Havuz tasarımı ve oligo kurtarma <ol><li> Incelenmesi gereken ilk adım, pre-mRNA havuzu tasarımı. Bu UCSC Genom Tarayıcı kullanarak ve belirli genler, ek kavşaklar, ya da diğer ilgi alanları indirme yapılabilir. </li><li> Ilgi pencereler seçildikten sonra, onlar karşısında kiremit hesaplama aşağıdaki koşullar kullanılarak okuma süresini, bu nedenle her oligo önceki 20 nükleotidler kaydırılır bir 10 nükleotid örtüşme, 30 nükleotid olmalıdır. * Oligo örtüşme yeterli kapsama sağlamak için ek sitelerine yakınlığı artan olmalıdır; 10 20 nükleotidler örtüşme artırarak bunu başarabilirsiniz. </li><li> Havuz downstream yükseltmek için kullanılan olacak evrensel astar dizileri, her biri 30 nükleotid oligo Kanat. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir. </li><li> Mikroarray yüzeyinden DNA oligos kurtarmak için bir dizi hibridizasyon odasında dizi kapak slayt slayt üzerine yerleştirerek ve hafifçe 500 mcL dH 2 O pipetleme başlamak </li><li> Sandwich kapağını kaydırarak üstüne dizi, süreci bozabilir hava kabarcıklarını önlemek için özen. Oligos ile yan su yüzeyine dokunarak böylece dizi yüz aşağı yere emin olun. Başparmak bir kural dizisi üzerinde Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi karşı karşıya olduğu &quot;Agilent dokunur Agilent&quot; anlamına </li><li> Hibridizasyon odasına kapatın ve bir melezleşme fırında 99 ° C&#39;de gece boyunca döndürmek. </li><li> Ertesi gün, dikkatle odasından dizi kaldırmak ve oligos dizi yüzey kurtuldu içeren su, çekmek. Bu oligo havuzu </li><li> Havuz için 1.5 ml Eppendorf tüp 3-5 ikinci bakliyat yerleştirin ve% 50 genlik havuzu sonikasyon </li><li> Sonra, sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler kullanılarak, düşük devir PCR ile havuz yükseltmek. Için ilk turda 94, doğasını ° C 1 dakika 20 saniye boyunca 55 ° C&#39;de tavlama ve 72 az 1 dakika için uzatıyoruz ° C. Bir sonraki tur için, 10 saniye, 20 saniye ve 10 saniye 72 az 5 dakika nihai bir uzama adım ° C ile ilgili her sıcaklıkta Havuz yükseltmek için gerekli döngülerinin sayısını oligo kurtarma etkinliğini bağlı olduğundan, birden fazla döngüsü numaraları denemek için gerekli olabilir. Bulaşmış bir akrilamid jel üzerinde bir grup tarafından anlamına havuzu, aşırı yükseltmek için dikkatli olun. PCR amplifiye örnekleri gerekli ° C ye kadar 4 saklanabilir. </li><li> Oligo hazırlanmasında son adım Ambion MEGAshortscript ™ kiti kullanılarak RNA yazıya. * Aşağıdaki protokol Ambion adapte edilmiştir <ol class="lalpha"><li> Oda sıcaklığında T7 10x Reaksiyon Tamponu, dört ribonukleotid çözümler su ve buz üzerinde T7 Enzim Mix tutarken çözülme </li><li> Reaksiyon karışımı oda sıcaklığında bir RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüp birleştirin. Reaksiyon tamponu Bileşenleri tepki buz üzerinde işlendiği takdirde DNA çökelmesine neden olabilir. </li><li> Aşağıdaki sırayla, pipet 3 mcL nükleaz içermeyen su, 10x reaksiyon tamponu 2 mcL, her 75 mM NTP çözüm 2 mcL, 5 mcL (PCR amplifiye oligo havuzu) DNA ve 2 T7 enzim mcL 20 mcL son hacim </li><li> Tüp, ardından kısa bir süre tüpün alt karışımı toplamak için mikrofuge&#39;de reaksiyon karışımı hafifçe vurun. </li><li> Bir PCR reaksiyonu 