Protokol, düşük miligram ölçeğinde tam uzunlukta avcılık varyantlarının üretimi için geliştirilmiştir. HD araştırmacıları için gerekli olan tutarlı yüksek kaliteli proteine izin verir. Prosedürü gösteren, Curia Laboratuvarı'ndan bir araştırma bilimcisi olan Michael Harris olacak.
Bir litre endotoksin içermeyen suya bir gram polietilenimin 25 K ekleyerek başlayın ve iyice karıştırın. 100 milimolar hidroklorik asit kullanarak pH'ı 2.0'a ayarlayın ve tüm polietilenimin çözünene kadar karıştırın. Ardından, 100 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.0'a ayarlayın ve çözeltiyi 0.2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.
Filtrelenmiş çözeltinin alikotlarını yapın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. HEK293 hücrelerini, nemlendirilmiş bir çalkalayıcı inkübatörde penisilin streptomisin ile desteklenmiş büyüme ortamında, 37 santigrat derece, 90 RPM,% 5 karbondioksitte 18 ila 24 saat boyunca yayın. Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri beş litrelik bir Erlenmeyer şişesinde iki litre büyüme ortamında mililitre başına altıncı güç hücrelerine yaklaşık 1.2 x 10 yoğunlukta seyreltin ve 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkanın sonunda, üreticinin talimatlarını izleyerek bir otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını ölçün. Transfeksiyon için gerekli polietilenimin ve plazmid miktarını hesapladıktan sonra, polietilenimin ve plazmidi ayrı ayrı 100 mililitre PBS içinde seyreltin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, seyreltilmiş plazmid ve polietileneimini hafifçe döndürerek karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
Karışımı hücre kültürüne ekleyin ve yavaşça döndürerek karıştırın. Şimdi, hücrelerin 24 saat boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, kültüre 1: 1.000 hacim oranında iki milimolar anti-kümelenme ve köpük önleyici maddenin son konsantrasyonuna sodyum bütirat çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş çalkalayıcı inkübatördeki hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin.
Hücre canlılığını ve yoğunluğunu ölçtükten sonra, hücreleri 30 dakika boyunca 2.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve saflaştırmadan önce hücre peletini eksi 80 santigrat derecede saklayın. FPLC kullanarak anti-FLAG saflaştırma için, tampon A kullanarak dakikada dört mililitre akış hızında boş bir kolona 12 ila 25 mililitre anti-FLAG reçine paketleyin ve pistonun ucu ile reçine yatağı arasındaki boşluğu gidermek için pistonun yüksekliğini ayarlayın. Daha sonra, çözülmüş hücre peletini soğuk lizis tamponunda askıya alın ve hücre süspansiyonunu bir kez yüksek parçalayıcı homojenizatörden inç kare basınç başına 1.000 pound'da geçirin.
Uyumlu bir sabit açılı rotorla donatılmış bir santrifüj kullanarak, lizatı bir saat boyunca 20.000 G'de netleştirin. FPLC'yi Yöntem penceresi altında programlayın, berraklaştırılmış lizatı numune pompası aracılığıyla yükleyin ve sütunu metin makalesinde açıklandığı gibi istenen A, B, C, D tamponu ve elüsyon tamponu hacimleriyle yıkayın. Çalıştırma bittiğinde, SDS-PAGE kullanarak tepe fraksiyonlarının 10 mikrolitresini analiz edin.
Pik fraksiyonları istenen saflıkla birleştirin ve daha fazla SDS-PAGE analizi için kombine elüatların yaklaşık 50 mikrolitresini saklayın. FPLC'yi kullanarak SEC sütununu dengelemeye başlayın ve anti-FLAG elüatını 50 mililitrelik bir süper döngü ile yükleyin. SEC arabelleğini çalıştırdıktan sonra, SEC ayrımının gece boyunca dört santigrat derecede gerçekleşmesine izin verin.
Monomer, dimer ve daha yüksek dereceli oligomerik pikleri ayırt etmek için elüsyon profilini standart HTT elüsyon profiliyle karşılaştırın. Monomerik HTT fraksiyonlarını SEC kolonunun elüsyon profiline göre toplayın ve istenirse, daha yüksek dereceli oligomerik ve dimerik HTT fraksiyonlarını ayrı ayrı bir havuzlayın. Havuzlanmış HTT proteinini, dört santigrat derecede 100 kilodaltonluk bir santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre edin.
