Bu eser öncelikle hibe CHDI Vakfı ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından finanse edildi. Biz Dr Sophie Vieweg yararlı tartışmalar için bu yeni ifade sisteminin geliştirilmesi ve Lashuel grubunun diğer üyeleriyle sırasında bu ifade sistemi ile deneyimlerini paylaşmak ve giriş ve değerli geribildirim için teşekkür ederiz. Biz de Prof. Oliver Hantschel ULP1 plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Dr John B. Warner ve Dr Senthil K. Thangaraj el yazması kritik İnceleme için teşekkür ederiz

Yazarlar bu makalenin içeriği ile hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Alma miligram miktarda yerli, etiketlenmemiş için Httex1 bu protokol için biz verimli bir yordam belirttiğimiz 23 ya da 43 glutamin kalıntılar içeren. Bu bir onun bir C-terminal fusion olarak Httex1 ifade ederek başarıldı6-IMAC tarafından lysate hücreden füzyon proteini izole etmek için kullanılır ve Httex1 HPLC arıtma önce i ciddi SUMO etiketi. SUMO strateji birkaç diğer proteinler üretiminde kullanılan iken, bizim Yöntem SUMO özünde oluşturmak için de kullanılabilir benzersiz özellikleri, toplama eğilimli, daha önce olduğu kanıtlanmıştır amyloidogenic protein düzensiz olduğunu gösterir 43,44üretmek ve işlemek son derece zor. Biz bir "su kuyusu-davranmak" protein üretimi için basit, kullanımı kolay ve bir iletişim kuralına benzer bir iletişim kuralı mevcut. SUMO fusion solubilizes ve Httex1 ifade ve IMAC arıtma adım sırasında stabilize. İntein strateji10 ve toplama ile gözlemlediği gibi etiketin erken bölünme olduğunu artık bir sorun.
Özünde düzensiz protein yıkımı için özellikle güvenlik açığından etkilenir. N-terminal bozulması N17 bölgesinde bu iletişim kuralını kullanan bir mesele değil, truncations Httex1 PRD içinde gelişebilir. Kesilmiş proteinler hydrophobicity, ücret ve boyut olarak Httex1 için çok benzer gibidir, kromatografik yöntemle çıkardıktan meydan okuyor, böylece ilk etapta onların oluşumunu önlemek en iyisidir. Yakından protokole yapışma, her zaman buz üzerinde çalışma ve proteaz inhibitörü yeterli miktarda kullanarak gözlenen kesme düzeyi çok düşük tutmak yardımcı olacaktır. Kesilmiş protein benzeşme etiketi de kaybetmek gibi bir füzyon etiketi C-terminus Httex1 in itibariyle uygulamak truncations PRD kolayca kaldırabilirsiniz. Ancak, yerli dizi prolin ve bizim bilgimize Httex1 sona ererken bu seçeneği uygulanamaz muhafaza edilmesi gerekiyorsa traceless ve verimli bölünme prolin sonra ikna etmek için bilinen hiçbir C-terminal füzyon Etiketler vardır.