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon süresi şablon bağımlı olacaktır, bu nedenle, maksimum verim için en uygun inkübasyon süresi belirlemek için bir süre ders deney kullanmak için gerekli olabilir </li><li> 2 saat sonra, ek bir 15 dakika için 37 reaksiyon ve inkübe Turbo DNaz 1 mcL ekleyerek ° C DNA kaldırmak </li><li> Reaksiyon feshedebilir ve RNA, fenol / kloroform ekstraksiyon ve etanol yağış kurtarmak. <ol class="lalpha"><li> 20 mcL reaksiyon hacmi için 115 dH 2 O mcL ve reaksiyon 3 M sodyum asetat 15 mcL ekleyin. </li><li> Asidik fenol ve kloroform 75 mcL 75 mcL ekleyin sonra iyice karıştırın. 13.000 rpm hızında oda sıcaklığında bir dakika sonra mikrofuge&#39;de, vorteks çözüm karıştırın. Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve çıkarma tekrarlayın </li><li> Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve kloroform 150 mcL ekleyin. Vorteks, daha önce olduğu gibi karışım ve santrifüj. Yeni bir tüp sulu aktarın. </li></ol></li><li> % 100 soğuk etanol iki cilt sulu katman ekleme ve iyi karıştırma RNA kurtarın. -20, 15 dakika en az karışımı soğutun ° C daha sonra 4 santrifüj ° C maksimum hızda 15 dakika boyunca pelet RNA. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 0.1x Tris-EDTA (TE) Tampon 105 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin .. </li></ol></li><li> Bu, tüm serbest nükleotidler T7 Kit tepki kaldırmak için en doğru sonuçları, RiboGreen kullanarak RNA miktarını zordur. <ol class="lalpha"><li> Kantitatif başlamak için, ilk 2.300 mcL + 50μL/sample yeterli 1x TE sulandırmak. </li><li> Sonra, RiboGreen olun. 1000 gerekecektir mcL + 50 mcL / örnek. Yüksek oranda örnekleri (1 mcg / ml ile 20 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:200 karışımı, düşük aralık örnekleri için (50 ng / ml &#39;ye 1 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:2000 karışımı ; Pipet opak bir plaka her kuyuya RiboGreen çözüm 50 mcL, A1 ile başlayan ve aşağı hareket değil, karşısında </li><li> 2 yüksek oranda numune veya 100 ng / mcL düşük aralık örnekleri için mikrogram / ml RNA stok çözeltinin </li><li> Orijinal 2 mcg / ml veya 100 ng / ml stok altı sonraki 01:02 dilüsyonları stok çözümlerini kullanarak, standart bir eğri oluşturmak; PCR şerit tüpe stokunun Pipet 240 mcL. Kalan 7 tüpleri, pipet 1x TE 120 mcL. RNA stok 120 mcL alın ve tüp 2 ile karıştırın. Tüp 2 120 mcL alın ve tüp 3 ile karıştırın. Tüp 7 kadar tekrarlayın. Tube 8 sadece TE olacak ve boş olacaktır. Opak levha, A1, standart eğri çözümler Pipet 50 mcL: H2 (eğri iki kez çalıştırmak) </li><li> Yeni bir tüp, oligo havuzu 5 mcL TE 45 mcL karıştırın ve 50 mcL RiboGreen, içerir iyi 50 mcL ekleyin. </li><li> Bir plaka okuyucu kullanarak bir dalgaboyu 485 nm ve 530 nm emisyon dalga boyu ile bir dakika karıştırın, sonra üst floresan okumak ve plaka okuma için makineyi </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir kurtarılan RNA ölçmek için oluşturulan standart eğrisi, kullanın </li></ol></li></ol> Bir ilgi RNP oligo havuzu Co-immunoprecipitation <ol><li> Co-immunoprecipitation başlamadan önce protein, A ve G Dynabeads Invitrogen gelen protein reaksiyon başına 50 mcL son hacmi 1:1 oranında karıştırılarak hazırlar. Örneğin, iki