Biz Rachael B. Chanin ve Alejandro Llanos-Chea teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski ve Bobby Cherayil bu çalışmada kullanılan suşları için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar Grant K22AI104755 (C.S.F.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>Safra tuzları orta: % 0.4 safra tuzları (ağırlık/hacim) içeren tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak için safra tuzları 200 mg 50 mL resuspend autoclaved tekerlekli sandalye Basketbolu. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Taze orta haftalık olun. Notlar: Safra tuzları rutin olarak kullanılan sodyum cholate ve sodyum deoxycholate ovine ve sığır gallbladders izole bir 1:1 karışımı var. Daha önce4gösterildiği, glikoz varlığı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için gerekli idi. Tekerlekli sandalye Basketbolu glikoz göre Luria-Bertani (LB) suyu ekledi; ve bu nedenle, Shigella ve analiz diğer enterik patojenler biyofilm oluşumu ikna etmek yeterliydi. Analiz edilebilir bakteri bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonu veya farklı şeker gereksinimleri gerekli olabilir.</li>
	<li>%0,5 w/v kristal violet su: 2.5 g kristal violet 500 mL distile suda çözülür. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) Birleşik floresein isothiocyanate (FITC): 1 x PBS stokta Reconstitute. 25 µg/mL nihai bir konsantrasyon PBS'ye 1 x 400 μL ile 10 mg konsantre stok sulandırmak ve ışıktan korumak.</li>
	<li>PBS + glikoz: 10 mL 1 x PBS (%2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>PBS + safra tuzları: 40 mg 10 mL 1 x PBS çözülür (% 0,4 w/v safra tuzları son). Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzları ve 10 mL 1 x PBS (% 0,4 w/v safra tuzları ve % 2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>LB Ağar kaplamalar hazırlayın.</li>
	<li>Formaldehit/oxazolidin düzeltme: ekleme 810 µL formaldehit (% 37 hisse senedi çözüm, % 3 son konsantrasyonu) ve 125 µL oxazolidin (% 25 hisse senedi çözüm, %0.25 son konsantrasyonu) 14 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve 4 ° C'de depolayın Belgili tanımlık saptamak için doğru kullanımı soğuk olmalıdır. Dikkat: Belgili tanımlık saptamak zehirli ve tehlikeli atık bertaraf gerektirir.</li>
	<li>Antifade mountant çözüm: 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke içeren antifade mountant çözüm photobleaching immünfloresan mikroskobu örneklerinin fluorescently bakteri DNA boyama sırasında inhibe için kullanın.</li>
</ol>2. bakteri hazırlanması
<ol><li>TSB 3 mL steril kültür tüp içinde bir tek, iyi izole koloni ile aşı test edilecek bakteri suşlarının gecelik kültürler büyümek. 37 ° C'de gecede kuluçka (16-24 h) için 225 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya. Not: Suşları dondurucu stokları her 2 4 hafta ve üzerinde tutulan plakaları Hayır 2 haftadan fazla restreaked.</li>
</ol>3. katı faz bağlılık tahlil
Not: Bu tahlil yapisan bakteri bir 96-şey plaka yöntemi kullanarak quantifies. Bakteri statik olarak düz dipli levha yetiştirilmektedir. Yapisan bakteri kristal violet ile lekeli ve çamaşır yapışık olmayan bakteriler kaldırmak için gerçekleştirilir. Kristal mor leke peptidoglikan bakteriyel hücre duvarı bağlar ve etanol kullanarak çözündürüldükten. Yapisan bakteri sayısı kristal violet saklama üzerinde bağlı olarak belirlenir.