En önemli protokol SUMO etiketi bölünme sonra ULP1 tarafından kurtarılmış Httex1 işlenmesi parçasıdır. Protein hemen RP-HPLC tarafından saf. Neyse ki, bu genellikle 10-20 dk 4 ° C'de tamamlanır bir verimli ve hızlı tepki Buna ek olarak, intein strateji birkaç saat böylece verimi en üst düzeye çıkarmak için eksik bölünme ve başlangıç toplama arasında bir denge gerektiren intein, tam bölünme için gerekli. O-ecek başlamak gibi hızlı bir iş Httex1, mutant için gereklidir 23Q değişken daha uzun süre stabil ise nispeten yüksek konsantrasyon bölünme reaksiyon mevcut toplanacak. RP-HPLC arıtma sırasında SUMO bir diğer avantajı ortaya çıkıyor: Ssp DnaB intein hidrofobik ve sopalarla güçlü sütuna iken, SUMO daha Hidrofilik ve tamamen C4 ters faz sütundan elutes. Ticari ULP1 oldukça pahalıya mal olsa da, protein yüksek verim daha önce yayımlanmış protokolleri29takip kolayca üretilmektedir.
Httex1 kullanmadan önce yükünün iletişim kuralı uygulayarak kritik öneme sahip olamaz yeterli vurguladı. PolyQ liyofilize proteinler Httex1 gibi stabildir ve saklı uzun süre olabilir ama su ve arabellekleri tamamen çözünür değildir. Varlığı ön şekillendirilmesi reaksiyonlar ya liflerinde toplama kinetik ve protein45biyofiziksel özellikleri üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Burada açıklanan yükünün iletişim kuralı yükünün protein, ön şekillendirilmesi toplamları kaldırılması ve lyophilized bir örnek üzerinden monomeric Httex1 lik üretimi sağlar. SUMO ve intein strateji ile elde Httex1 için benzer toplama kinetik ve fibril görünümdeki görülmektedir.
Httex1 üretimi için önceki yöntemleri ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan SUMO strateji birçok avantaj sunar ve yapısı araştırmak için olası çalışmalar aralığını ve sağlık ve hastalık bu proteinin fonksiyonel özellikleri genişletir. SUMO-Httex1 füzyon proteini kolay, bu donmuş ve depolanan veya ücretsiz mHttex1 hızlı bir şekilde toplamak çözüm için 24 saat içinde ortam sıcaklığında tuttum. İstikrar ve SUMO-Httex1 füzyon proteinlerin yüksek çözünürlük protein işlemek ve/veya aksi takdirde sonra bölünme mümkün olmazdı mHttex1 içine enzimatik ve kimyasal değişiklikler tanıtmak için büyük esneklik sağlar. Bu giriş içerir translasyonel modifikasyonlar, fluorophores, spin etiketleri, biotin Etiketler, vb burada sunulan gelişmeler 1 olmalıdır) Httex1; ilişkilerin yapı-fonksiyon aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak 2) Htt toplama ve patoloji yayılan araştırmak için yeni araçlar oluşturur; 3) mutant Httex1 stabilize etmek ve onun toplama önlemek moleküller tanımlamak için yeni deneyleri geliştirme sağlamak; ve 4) bilim adamları diğer alanlardan bu protein üzerinde çalışmak ve Huntington hastalığı için tedaviler bulmak için bizim macera katılmak getirmek için teşvik ediyoruz.