reaksiyon için 50 mcL her boncuk her eklersiniz. </li><li> Süpernatantı eşit hacimli soğuk 1x PBS ile iki kez kaldırmak ve boncuklar yıkayın boncuk yerde tutmak için Novagen bu gibi bir Manyetik Ayırma Stand kullanın </li><li> İkinci yıkamadan sonra, soğuk 1x PBS eşit hacimde boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin ve 2 ng başına antikor reaksiyonu ekleyin. Bu miktar antikor bağlı olarak değişebilir, deneme optimal koşullarda bulmak için gerekli. </li><li> 4 antikor / boncuk karışımı bir gecede inkübe dönen bir platform üzerinde ° C </li><li> Sabah, non-spesifik bağlama engellemek için sonicated maya toplam RNA reaksiyon başına 2 mg ve 4 ek bir 30 dakika çevirin ° C </li><li> Boncuk tutmak için manyetik raf kullanarak, tüp içinde ikinci yıkama PBS bırakarak, soğuk 1x PBS ile iki kez süpernatant kaldırmak ve boncuk yıkayın. </li><li> Yeni tüpler, her bir tüpe her reaksiyon ve boncuk karışımı kısım 50 mcL çıkartın. Bir ana karışımı hazırlarken boncuk oturup </li><li> Her reaksiyon hacmi 120 getirmek için 200 ng oligo havuzu, koruma primerlerin ekimolar oranı, 2 mg sonicated maya toplam RNA, 20 mcL HeLa nükleer ekstresi (bu RNP kaynak) ve tampon E eklemek mcL. Koruma astarlar evrensel primerler RNA sürümleri. Sipariş transkripsiyon sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler şablonları, daha sonra MEGAshortscript ™ Kit kullanarak şablonlar RNA yazıya. </li><li> Ana karışımı 120 mcL ve tekrar süspansiyon boncuk boncuk alikotları süpernatantı. 4 ° C&#39;de 1-2 saat süreyle Rock reaksiyonlar. </li><li> Inkübasyondan sonra, her bir reaksiyon için, bir &quot;toplam&quot; RNA örnek için küçük bir kısım (boncuklar dahil) kaldırmak </li><li> Manyetik ayırma stand reaksiyonlar kalan koyun ve süpernatantı kaldırmak. Örnek downstream üzerinden akış, bu analiz için gerekli olmamasına rağmen, bunu kaydetmek için yararlı olabilir. </li><li> Soğuk 1x PBS 50 mcL boncuklar 1-2 kez yıkayın. Boncuk üzerinde antikor bağlı RNA &quot;IP&quot; örnek. </li><li> 0.1x TE tampon% 1 SDS 50 mcL &quot;toplam&quot; ve &quot;IP&quot; boncuk süspanse edin ve 65 ° C&#39;de 15 dakika süreyle RNA Zehir örnekleri ısı. </li><li> Şimdi daha önce boncuk bağlı ve fenol / kloroform ekstraksiyon etanol yağış takip, temiz RNA içerir süpernatantı çıkarın. Kuru pelet ve 50 mcL 0.1x TE tampon tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> Ters transkripsiyon ve co-IP örnekleri amplifikasyon aminoallyl etiketleme için hazırlık <ol><li> Sonra, RNA örnekleri ters transkripsiyonu ve PCR amplifiye olmalıdır. Ters transkripsiyon reaksiyonu için, ters evrensel primerler kullanın. </li><li> Her örnek için, 1 mcL karıştırma başlar1 mcL şablonu RNA ters evrensel astar (immunoprecipitation tepki) ve dH 2 O 10 mcL Reaksiyonlar 70 ° C 5 dakika buz üzerinde soğutun ya da 4 tutmak ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> Örnekleri serin olsa da, şu ana karışımı olun. Her reaksiyon için 10 mM dNTP 4 mcL, 2 mcL 10x Arrayscript tampon, 1 mcL RNaz inhibitörü, 1 mcL ters transkripsiyon enzim birleştirir. İyice karıştırın ve her ters transkripsiyon reaksiyonu ana karışımı 8 mcL ekleyin. </li><li> 95 numuneler 42 