<ol><li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + safra tuzları (BS) ile.</li>
	<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
	<li>Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim wells (TSB ve tekerlekli sandalye Basketbolu + BS) test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
	<li>130 µL/iyi kültürü aşılamak üç kuyu ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.</li>
	<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kültür plaka hafifçe eğerek ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına orta aspirating bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan bakteriyel nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun. EPS matris kuluçka döneminde üretilen, matris beyaz çökelti görüntülenir. EPS matris rahatsız etmeyin.</li>
	<li>Yavaşça wells bir kez 200 µL steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Kuru için plaka tersine çevirin. En az 20 dk kurumaya izin. Not: biyofilm iyice boyama önce kurutulmuş gerekir beri Protokolü birkaç saat için bu adım, duraklatılmış veya bile gece olabilir. Eksik kurutma sonuçları ve tekrarlanabilirlik miktar etkiler iken eklenen kuruma süresi boyama yordamı değiştirmez.</li>
	<li>%150 0.5 kristal violet için her deneysel µL ve denetimi de ekleyin.</li>
	<li>(RT) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Wells bir kez 400 µL distile su ile yıkayın. Eklenen birim artık kristal mor leke kuyuları taraftan kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama vakum hattı ile kaldırın.</li>
	<li>Wells beş kez 200 µL distile su ile yıkayın. Yıkama vakum hattı ile kaldırın. Not: Ayrıntılı çamaşır miktar için önemlidir. Ne zaman boş wells distile su açık ve herhangi bir kalıntı kristal mor leke içermeyen, sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Kuru için plaka ışıktan korunan tersine çevirin. Yukarıda da belirtildiği gibi plaka tam kurutma emin olun.</li>
	<li>Wells 200 µL % 95 etanol ile destain. Plaka için 30 dk shaker üzerinde kuluçkaya. Özellikle yüksek sıcaklıkta buharlaşma önlemek için bu adım 4 ° C'de uygulayın</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD540kaydedin. Not: Kristal violet maksimum Absorbans için dalga boyu 590 olduğunu nm. Belgeleri OD540 - kristal violet Absorbans için OD5954,13,14,15,16 Aralık raporları; Böylece bir dalga boyu kullanılabilir plaka okuyucu göre seçin.</li>
</ol>4. EPS matris algılama
Not: Bu ücretsiz deneyleri ölçmek ve aka görselleştirin. İkimiz de EPS polisakkaritler bağlamak için bir lektin kullanılarak algılanır. Fluorescently Birleşik protein miktar (Adım 4.1) ve görsel öğeler (Adım 4.2) sağlar.
<ol><li>EPS yarı kantitatif tespiti<ol>
<li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
		<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
		<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
		<li>Bir steril, siyah, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için kuyu eklemek ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar tekrarlayın.</li>
		<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
		<li>Kültür orta açık 96-şey plaka bir pipet, ideal olarak bir çok kanallı pipet ile aktarın. Yapisan nüfus ve/veya plastik yüzeyde bulunan EPS aksatmadan kültür orta toplamak için dikkatli olun. Bir kenara koyun.</li>
		<li>15 dakika siyah plaka RT 200 µL/kuyu formaldehit/oxazolidin 1 x PBS kullanarak düzeltmek.</li>
		<li>Yapisan nüfus tespit ederken, adım 4.1.6 süpernatant kesir değerlendirin. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın.<ol>
<li>Alternatif olarak, tüm tahlil bir siyah açık alt plaka gerçekleştirilebilir. Bu gibi durumlarda aşırı doz600 değerleri kaydedilebilir ve kültür orta daha sonra 4.1.7 adıma devam etmeden önce iptal edilecek. OD600 değerleri verileri normalleştirmek için kullanılabilir durumda büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar vardır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.</li>
		<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama hafifçe eğerek plaka ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına yıkamada aspirating vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
