.
Bu eser 3' tüm 3' UTR eşlemek için yarış uyum raporları, PAS ve 3' sonu bölünme bir site kullanarak ANKHD1 transkript astar transkript ve iki farklı DNA polimerazlar ANKHD1 bölümünde iç içe geçmiş.

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

Ökaryotik mRNA'ların olgunlaşma Poli(a) kuyruğu ilavesi içerir 3' son oluşumu içerir. Bir gen 3' sonu eşlemek için geleneksel seçim 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) yöntemidir. İletişim kuralları için 3' yarış dikkatli tasarım ve ilgi hedef gen 3' Çevrilmeyen bölgesi (3' UTR) içinde iç içe geçmiş astar yelpazesi gerektirir. Ancak, bir kaç değişiklik ile protokol tüm 3' UTR ve dizileri ORF ve 3' UTR ilişkisi, daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan açık okuma çerçevesi (ORF), içinde eklemek için kullanılabilir. Bu Poliadenilasyon sinyal (PAS), yanı sıra yanı sıra geleneksel 3' tarafından yarış sağlanan dilinim ve Poliadenilasyon site kimliğidir. Genişletilmiş 3' yarış alışılmadık 3' UTRs içinde 3' UTR, gen füzyon dahil olmak üzere, algılayabilir ve sırası bilgi AU transkript kararlılığını etkileyebilir öğeleri istikrarsızlaştırıcı zengin yanı sıra potansiyel miRNA bağlayıcı siteleri tahmin etmek için kullanılabilir.

İç içe geçmiş ileri astar arama:
Özel jel Şekil 1 , hangi kullanım aynı ama farklı ters astar astar ileri iki ayrı PCR jel ürün (şerit 1 ve 2) gösterir. Lane 3 ayrı bir PCR ürünü ve farklı ileriye ve geriye doğru astar vardır. Dayalı PCR reaksiyon için kullanmak için ideal astar bir ayrı PCR ürün (Lane 3) vermek bunlar. Şerit 1 ve 2 kullanılan ileri astar ...

Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.3K Görüntüleme.  Butler University. İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.

Video: Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Kanser Araştırmaları

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Nörobilim

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biyoloji

Oncogene Expression Analysis with Alterations in pH in a Pancreatic Ductal Cell Line

The fourth leading cause of cancer-related death, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has a 12% five-year survival rate. This disease has a poor prognosis and is characterized by a rigid stromal microenvironment, which represents a tangible challenge in its treatment. Chronic pancreatitis patients have a 10-fold greater risk of developing PDAC; in these patients, the ductal pH decreases from pH 8.0 to pH 6.0 due to bicarbonate insufficiency and the inflammatory milieu. Our goal was to understand the role of the acidic environment observed in chronic pancreatitis on oncogene expression in a pancreatic ductal cell line.
Therefore, 80% confluent human pancreatic ductal epithelial cells were incubated at pH 6.0 to pH 7.2 for 6 h. Total RNA from the cells was processed to enrich the total mRNA in the samples. Gene expression was evaluated via next-generation sequencing (NGS) of biological replicates. RNA-seq analysis was carried out with the aid of an online tool, and the differentially expressed genes (FCs &#60; &#177; 2.0) were identified; there were 90, 148, and 109 upregulated genes and 20, 14, and 23 downregulated genes at pH 6.0, 6.5, and 7.0, respectively. Four oncogenes were upregulated at pH 6.0, seven were upregulated at pH 6.5, and seven were upregulated at pH 7.0. The common genes that were upregulated at pH 6.0, pH 6.5, and pH 7.0 were lymphocyte cell-specific protein-tyrosine kinase (LCK) [pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], FGR proto-oncogene, Src family tyrosine kinase (FGR) [pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09], and ArfGAP With SH3 domain, ankyrin repeat, and PH domain 3 (ASAP3) [pH 6.0, FC: 2.37; pH 6.5, FC: 3.84; pH 7.0, FC: 2.51]. The acidic environment triggers the activation of proto-oncogenes, which may trigger tumor initiation in chronic pancreatitis.

This study describes a protocol for exploring the effects of altered pH on oncogene expression via RNA-seq analysis of a pancreatic ductal cell line.

Pankreatik Duktal Hücre Hattında pH Değişiklikleri ile Onkogen Ekspresyon Analizi

The fourth leading cause of cancer-related death, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has a 12% five-year survival rate. This disease has a poor ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Tıp

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
...