HTT 348 kDa protein ve birçok fizyolojik fonksiyonları1' karıştığı olmuştur. HTT fazla 36 kalıntılarında onun N-terminus bir genişletilmiş polyQ bölgesini içerdiğinde, HD2,3neden olur. HD patoloji striatum ve nöronal ölüm ve atrofi etkilenen doku4,5yol açar korteks hücresel kapanımlar karakterizedir. PolyQ tekrar yolu içeren birkaç N-terminal Htt parçaları otopsi beyin HD hastalardan tespit ve huntingtin protein6proteolitik işlem tarafından oluşturulacak sanıyordum. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Httex1 de anormal mRNA'ın porno versiyonunu nedeniyle bir araya ki öneririz. Httex1 patolojik polyQ mutasyon içerir ve onun overexpression hayvanlarda HD7böylece olası bir rol HD patoloji ve hastalık ilerleme '6Bu parçası vurgulayarak, anahtar özellikleri birçok özetlemek, 8,9.
Yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 nedeniyle (mHttex1) genişletilmiş polyQ yolu ile Httex1 geçici füzyon proteinler için varolan ifade sistemleri çoğunluğu dayanmaktadır (glutatyon-S-transferaz (GST), thioredoxin (TRX) gibi veya maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve/veya onun ifade, istikrar, arıtma ve/veya çözünürlük10,11,12,13,14 differentially artıran peptidler (poli-histidin) ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Füzyon ortak Httex1 için kısa bir sıra tripsin gibi proteaz için bir bölünme site içeren ile bağlantılı, tütün etch virüs (TEV) proteaz veya bölünme ve Httex1 sürümünden önce toplama başlatılması için izin vermek için PreScission veya Arıtma. Bu yöntemlerin eksikliklerini traceless bölünme nedeniyle ek artıkları ve miscleavage heterojenlik nedeniyle eksik bölünme () yanı sıra Httex1, dizisi içinde nedeniyle kesilmiş parçaları oluşturulması bırakma olasılığını içerir Vieweg ve ark. avantajları ve sınırlamalar bu yaklaşımın daha kapsamlı açıklama için bakınız)10. Biz bu sınırlamaları gidermek için son zamanlarda Synechocystis sp. geçici bir N-terminal füzyonu kullanarak etiket içermeyen yerli Httex1 üretimi ilk kez etkinleştirme bir ifade stratejisi geliştirdi (Ssp) DnaB intein Httex110. İntein göğüs arası traceless ve belirli ve mg protein miktarı verir iken, hala verimi azaltabilir iki dezavantajı uğrar: Ifade ve üzerinde bir bölünme oluşur aslında gerçekleşebileceğini intein Yani, erken bölünme birkaç saat, toplama, genişletilmiş polyQ tekrarlar ile Httex1 için özellikle nedeniyle protein kaybına neden olabilir.
Bu sınırlamaları gidermek ve yerli üretim için bizim strateji geliştirmek için etiket içermeyen Httex1, SUMO, daha tam olarak Maya homolog Smt3 Httex1 için geçici füzyon dayalı yeni bir ifade sistemi geliştirdik. SUMO sistemi rekombinant proteinlerin üretimi için ilk nerede bir artış oranı ifade ve çözünürlük SUMO füzyon protein gösterilmiştir 200429, yayınlandı. SUMO etiketi Ubikuitin protein özgü proteaz 1 (ULP1), hangi does değil istemek bir tanıma site ama SUMO Tersiyer yapısını tanır ve pratik miscleavage30olasılığını ortadan kaldırır gibi i ciddi. Ayrıca, ULP1-aracılı bölünme hızlı ve traceless ve ek artıkları bırakmaz. Füzyon etiketi, erken bölünme ile otokatalitik intein10, gözlemlediği gibi tamamen dış bir proteaz gereksinimi tarafından önlenmiş olur. SUMO strateji Rekombinant protein üretim31,32,33için günümüzde yaygın olarak kullanılırken, biz özünde düzensiz bir nesil için özellikle yararlı olur bu yazıda göstermek, toplama eğilimli, amyloidogenic protein Httex1 gibi. Biz sadelik, verimlilik ve sağlamlığı bizim SUMO-fusion tabanlı yöntemi yerli, etiket içermeyen Httex1 farklı disiplinlerden araştırmacılar için daha erişilebilir kılan ve Httex1 vitro non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırmak inanıyoruz . Httex1 yapı-fonksiyon ilişkinin aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracak önemli bir ilerleme bu.
Protokol Httex1 bakteri kültürü 12 l arıtma açıklar, ancak protokol kolayca daha küçük veya daha büyük ölçekli üretimler için adapte. Bir polyQ tekrar uzunluğu (23Q) aşağıda ve mutant Httex1 ile üretim vahşi türü Httex1 (wtHttex1) protokolünü açıklar (mHttex1) bir polyQ ile patojenik eşik (36Q) uzunluğu (43Q) yukarıda tekrarlayın.