Protein konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, kriyo-güvenli bir mikrosantrifüj tüpünde saflaştırılmış HTT proteininin 100 mikrolitresinden daha az aliquot. Sıvı azot kullanarak alikotları flaşla dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Tüm analitik SEC-MALS'leri HPLC sisteminde dört santigrat derecede gerçekleştirin, bir UV dedektörü, çok açılı bir ışık saçılma dedektörü, bir diferansiyel kırılma indisi dedektörü ile birlikte ve HTT için kırılma indisi artışı olarak 0,185 kullanın.
Pompayı ve dedektörleri filtrelenmiş HPLC sınıfı suyla temizleyin ve UHPLC kolonunu sisteme bağlayın. Tüm dedektör sinyalleri taban çizgisine ulaşana kadar sütunu filtrelenmiş suyla ve ardından SEC-MALS tamponuyla dengeleyin. Enjeksiyon başına 15 dakika boyunca dakikada 0.3 mililitre akış hızında iki mikrolitre BSA çözeltisi enjekte edin.
BSA profiline göre veri kalitesini inceleyin, normalleştirme, tepe hizalama ve bant genişletme düzeltmesi gerçekleştirin ve aşağıdaki HTT örnek çalıştırmaları için bir şablon oluşturun. FL Q23-HTT numunesinin bir şişesini şamandıra kullanarak oda sıcaklığında bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün. HTT'yi 0,1 mikrometrelik bir spin filtresinden süzün.
HTT örneğinin iki ila dört mikrolitresini enjekte edin ve dakikada 0.3 mililitre akış hızında dört santigrat derecede 15 dakika boyunca çalıştırın. Beraberindeki yazılımı kullanarak kromatografik ve ışık saçılma verilerini analiz edin ve her tepe noktası için ağırlık ortalaması moleküler kütlesini belirlemek için bir Zimm grafiği oluşturun. Bu çalışmada, iki aşamalı bir kolon işlemi kullanılarak, HTT için% 95'ten daha fazla saflık elde edildi ve ana kirletici, anti-FLAG afinite saflaştırma adımı sırasında magnezyum klorür ve ATP ile kapsamlı yıkama ile elimine edilen şaperon Hsp70 idi. FL HTT'nin aşırı ekspresyonu proteinin parçalanmasına neden olabilir, ancak FL Q23-HTT, 350 kilodaltonluk doğru moleküler ağırlığa sahip tek bir bant olarak çözülen yöntemle üretilen FL Q23-HTT'nin hayır parçalanma.
FL Q23-HTT ile antikorların reaksiyonundan sonra yapılan Western blot analizi, proteinin, fragmanla ilgili herhangi bir ek bant gözlenmediğinden, önemli tespit edilebilir kesilmeler olmadan izole edildiğini göstermiştir. FL HTT poli-Q uzunluk varyansı, Q23, Q48 ve Q73, Western lekesinde beklendiği gibi reaksiyona girdi ve artan Q uzunluğu ile ilişkili poli-Q yönelimli monoklonal antikor MW1 için giderek daha güçlü bir sinyal gösterdi. Test edilen HPLC sütunları arasında, SEC sütunu HTT monomeri ve dimer arasında yeterli çözünürlük gösterdi, böylece molar kütleler ayırt edilebildi.
SEC'den saflaştırılmış FL HTT, oligomerizasyon durumlarına karşılık gelen çoklu bantlar gösterdi; bu, jel içindeki göç sırasında daha yüksek dereceli oligomerlerin oluşumuna katkıda bulunan birkaç hidrofobik yamanın varlığından kaynaklanıyor olabilir. Saflaştırılmış HTT, mavi yerli PAGE'de, sırasıyla HTT'nin monomerik, dimerik ve trimerik türlerini temsil eden tahmini moleküler ağırlığı 643, 927 ve 1.070 kilodalton olan üç ana bant gösterdi. Saflaştırılmış huntingtin'in uygun şekilde kullanılması, çözünür agregalarda yüksek dereceli oligomerlerin üretilmesini önlemek için esastır.
Son kullanıcının, flaş dondurmadan önce numuneyi önceden soğutulmuş tüplere dağıtmak için hızlı bir şekilde çalışması zorunludur. Uzun süreli stabilite testi, eksi 80 santigrat derecede uzun sürelerde saklanan numuneler üzerinde gerçekleştirilebilir. Tekrarlanan HPLC SEC-MALS analizleri, numunenin monomerik içeriğinde herhangi bir değişiklik olup olmadığını doğrulayacaktır.