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe ° C, daha sonra 5 dakika boyunca 4 ° C örnekleri amplifikasyon için gerekli olan kadar. PCR makinesi kullanın. </li><li> RNA örnekleri ters transkripsiyon sonra, PCR, bir T7 etiketi içeren primerler biri ile evrensel primerler kullanarak onları yükseltmek. Birden fazla döngüleri denemek için gerekli olabilir, böylece havuz yükseltmek için gerekli sayısı döngüleri ortak IP verimliliğine bağlı olacaktır. Her reaksiyon 10x Taq reaksiyon tamponu, her astar (100 mM), cDNA şablon 1 mcL (ters transkripsiyon reaksiyonu), 10 mM dNTP 1 mcL dH 2 O 42.2 mcL 0.2 mcL 5 mcL gerektirir ve Taq enziminin 0.4 mcL. PCR örnekleri, 3 dakika boyunca 94 ° C&#39;de inkübe başlayın. Sonra, her döngüsü, 94 doğasını ° C 45 saniye, 30 saniye boyunca ° C 55 tavlama ve 72 ° C&#39;de 10 dakika için son bir uzama, bir dakika için 72 ° C&#39;de uzatıyoruz. </li><li> Sonra, MEGAshortscript ™ Kit kullanarak tekrar örnekleri yazıya, ancak, bu kez 2 aminoallyl UTP mcL eklemek yerine, T7 UTP. Aminoallyl UTP Cy boyalar ile RNA etiketlemek için kullanılır. </li><li> Fenol / kloroform ve etanol örnekleri hızlandırabilir. Glycoblue veya amonyum asetat kullanmayın, her ikisi de dizi örnekleri melezleşmesi engel olabilir. 4.5, 0.1 M sodyum karbonat mcL pelet ve tekrar süspansiyon kurulayın. </li></ol> Amino-Cy Boyalar RNA alil etiketleme <ol><li> Etiketleme protokol DMSO 45 mcL, floresan boya, cy3 ve Cy5 her çözülür başlamak için. Işık önlemek için, karanlıkta, alüminyum folyo ve -20 ° C&#39;de deposunda tüpler sarın </li><li> Örnekleri RNA 2.5 nükleaz içermeyen su mcL ekleyin ve iyice karıştırın </li><li> Sonra, &quot;IP&quot; örnek &quot;toplam&quot; örnek Cy3 3 mcL ve Cy5 3 mcL ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta inkübe, Cy-5 maviye dönecek iken Cy-3 örnek, kırmızı ya da pembe dönecek. </li><li> Reaksiyonu sonlandırmak için, her numune 6 uL 4 M hidroksilamin-HCl ekleyin, iyice karıştırın ve kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> 0.1x TE 50 mcL etanol yağış ve tekrar süspansiyon pelet takip fenol / kloroform ekstraksiyon etiketli örnekleri arındırın </li></ol> Agilent Dizi Hibridizasyon Kiti kullanarak mikroarray örnekleri melezleşme <ol><li> 10x engelleme tampon, 140 mcL mcL nükleaz içermeyen H2 O Cy3 etiketli &quot;toplam&quot; havuz, Cy5 etiketli &quot;IP&quot; havuz 25 mcL 25 mcL, 10, 50 mcL yavaşça karıştırarak hibridizasyon başlayın 25x parçalanma tampon ve 2x hibridizasyon tamponu 250 mcL, kabarcıklar tanıtan önlemek için özen gösterin. Kısaca, tüp altında çözüm toplamak ve kabarcıkları azaltmak için de örnek mikrofuge&#39;de. </li><li> Hibridizasyon odasında o-ring kapağını kaydırarak yerleştirin ve dikkatli bir slayt üzerine çözüm pipetle. </li><li> Algılama dizisi &quot;sandviç&quot; çözüm kapağını kaydırarak üstüne yerleştirin. Dizi Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi bakacak şekilde yönlendirmek dizi slayt unutmayın. </li><li> Kelepçe hibridizasyon odasında slayt / dizi sandviç ve 50 ° C&#39;de 3 saat boyunca döndürün. </li><li> Dizi dönen iken, 50-ml konik tüpler aşağıdaki 50 ml çözüm: Bir konik dH 2 O, ayrı bir tüp içinde iki 1x SCC tampon çözeltiler, her, bir 2x SCC tampon 50 