		<li>150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça iki kez 200 µL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>PBS 150 µL her şey için ekleyin. 488, Floresans kaydetmek nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal mikroskobu görselleştirme EPS üretim ve biyofilm kalınlığı hesaplanması<ol>
<li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
		<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
		<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
		<li>Steril bir 24-şey plaka ile 12 mm cam coverslips steril ayarlayın. Boş denetimi hizmet için üç kuyu 400 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
		<li>Yinelenen wells aşısını kültürünün 400 µL eklemek ve tüm deneysel koşullar kaplama kadar tekrarlayın.</li>
		<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
		<li>Görsel olarak TSB koşulu, büyüme ve EPS çökelti (TSB beyaz) + BS koşulu, büyüme ve hiçbir büyüme ve/veya steril kontrol Wells beyaz çökelti onaylayın. Supernatants kaldırın.</li>
		<li>RT 200 µL/iyi formaldehit/oxazolidin çözüm 1 x PBS kullanarak, 15 dk fix.</li>
		<li>Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.</li>
		<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
		<li>150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça iki kez 200 µL/kuyu ile PBS yıkayın.</li>
		<li>Antifade mountant çözüm DAPI ile bağlayın. Not: Aynı anda bir counterstain olarak görselleştirme için bakteri hücrelerindeki DNA boyama sırasında floresan etiket korumak için DAPI içeren bir hazır, gliserol tabanlı bağlama çözüm çözümdür. Kit'in yönergeleri ve önerileri örnekleri Imaging önce kuluçka süreleri için izleyin. Yordam boyama DAPI DAPI içermiyor antifade mountant çözüm uygulanmadan önce gerçekleştirilir.</li>
		<li>Tarafından confocal mikroskobu değerlendirin. Confocal mikroskobunun lazer 495 nm/519 nm uyarma/emisyon FITC görselleştirme için ayarlayın. İkinci bir lazer 360 nm/460 nm uyarma/DAPI görselleştirmek için emisyon için ayarlayın. Biyofilm DAPI kanal üzerinde odaklanarak bulun. DAPI ve FITC kanalları tam kalınlıkta belirlemek ve üst ayarlamak için kullanın ve alt kenarlıklarını görüntüleme. Tam kalınlıkta Z-yığın görüntüleri tarafından esir alma imge her 0.25 µm z yığının altında ve üst için parametreleri ayarladıktan sonra kaydedin. Confocal mikroskobu hakkında daha fazla bilgi için lütfen yayınlar için Paddock ve ark. tarafından bakın. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Tam biyofilm oluşumu görselleştirmek ve biyofilm kalınlığı hesaplamak için ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 3D görüntülerde yeniden. S. flexneri safra-tuz indüklenen biyofilmler için elde edilen ortalama kalınlık 14 µm4oldu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. dağılım tahlil
Not: Bu tahlil biyofilm bakteri dağılımı ile sökme algılanır. Burada, olgun biyofilmler kurulan ve daha sonra (genellikle ertesi gün), medya PBS ile değiştirilir veya PBS desteklenmiştir. Süpernatant bileşeni sonra biyofilm ayrışmış bakteri sayısı quantitate için tabi.
<ol><li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
	<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
	<li>Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyu test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
	<li>130 µL/iyi kültürü aşılamak için üç kuyular ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.</li>
	<li>4-24 h 37 ° C'de plaka statik olarak kuluçkaya.</li>
	<li>Devam etmeden önce sıcak PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + 37 ° c glikoz Bu reaktifler taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kültür bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun.</li>
	<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Aşağıdaki üç kuyu içine 130 µL/iyi yıkamak yerine: PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikoz. Bu reaktifler 37 ° C'ye Önceden ısıtılmış olmalıdır</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk plaka kuluçkaya</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde plaka 37 ° C kuluçka çıkarın. Supernatants bir taze, steril 96-şey tabağa aktarın.</li>