<table><tbody><tr><td>Uranyl formate (UO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(CHO2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Substance Dulbecco&#039;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (Miller&#039;s LB Broth)</td><td>&amp;nbsp;Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&amp;nbsp;Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168.P0</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10 &amp;micro;m C4 300 &amp;Aring;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer semi-micro cuvette</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, 1/16&quot; fittings (&amp;Auml;KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;100 kD Microcon&amp;nbsp; fast flow filters</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta 900 equipped with a fraction collector&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Circular Dichroism</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC system&amp;nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&amp;nbsp; , preheated column (40 &amp;deg;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>waters HPLC system</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lyophylizer instrument</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&amp;nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C shaking&amp;nbsp; incubator</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Huntington hastalığı (HD) bir devralınan ölümcül nörodejeneratif hastalık bir CAG genişletme (≥36) tarafından neden içinde HD gen exon ilk Huntingtin protein (Htt) ifadesinde kaynaklanan ya da N-terminal bunların parçaları bir genişletilmiş polyglutamine () ile polyQ) streç.
Huntingtin protein (Httex1) exon1 HD özellikleri cep içinde birçok beyannamedir en küçük Htt parçası ve hayvan modelleri ve Htt en çok çalışılmış parçaları biridir. Httex1 küçük boyutu deneysel olarak daha mükellef ile karşılaştırıldığında daha uzun parçaları veya tam uzunlukta Htt standart ve yüksek çözünürlüklü teknikleri kullanarak biyofiziksel karakterizasyonu için yapar. Ancak, yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 (mHttex1) artan polyQ içeriği (≥42) ile verimli ifade ve bu proteinler yeterli miktarlarda üretmek ve onları erişilebilir yapmak için arıtma sistemleri geliştirmek zor yaptı Füzyon protein veya protein yerli dizi alter diğer stratejileri kullanmanıza gerek kalmadan farklı disiplinlerden bilim adamları. Burada sağlam ve en iyi duruma getirilmiş bir yöntem mevcut miligram miktarda yerli üretimi için etiket ücretsiz-küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı Httex1. Sadelik ve verimliliği strateji Httex1, böylece bu proteinin araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek ve deneyler tekrarlanabilirlik farklı laboratuvarlar arasında artırma non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırır. Bizce bu gelişmeler de Htt yanı sıra gelişmekte olan yeni tanı araçları ve tedaviler tedavi etmek ya da HD ilerlemesini yavaşlatmak yapı-fonksiyon ilişkisi elucidating yönelik gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