ml ile dolu. </li><li> Üç saatlik inkübasyondan sonra, dikkatli bir dizi / slayt sandviç çözülme ve 2x SCC tampon içeren 50 ml konik yerleştirin. Bir cımbız kullanarak, yavaşça kapağını kaydırarak dizinin ayrı ve kapağını kaydırarak dışarı doğru çekin. Slayt çekilir gibi dizi temas için dikkatli olun. Konik kapatın ve 60 saniye boyunca yavaşça ters çevirin. </li><li> Cımbız kullanarak, 1x SCC çözümü için dizi transferi, tüp kap ve hafifçe dizinin ikinci 1x SCC çözüm transferi ve 1 dakika sonra tekrar yavaşça bir dakika için ters ters. </li><li> Son olarak, dH 2 O tüp dizi transferi ve 30 saniye boyunca yavaşça ters çevirin. </li><li> Dizideki bir Kimwipe slayt kenarları koyarak kurulayın. Devam dizi döndürmek için oligos içeren yan bozmayacak emin olun silin. </li><li> Kuru dizi yerleştirin.Mikroarray tarayıcı ile boş bir 50 mL konik tüpü ve tarama </li></ol> Mikroarray yorumlama <ol><li> Mikroarray tarayıcı dizi TIF görüntü yaratacaktır. Agilent Feature Extraction yazılımı aracılığıyla bu görüntüyü kullanarak, özel havuzu benzersiz ızgara dosya (Agilent tarafından sağlanan) çalıştırın. </li><li> Agilent yazılımı bir Perl betiği ile ayrıştırılır bir dosya oluşturmak için her özellik sinyal yorumlayabilir. Her özellik sinyali o kanalda toplam yoğunluğu normale. Yeşil kanal belirli bir özelliği Örneğin, bireysel özellik için yeşil kanal yoğunluğu tüm özellikleri üzerinde yeşil kanal toplam yoğunluğu ile ayrılır. Nihai çıkış dizinin her özelliği yeşil kanal üzerinden kırmızı kanalın günlük oranıdır. </li><li> Mikroarray oligo havuzu veri bir resim elde etmek için genomuna yeniden eşlenir ve ne kadar güçlü, ilgi RNP bağlı olabilir. </li></ol> Şekil 1. Deneysel şematik <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" /> A. şeması Fayansları. Seçme ve pre-mRNA dizileri faiz indirirken sonra, seçerek alan 10 nükleotid artışlarla vardiya 30 nükleotid pencereler ile döşenir. Evrensel astar bağlayıcı siteleri kanadını pencerenin her iki tarafında. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" /> B. Sentez dizi. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Şekil 1c" /> C. Co immunoprecipitation. Dizi kapalı oligos kaynatıldıktan sonra, HeLa nükleer özü de inkübe, daha sonra ilgi RNP karşı bir antikor ile hazırlanmış manyetik boncuk özü ekleyin. Cy3 ile başlayan oligo havuzu ve Cy5 bağlı IP havuzu Etiket ve algılama dizi ve tarama için geçerlidir. Şekil 2. Annotating genomu ve zenginleştirme veri analizi. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> A. Convert ortalama dizi veri tabanı on günlüğüne skoru her genomik koordinat ve harita verilen koordinatları puan. Bu ortalama adım 3 ile ortalama zenginleştirme skoru 10-nt her pencere için yukarıdaki grafikler halinde puanları 2, 4 ve 0.5, 30-nt oligos örtüşen bir örnek verilir. Seçilen genomik bölgelerde Deneylerde Genom Tarayıcı Özel bir Track kullanılarak görüntülendi. Verilen örnekte bir tarayıcı penceresi clta gen, gen özellikleri (ekzon / intron / alternatif ekleme vb), koyu kırmızı dikey çubuklar tarafından temsil PTB bağlı oligos alt ve günlük ortalama zenginleştirme puanları boyunca verilmiştir. PTB güçlü polypyrimidine yolu sadece upstream ekzon 2 bağlar.