	<li>96-iyi blok, levha veya seyreltme kullanarak hazırlamak 10 kat (1:10) steril PBS içine süpernatant, seri dilutions. Not: Seyreltme serisi su katılmamış 10-6 bağlı olarak test edilecek bakteriyel zorlanma alanı. Pilot deneyler en uygun seyreltme aralığı belirlemek için gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Plaka 5 µL üzerine bir çok kanallı pipet kullanarak LB agar her seyreltme, nokta. 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Koloniler ertesi gün ve seyreltme faktörü hesaba birimleri (CFU) oluşturan kurtarma koloni belirlerken güvenirim. 1 x PBS denetimi (% 100 ayarlamak) göre yüzde dağılımı hesaplamak için 1 x PBS denetimi örneğini kurtarma CFU tarafından her tedavi durum CFU kurtarma bölün. Not: Rutin medya plakaları bakteriyel zorlanma ilgi için de kullanılabilir. Örneğin, Shigella Kongo kırmızısı Tabaklarda kaplama. Tabakları için uygun yer kaplama teknikleri kuru olduğundan emin olun.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Biyofilm oluşumu analizini biyofilmler ve suşları, malzemeleri, laboratuar ve deneyleri arasında değişkenlik dinamik doğası nedeniyle zordur. Burada, çeşitli stratejiler enterik patojenler safra tuzları pozlama deneysel fikir tekrarlanabilirlik tanıtmak için sağlanan takip biyofilm oluşumu belirlemek için sunulmuştur. Tekrarlanabilirlik emin olmak için ek konuları vardır. Her şeyden önce en az üç bağımsız gerçekleştirme her gözlem ve istatistiksel önemi nedeniyle oluşabilir değişim onayl...

Biyofilm oluşumu sırasında sert çevre koşullarına bağlı bir önemli bakteriyel hayatta kalma stratejisidir. Bakteri yok edici bileşikler maruz gibi antibiyotikler veya besin değişimler ya da oksijen durumu biyofilm oluşumu ile hafifletti bakteri stresli bir durumda neden olmaktadır. Bir biyofilm bakteri eki bir yüzey veya diğer bakteri ile karakterizedir ve öncelikle polisakkaritler1,2,3oluşan bir EPS matris salgı tarafından eşlik eder. Biyofilm oluşumu olayları bir çağlayan bir olgun yapisan bakteriyel topluluk1,2,3oluşumunda culminates dinamik bir süreçtir. Bakteri adhesin gen ifade profilleri eki biyofilm olgunlaşma sırasında güçlendirmek için değişen süre erken ek kolaylaştırmak için adhesins üretir. Aynı anda, EPS üretim kat ilk tetikleyici hücreleri korumak için bir matris bakteriyel toplumda için oluşur. Biyofilm içinde bulunan bakteriler yavaş büyüyen vardır; ve bu nedenle, en antibiyotikler etkisiz vermektedir. Ayrıca, yavaş büyüme Bakteriyel büyüme1,2,3iyilik için koşullar değiştirene kadar enerji tasarruf sağlar. Sert koşulları geçtikten sonra bakteri biyofilm dağıtmak ve planktonik yaşam tarzı1,2,3devam edin. Geleneksel olarak, biyofilmler yüzeylerinde gözlenen ve kalıcı bir klinik meydan okuma nedeniyle enfeksiyon rezervuarlar Kateterler ve konut cihazlar1,2,3mevcut temsil eder.
Biyofilm oluşumu son zamanlarda birkaç enterik patojenler için tanımlanmıştır; ince bağırsak veya iki nokta üst üste4bulaştırmak bakteri. Shigella türleri, enfeksiyonu gastrointestinal sistem çoğunluğu üzerinden transit sonra insan kolonda oluşur. İnce bağırsak yoluyla geçiş sırasında Shigella safra için maruz kalmaktadır; aynı anda birçok bakteri5öldürme süre lipidler hazım kolaylaştırmak için bağırsak içine salgılanan lipid aşağılayıcı deterjan. Enterik patojenler safra6bakteri yok edici etkileri karşı koymak için eşsiz bir yeteneği var. Bizim son analiz vivo içindekullanılan-hangi tarihlerde glikoz ve S. flexneri sağlam biyofilm oluşumu göstermek için safra tuzları birleşimleri yanı sıra diğer türler, Shigella, patojenik Escherichia colive Salmonella4. Daha önce Salmonella enterica serovar Typhi safra kaynaklı bir biyofilm safra kesesi benzersiz kolonizasyon kronik enfeksiyon7,8,9, sırasında nedeniyle oluşturmak için gösterildi 10. Ayrıca, Vibrio11ve Campylobacter12 ile önceki araştırma biyofilm oluşumu yanıt safra olarak gösterdi. Bu nedenle, analizler safra kaynaklı biyofilm oluşumu gözlemler diğer patojenler için genişletilmiş ve safra korunmuş enterik patojen yanıt bir gösteri kurmak için yardım. Bakteriyel gen transkripsiyonu sınırlıdır ve hücre yaşlanma1,2,3oluşabilir kronik biyofilmler enterik safra kaynaklı biyofilm doğada daha geçici öneriyorum. Bu geçici öldürücü biyofilm tarafından hızlı sökme (dağılım assay olarak görüldüğü gibi) hallmarked ve biyofilm nüfus4,6' gözlenen virülans gen ekspresyonu gelişmiş. 