Httex1 E. coli bir N-terminal ile ifade onun6-SUMO etiket. İfade ve arıtma füzyon proteinin temsilcisi sonuçları Şekil 1' de özetlenmiştir. Çünkü Met1 tam i ciddi vivo içinde42Htt ve Ala2 ile başlar 2-90 kalıntılarının Httex1 dizisi oluşur. Tam sırası ifade füzyon proteinin Şekil 1içindeAgösterilir, amino asitler numaralandırma 23Q değişkenine anlamına gelir. Plazmid, yakın bir gelecekte toplumla paylaşılması gereken Addgene yatırılacaktır. Plazmid ve ifade füzyon protein bir şematik resim 1'Bgösterilir. His6-SUMO Httex1 bir orta seviye (Şekil 1C) ifade eder ve en füzyon proteinin çözünür kesir mevcut lizis, 23Q ve 43Q değişken için hem de sonra. Füzyon proteini beklenen, daha yüksek molekül ağırlıklı dayalı geçirir. Bu kısmen nedeniyle SUMO güçlü kat ama çoğunlukla Httex1, esas olarak glutamin ve prolin kalıntılar içeren alışılmadık sıra bileşimi nedeniyle değildir. Wildtype (23Q) ve (43Q) mutant füzyon protein zenginleştirilmiş ~ %80 saflık için ana protein Co arındırıcı varlığını Httex1 ve büyük örnek nispeten düşük ifade düzeyi tarafından açıkladı IMAC (Şekil 1D) tarafından sütuna uygulanan birim.
Onun göğüs arası6-SUMO etiket ve Httex1 arınma Şekil 2içindeAgösterilir. UPLC bölünme onun izlemek için verimli bir araçtır6-SUMO etiket (Şekil 2B). Füzyon proteini özgün zirvesine tüketilen ve onun karşılık gelen iki yeni ve iyi ayrı doruklarına6-SUMO etiket ve Httex1 görünür. Bölünme reaksiyon 10-20 dk içinde sona erdi. Western Blot (WB) bölünme tepki verimli bir şekilde izlemesini çok yavaştır, ancak başvuru ve SUMO bölünme completeness göstermek için şekilde dahil. Her iki Httex1 23Q ve 43Q de onun ayrılabilir6-SUMO tag RP-HPLC (Şekil 2C) ve yüksek saflık UPLC, MS ve SDS-sayfa Analizi (Şekil 2D) tarafından gösterildiği gibi elde edilmiştir.
Bu yöntem tarafından hazırlanan Httex1 protein Httex1 beklenen toplama özelliklerini korumak, mutant Httex1 37 ° C'de fibrillization kinetik sedimantasyon tahlil tarafından değerlendirildi göstermek için CD tarafından ikincil yapı değişiklikleri izlenen Spektroskopi ve TEM göre toplamları morfolojisi ile karakterizedir. Şekil 3' teAtoplama kinetik sedimantasyon tahlil tarafından belirlenen mHttex1 fibril oluşumu temsil eden veri kümesi gösterilir. Fibril oluşumu nedeniyle zamanla 43Q UPLC tarafından sayısal çözünür Httex1 kaybı. Biz tam bir çözünür protein tükenmesi, kuluçka 48 saat sonra görmekteyiz. Ayrıca, ikincil yapı protein CD spektroskopisi (Şekil 3B) tarafından belirlenir. Httex1 43Q vardiya üzerinden yapılandırılmamış (λmin 205 nm) esas olarak β-yapraklık zengin uyum (λmin 215 nm), kuluçka 48 saat sonra için. Bu yapısal değişim TEM göre olarak gözlemlenebilir uzun fibriler toplamları oluşumu, 48 saat (Şekil 3C) eşlik ediyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Resim 1 . İfade ve arıtma onun6-SUMO Httex1 füzyon proteini.  (A) onun amino asit dizisi6-SUMO-Httex1-QN füzyon yapıları (onun6-SUMO yeşil ve turuncu Httex1-QN ); (B) şematik genel ifade ve arıtma füzyon proteinin; (C) ifade ve çözünürlük lizis sonra; füzyon proteinin SDS-sayfa Analizi (D) kromatografik füzyon proteinin IMAC arıtma ve kesirler SDS-sayfa tarafından analiz (kırmızı çubuk: ilişkisiz kesir, mavi bar: yıkama kesir, siyah bar: elüsyon tepe içeren kesirler); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Resim 2 . Bölünme onun6 SUMO etiket ve etiket içermeyen Httex1-QN proteinlerin saflaştırılması. (A)şematik genel bakış; (B) analizi ULP1 UPLC tarafından SUMO etiketiyle dekolte (mavi: ULP1; toplamadan önce siyah: 20 min (23Q), sırasıyla 10 min (43Q) ULP1 yanı sıra sonra) ve WB (MAB5492 1:2000, ikincil keçi anti fare antikor 1: 5000); (C) kromatografik Httex1 partiye hazırlık RP-HPLC arınma; D: UPLC tarafından arıtılmış Httex1 Analizi SDS-sayfa ve ESI-MS; beklenen molekül ağırlığı 9943 Da (23Q) ve 12506 Da (43Q) sırasıyla var. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Şekil 3 . Toplama Httex1-43Q: (a)sedimantasyon tahlil UPLC üzerinde dayalı. (B) 0 h ve 48 h. (C) TEM Filmler, 48 h toplamları ikincil yapılara sahip CD spectra (ölçek çubukları çoğu 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Burada, yerli, etiket içermeyen monomerleri miktarlarda miligram ve liflerinde küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı exon1 Huntingtin protein (Httex1) üretimi için sağlam ve en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı mevcut.