RNA veya protein düzeyi ya havuz bu yaratılış hatırlamak için bu yordamı bu çok önemli yaparken esnek ve modifikasyon açık. RNA düzeyinde orthologous bölgelerde, hastalık mutasyonlar, polimorfizmleri, ya da rastgele mutasyonların oligonükleotid dizisi içine sokulabilir. RNA bağlayıcı faktör protein düzeyinde fosforilasyon veya diğer post translasyonel modifikasyonlar tarafından değiştirilebilir. Ayrıca, bağlayıcı bir ortamda ya ek faktörlerin etkileşim veya ilgi RNA bağlayıcı protein i...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

RNA&#39;lar Sıralama RNA bağlayıcı proteinler ile birlikte immunoprecipitate (co-IP), bu bağlayıcı konuma göstererek ekleme anlayışımız artan sıklıkla bir ekleme faktörü fonksiyonu etkiler. Ancak, herhangi bir örnekleme stratejisi ile bir ekleme faktörüne bağlı bir RNA belirleme şansı hücresel bolluk orantılıdır. Biz aksi takdirde geçici pre-mRNA bağlayıcı özgüllüğü araştırmak için bir roman in vitro yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid havuzu kullanan intronlar, ekzon, ek kavşaklar, veya diğer pre-mRNA boyunca fayans. Havuz, bir tür moleküler seçim tabi tutulur. Burada, ilişkili ve ilişkisiz bir bölümünü içine oligonükleotid ayırarak yöntem göstermek ve bağlı fraksiyon her oligonükleotid zenginleştirme kaydetmek için bir iki renk dizisi stratejisi kullanacaklardır. Dizi veri dizisi özel ve yapısal pre-mRNA bağlayıcı ribonükleoprotein (RNP) determinates tanımlamak için yeteneği ile yüksek çözünürlüklü haritalar üretir. Bu yöntem için eşsiz bir avantajı havuz özellikle pre-mRNA dizisi tasarlanmış ve sentezlenmiş olarak, mevcut IP ve SELEX teknikleri ile ilgili mRNA doğru örnekleme yanlılığı önlemek için yeteneğidir. Deneyci, havuzu kendi ihtiyaçlarına uyarlayarak çapında çalışma ve kiremit hangi bölgeleri seçer oligonükleotid havuzu esneklik başka bir avantajdır. Bu tekniği kullanarak, bir tahlil büyük bir ölçekte bağlayıcı veya fonksiyonel bir ekleme muhabiri kütüphane klon ve fraksiyonunda zenginleştirilmiş olduğunu oligonükleotidler tespit polimorfizmleri veya mutasyonların etkileri. In vitro yüksek çözünürlüklü eşleştirme düzenini Bu roman düşük bolluk in vivo teknikler mevcut çalışma zorlaştırır geçici pre-mRNA türleri, RNP etkileşimleri çalışmak için benzersiz bir şekilde sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA at JoVE.com

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir<em&gt; In vivo</em&gt;. Burada, bir roman mevcut<em&gt; In vitro</em&gt; Yaklaşım, sentetik bir oligo havuzu kullanarak RNA-protein etkileşimleri araştırmak için pre-mRNA seçilen bölgelerde fayans.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Görüntüleme.  Brown University. Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir In vivo. Burada, bir roman mevcut In vitro Yaklaşım, sentetik bir oligo havuzu kullanarak RNA-protein etkileşimleri araştırmak için pre-mRNA seçilen bölgelerde fayans.

Video: A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biyoloji

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...