Başlatan bir faktör sadece son zamanlarda en enterik patojenler açıklandığı olduğu gibi çok yönlü, dinamik bir süreç ve safra tuzları kullanımı biyofilm oluşumu olduğu gibi araçları ve teknikleri kullanılan eşsiz ve yaratıcı uygulamalar geleneksel yöntemler vardır. Böylece, burada sunulan üç ücretsiz stratejileri safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu, bakteriyel bağlılık, EPS matris üretimini ve canlı bakteri dağılımı biyofilm üzerinden de dahil olmak üzere birçok önemli özelliklerini ölçmek için vardır. Bu teknikler öncelikle Shigellaile araştırma için kullanılmıştır; ve bu nedenle, en iyi duruma getirme diğer enterik patojenler değerlendirilmesi gerekebilir. Yine de, tüm üç deneyleri olumlu veri tanımlaması biyofilmler destek ve safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için tekrarlanabilir iletişim kuralları kurmak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biyofilm oluşumu bakteri sert çevre koşulları veya stresli zamanlarda altında oluşan dinamik, çok aşamalı bir süreçtir. Enterik patojenler için önemli stres tepkisi gastrointestinal transit sırasında ve safra maruz, insan sindirim normal bir bileşeni üzerine indüklenen. Safra bakteri yok edici etkilerini aşmak için birçok enterik patojenler ince bağırsak transit zaman hayatta kalma izni olan bir biyofilm oluştururlar. Burada metodolojileri biyofilm oluşumu katı fazlı bağlılık deneyleri gibi hücre dışı polimer madde (EPS) matris algılama ve görselleştirme ile tanımlamak için mevcut. Ayrıca, biyofilm dağılım değerlendirme serbest bırakmak-in bakteri enfeksiyonu işlemi sırasında tetikleme olayları analiz taklit etmek için sunulmaktadır. Kristal violet boyama bir yüksek-den geçerek 96-şey plaka bağlılık tahlil yapisan bakteri tespit etmek için kullanılır. EPS üretim değerlendirme iki deneyleri tarafından belirlenir Yani mikroskobu EPS matris ve yarı kantitatif analiz fluorescently Birleşik polisakkarit bağlayıcı lektin ile boyama. Son olarak, biyofilm dağılım koloni sayıları ve kaplama ile ölçülür. Birden çok testleri pozitif verilerden biyofilmler karakterizasyonu destek ve diğer bakteri suşları safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu tanımlamak için kullanılabilir.

Şekil 1' de, altı enterik patojenler sınanan aşağıdaki büyüme medyada safra tuzları içeren çoğunda biyofilm oluşumu indüklenen. Safra tuzları pozlama neredeyse tüm suşların görülmektedir sonra yapisan bakteri önemli bir artış test. İstisnadır enteroaggregative E. coli (olursa); ancak, Δaaf mutant4indüklenen gözlenmesi unutmayın. Ek bağlılık mekanizmaları olursa safra tuzları...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Video: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...