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Görüntüleme.  Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Burada, yerli, etiket içermeyen monomerleri miktarlarda miligram ve liflerinde küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı exon1 Huntingtin protein (Httex1) üretimi için sağlam ve en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı mevcut.

Video: Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Genetik

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Biyokimya

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 kDa. While the cellular function of FL HTT is not entirely understood, a mutant expansion of the polyQ tract above ~36 repeats is associated with Huntington's disease (HD), with the polyQ length correlating roughly with the age of onset. To better understand the effect of structure on the function of mutant HTT (mHTT), large quantities of the protein are required. Submilligram production of FL HTT in mammalian cells was achieved using doxycycline-inducible stable cell line expression. However, protein production from stable cell lines has limitations that can be overcome with transient transfection methods. 
This paper presents a robust method for low-milligram quantity production of FL HTT and its variants from codon-optimized plasmids by transient transfection using polyethylenimine (PEI). The method is scalable (&gt;10 mg) and consistently yields 1-2 mg/L of cell culture of highly purified FL HTT. Consistent with previous reports, the purified solution state of FL HTT was found to be highly dynamic; the protein has a propensity to form dimers and high-order oligomers. A key to slowing oligomer formation is working quickly to isolate the monomeric fractions from the dimeric and high-order oligomeric fractions during size exclusion chromatography. 
Size exclusion chromatography with multiangle light scattering (SEC-MALS) was used to analyze the dimer and higher-order oligomeric content of purified HTT. No correlation was observed between FL HTT polyQ length (Q23, Q48, and Q73) and oligomer content. The exon1-deleted construct (aa 91-3,144) showed comparable oligomerization propensity to FL HTT (aa 1-3,144). Production, purification, and characterization methods by SEC/MALS-refractive index (RI), sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE, and Blue Native PAGE are described herein.

We provide scalable protocols covering construct design, transient transfection, and expression and purification of full-length human huntingtin protein variants in HEK293 cells.

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.

Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Nörobilim

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide (AON)-mediated therapy. While SMN1 mutations are responsible for the disease, AONs targeting intronic splice silencer (ISS) sites in SMN2, including FDA-approved nusinersen, have been shown to restore SMN expression and ameliorate the symptoms. Currently, many studies involving AON therapy for SMA focus on investigating novel AON chemistries targeting SMN2 that may be more effective and less toxic than nusinersen. Here, we describe a protocol for in vitro evaluation of exon inclusion using lipotransfection of AONs followed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and Western blotting. This method can be employed for various types of AON chemistries. Using this method, we demonstrate that AONs composed of alternating locked nucleic acids (LNAs) and DNA nucleotides (LNA/DNA mixmers) lead to efficient SMN2 exon inclusion and restoration of SMN protein at a very low concentration, and therefore, LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides may be an attractive therapeutic strategy to treat splicing defects caused by genetic diseases. The in vitro evaluation method described here is fast, easy, and sensitive enough for the testing of various novel AONs.

Various antisense oligonucleotides (AONs) have been shown to induce exon inclusion (splice modulation) and rescue SMN expression for spinal muscular atrophy (SMA). Here, we describe a protocol for AON lipotransfection to induce exon inclusion in the SMN2 gene and the evaluation methods to determine the efficacy in SMA patient fibroblasts.

Tarafından indüklenen Exon dahil değerlendirilmesi Splice SMA hasta fibroblastlar anahtarlama antianlamlı Oligonucleotides

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Tıp

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Biyoloji

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Tarafından indüklenen Exon dahil değerlendirilmesi Splice SMA hasta fibroblastlar anahtarlama antianlamlı Oligonucleotides

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları