이 작품은 CHDI 재단과 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 주로 투자 되었다. 우리 감사 합니다 박사 소피 Vieweg 유용한 토론에 대 한이 새로운 식 시스템의 개발 및 Lashuel 그룹의 다른 구성원 중이 식 시스템으로 그들의 경험을 공유 하기 위한 그들의 입력 및 귀중 한 피드백. 우리는 또한 ULP1 플라스 미드를 제공 하기 위한 교수 올리버 Hantschel 감사 합니다. 저자 박사 존 B. 워너와 박사 Senthil K. Thangaraj 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사

저자 들은이 문서의 내용으로 관심 없음 충돌 선언 합니다.

이 프로토콜에서 우리가 설명한 효율적인 절차를 얻는 밀리 그램 양의 네이티브, 없는 Httex1에 대 한 23 또는 43 글루타민 잔류물을 포함 하. 이 Httex1는 그의 C-터미널 융합으로 표현 하 여 달성 되었다6-아이맥 세포 lysate에서 융해 단백질을 사용 하 고 Httex1의 HPLC 정화 전에 죽 습 스모 태그. 스모 전략 다른 여러 가지 단백질의 생산에 사용 되었습니다, 우리의 방법이 보여준다는 스모 본질적으로 생성 하는 데 사용 또한 수 있는 독특한 속성 무질서, 집계 경향이 이전 되 고 입증 하는 amyloidogenic 단백질 43,44를 생산 하 고 처리 하기 매우 어려운. 선물이 프로토콜 "품행" 단백질의 생성에 대 한 간단 하 고, 사용 하기 쉬운 프로토콜 비교입니다. 스모 퓨전 solubilizes 고 표현과 아이맥 정화 단계 동안 Httex1를 안정 시킨다. 태그 집계 intein 전략10 와 관찰의 조 숙한 분열은 더 이상 문제가.
본질적으로 무질서 단백질은 특히 저하에 취약. N 맨끝 저하 N17 지역에서이 프로토콜을 사용 하 여 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 Httex1의 PRD에 잘림 발생할 수 있습니다. 잘린된 단백질은 hydrophobicity, 크기 및 Httex1에 매우 비슷합니다, 크로마 방법으로 그들을 제거 하는 것은 도전적 이다, 따라서 그것은 첫번째 장소에 있는 그들의 대형을 방지 하기 위해 좋은. 프로토콜에 밀접 하 게 튀어나와, 얼음에 항상 노력 하 고 충분 한 양의 protease 억제제를 사용 하 여 데 도움이 됩니다 관찰된 자르기의 수준을 매우 낮게 유지. Httex1의 C-말단에 융합 태그 적용 제거할 수 잘림 PRD에 쉽게 잘린된 단백질 뿐만 아니라 선호도 태그를 잃을 것 이다. 그러나, 기본 시퀀스 Httex1 프롤린과 우리의 지식 최선을 끝나는 대로이 옵션을 적용할 수 없습니다 유지 하는 경우 프롤린 후 traceless 고 효율적인 분열을 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 C 터미널 퓨전 태그가 없습니다 있다.
프로토콜의 가장 중요 한 부분은 스모 태그의 분열 후 ULP1에 의해 해방 하는 Httex1의 처리입니다. 단백질은 RP HPLC에 의해 즉시 정화 한다. 다행히, 이것은 일반적으로 4 ° c.에 10-20 분에 완료 되는 효율적이 고 빠른 반응 대조적으로, intein 전략 수익률을 극대화 하기 위해 절충 한 불완전 한 분열 및 시작 집계 백업은 intein의 완전 한 분열에 대 한 몇 시간을 필요 합니다. 빠른 검사 결과 돌연변이 Httex1를 위한 시작 됩니다 23Q 이체는 긴 시간에 대 한 안정적인 반면 분열 반응에 비교적 높은 농도에서 집계. RP HPLC 정화 중 스모의 또 다른 장점은 드러납니다: 스모 더 친수성 이며 C4 반전 단계 열에서 완전히 elutes Ssp DnaB intein 소수는 열에 강하게 집착 하는 동안. 상업적인 ULP1는 매우 비용이 많이 드는, 단백질 고수익 이전 게시 프로토콜29다음에 쉽게 생산 수 있습니다.
Httex1를 사용 하 여 이전 피의 프로토콜 적용의 중요 수 없습니다 충분히 강조. Httex1 같은 동결 건조 된 polyQ 단백질 안정 및 저장된 오랜 기간 수 있지만 물과 버퍼에 완전히 용 해 되지 않습니다. 미리 형성한 올리고 또는 소의 존재는 집계 속도 론 및 단백질45의 생물 속성에 큰 영향을 있을 수 있었다. 여기에 설명 된 피의 프로토콜 단백질의 피의 미리 형성한 집계의 제거 및 동결 건조 된 샘플에서 단위체 Httex1의 솔루션의 수 있습니다. Httex1로 얻은 스모 및 intein 전략에 대 한 비슷한 집계 속도 론 및 fibril 형태학을 관찰 합니다.
Httex1 생산을 위한 이전 방법에 비해, 여기에 설명 된 스모 전략 몇 가지 장점이 하 고 구조를 조사 하기 위해 가능한 연구의 범위와 건강 및 질병에이 단백질의 기능적 속성을 확장 합니다. 스모-Httex1 융합 단백질은 취급 하기 쉽다, 그것 수 있습니다 동결 및 저장 하거나 무료 mHttex1 것이 신속 하 게 집계 하는 동안 상 온에서 24 h에 대 한 솔루션에 유지. 안정성과 스모 Httex1 융합 단백질의 높은 가용성 단백질을 조작할 수 없는 가능한 분열 후 mHttex1으로 효소와 화학 수정 소개 하 더 큰 유연성을 제공 합니다. 이 소개를 포함 한다 포스트 번역 상 수정, fluorophores, 스핀 레이블, biotin 태그, 등 여기에 제시 된 발전 한다 1) Httex1;의 구조-기능 관계를 명료 하 게 미래 연구를 용이 하 게 2) 생성 하는 새로운 도구를 조사 Htt 집계 및 병리학 확산; 3) 활성화 돌연변이 Httex1 안정 하 고 그 집계;를 방지 하는 분자를 식별 하는 새로운 분석 실험의 개발 그리고 4)이이 단백질에 작동 하 고 치료약을 찾기 위해 Huntington의 질병에 대 한 우리의 모험을 가입 하 려 다른 분야에서 과학자.

Htt 348 kDa 단백질 이며 여러 가지 생리 기능1에 연루 되어 있다. Htt의 N-말단에 이상 36 잔류물의 확장된 polyQ 지역 포함, HD2,3발생 합니다. HD 병 리 세포 포함이 고 피 질 신경 죽음, 영향을 받는 조직4,5의 위축에 의해 특징입니다. PolyQ 반복 요로 포함 하는 여러 N 맨끝 Htt 조각 HD 환자에서 사후 두뇌에서 발견 된 고 huntingtin 단백질6의 분해 처리에 의해 생성 될 것으로 생각 되. 최근 연구 결과 Httex1를 벗어난 mRNA 접합에 의해 형성 될 또한 것이 좋습니다. Httex1 병 적인 polyQ 돌연변이 포함 하 고 동물에서의 overexpression HD7, 따라서 HD 병리학과 질병 진행6,이 조각의 가능한 중앙 역할을 강조의 핵심 기능 중 많은 정리 수 있습니다. 8,9.
때문에 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 확장된 polyQ로, 기존 식 시스템의 대부분은 단백질 Httex1의 과도 융합에 기반 (티-S-전이 효소 (GST), thioredoxin (TRX) 등 또는 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 및 펩 티 드 (폴 리 히스티딘) 차동의 식, 안정성, 정화 및 용 해도10,,1112,13,14 개선 하는 ,15,16,17,18,19,20,,2122,23 ,,2425,26,,2728. 퓨전 파트너 프로 테아 제 트립 신 등의 분열 사이트를 포함 하는 짧은 시퀀스와 Httex1에 연결 되어, 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 또는 분열 및 집계의 개시 전에 Httex1의 출시에 대 한 허용 하는 PreScission 또는 정화입니다. 비 traceless 분열으로 인해 추가 잔류물 및 불완전 쪼개 짐 (때문이 아니라 Httex1의 시퀀스 내에서 miscleavage로 잘린 조각의 창조의 가능성을 포함 하는 이러한 방법의 단점 Vieweg 외. 장점 및이 방법의 제한에 더 심층적인 토론 참조)10. 이러한 한계를 해결 하기 위해 우리는 최근 Synechocystis sp. 의 임시 N 맨끝 퓨전을 이용 하 여 처음으로 기본 태그 무료 Httex1의 생성을 활성화 하는 식 전략 개발 (Ssp) DnaB intein Httex110. Intein 분열 traceless 이며 특정 단백질의 밀리 그램 수량을 산출 하는 동안 그것은 여전히 수익률을 줄일 수 있는 두 가지 단점이 겪고 있다: 즉, 조 분열 식, 및 분열을 통해 나타나는 사실 중 발생할 수 있는 intein의 특히 반복 확장 된 polyQ와 Httex1에 대 한 집계 인 단백질의 손실로 이어질 수 있는 몇 시간.
이러한 한계를 해결 하 고 아메리카의 생산을 위한 우리의 전략을 수정 하기 위해 태그 무료 Httex1, 우리 시스템을 개발 새로운 식 스모, 더 정확 하 게는 효 모 체 Smt3 Httex1에 과도 융합에 따라. 재조합 단백질의 생산을 위한 스모 시스템의 응용 프로그램 200429, 식의 증가 속도 스모 융해 단백질의 용 해도 시연 했다에 처음 출판 되었다. 스모 태그 인식 사이트를 필요 하지 않습니다 하지만 스모의 3 차 구조를 인식 하 고 실질적으로 miscleavage30의 가능성을 제거 하는 단백질 특정 효소 1 (ULP1) 같은 유비퀴틴에 의해 죽 습 있을 수 있습니다. 또한, ULP1 중재 분열 및 traceless 이며 뒤에 추가 잔류물을 떠나지 않습니다. 퓨전 태그의 조 숙한 분열 autocatalytic intein10관찰은 완전히 피할 수는 외부 효소의 요구에 의해. 스모 전략은 재조합 단백질 생산31,,3233요즘 널리 이용 된다, 하는 동안 우리가 보여이 문서에는 본질적으로 무질서의 세대를 위해 특히 유용 하다 Httex1 같은 집계 경향이, amyloidogenic 단백질. 우리는 믿고 단순성, 효율성 및 우리의 스모 퓨전-기반 방법의 견고성은 네이티브, 태그 무료 Httex1 더 액세스할 수 있도록 연구를 다른 분야에서 생체 외에서 Httex1의 비고유 시퀀스를 사용 하는 필요를 제거 . 이것은 Httex1의 구조-기능 관계를 명료 하 게 하는 미래 연구를 촉진 하는 중요 한 사전 이다.
프로토콜 설명 세균성 문화의 12 L에서 Httex1의 정화 하지만 프로토콜 쉽게 작은 또는 큰 규모 프로덕션에 대 한 적응 될 수 있습니다. 프로토콜 (wtHttex1) 야생 타입 Httex1의 생산에 설명 합니다 (23Q) 아래 polyQ 반복 길이 및 돌연변이 Httex1 (mHttex1)는 polyQ로 (43Q) 위에 길이 병원 성 임계값 (36Q) 반복.

<table><tbody><tr><td>Uranyl formate (UO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(CHO2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Substance Dulbecco&#039;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (Miller&#039;s LB Broth)</td><td>&amp;nbsp;Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&amp;nbsp;Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168.P0</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10 &amp;micro;m C4 300 &amp;Aring;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer semi-micro cuvette</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, 1/16&quot; fittings (&amp;Auml;KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;100 kD Microcon&amp;nbsp; fast flow filters</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta 900 equipped with a fraction collector&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Circular Dichroism</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC system&amp;nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&amp;nbsp; , preheated column (40 &amp;deg;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>waters HPLC system</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lyophylizer instrument</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&amp;nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C shaking&amp;nbsp; incubator</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Huntington의 질병 (HD) CAG 확장 (≥36)에 의해 발생 하는 상속 된 치명적인 신경 질환 HD 유전자의 첫 번째 엑손에서 Huntingtin 단백질 (Htt) 식의 결과로 또는 N 맨끝 확장된 polyglutamine (그 조각 polyQ) 스트레칭입니다.
Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1는 휴대에 HD의 기능의 대부분을 작은 Htt 조각 및 동물 모델 Htt의 가장 널리 공부 조각 중 하나입니다. Httex1의 작은 크기는 더 이상 조각 또는 전장 Htt에 비해 표준 및 고해상도 기술을 사용 하 여 생물 특성을 실험적으로 더 많은 의무가 있습니다. 그러나, 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 증가 polyQ 콘텐츠 (≥42)는 어렵게 효율적인 표현과 충분 한 수량에이 단백질을 생산 하 여 그들을 액세스할 수 있도록 정화 시스템 개발 융해 단백질 또는 단백질의 기본 순서를 변경 하는 다른 전략을 사용 하지 않고 다른 분야에서 과학자. 우리는 강력 하 고 최적화 된 방법을 여기 제시 밀리 그램 양의 네이티브의 생산에 대 한 태그-무료 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Httex1. 단순 하 고 전략의 효율성 Httex1, 따라서이 단백질 더 연구자에 게 편리 하 고 다른 실험실에서 실험의 재현성을 향상의 기본이 아닌 시퀀스를 사용 하는 필요를 삭제할 것 이다. 우리는 이러한 발전 또한 Htt로 개발 새로운 진단 도구 및 치료 치료 또는 HD의 진행을 느리게의 구조-기능 관계를 elucidating 겨냥 하는 미래 학문을 촉진 믿습니다.

Httex1는 N 맨끝으로 대장균 에 표현 된다 그의6-스모 태그. 표현과 융해 단백질의 정화의 대표적인 결과 그림 1에서 요약 된다. Httex1 시퀀스 Htt와 Ala2, 시작의 잔류물 2-90 Met1 있기 때문에 완전히 쪼개진 vivo에서42로 구성 됩니다. 23Q 변종 가리킵니다 아미노산의 번호 매기기, 표현된 융해 단백질의 완전 한 순서 그림 1에 표시 됩니다. 플라스 미드는 지역 사회와 공유 하는 가까운 장래에 Addgene에서 예금 될 것 이다. 플라스 미드와 표현된 융해 단백질의 회로도 그림 1B에 표시 됩니다. 융해 단백질의 대부분은 세포의 용 해, 모두는 23Q 및 43Q 변종에 대 한 후 성 분수에 및 His6-스모 Httex1 중간 수준 (그림 1C)에서 표현. 융해 단백질은 분자량에 따라 예상 보다 높은 마이그레이션합니다. 이것은 부분적으로 스모의 강한 배 주로 글루타민, 프롤린 잔류물을 포함 하는 Httex1의 특이 한 시퀀스 구성 때문입니다. Wildtype (23Q)와 돌연변이 (43Q) 융합 단백질 아이맥 (그림 1D) 공동 호스트 단백질 정화의 존재는 Httex1와 큰 샘플의 비교적 낮은 식 수준에 의해 설명 될 수 있다 하 여 ~ 80% 순도 농축 수 볼륨에는 열에 적용입니다.
그의 분열6-스모 태그와 Httex1의 정화 그림 2A에 표시 됩니다. UPLC는 그의 분열을 모니터링 하는 효율적인 도구입니다6-스모 태그 (그림 2B). 융해 단백질의 원래 피크 소비와 두 개의 새롭고 잘 분리 된 봉우리는 그에 해당6-스모 태그와 Httex1 나타납니다. 분열 반응 10-20 분에 완료 됩니다. 서쪽 오 점 (WB) 분열 반응을 효율적으로 모니터링 하는 데 너무 느립니다 하지만 참조용 스모 분열의 완전성을 설명 하기 위해 그림에 포함 되었습니다. 두 Httex1 23Q와 43Q는 그의에서 잘 분리 될 수 있다6-스모 라인란트-HPLC (그림 2C) 하 여 태그와 UPLC, MS 및 SDS 페이지 분석 (그림 2D)와 같이 고 순도에서 얻어 졌다.
이 방법으로 준비 하는 Httex1 단백질 Httex1의 예상된 집계 속성을 유지, 우리는 침 강 분석 결과 의해 37 ° C에서 Httex1 돌연변이의 fibrillization 활동 평가 설명 하기 위해 CD에 의해 이차 구조에 변화를 모니터링 분광학, 편으로 집계의 형태 특징. MHttex1 fibril 형성 침전 분석 결과 의해 결정 된 대로의 집계 활동의 대표적인 데이터 집합그림 3A에 표시 됩니다. 수용 성 Httex1 fibril 형성으로 인해 시간이 지남에 따라 43Q UPLC 여 계량 했다의 손실. 우리 보육의 48 시간 후 수용 성 단백질의 완전 한 고갈을 관찰합니다. 또한, 우리는 CD 분광학 (그림 3B)에 의해 단백질의 이차 구조를 결정. Httex1 43Q 교대에서 구조화 되지 않은 (λ분 205 nm) 주로 β 시트 풍부한 구조 (λ분 215 nm) 외피의 48 시간 후에. 이 구조적인 변화는 48 시간 (그림 3C)에서 가장에 의해 관찰로 긴 원 집계의 형성으로 동반 된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> 그림 1 . 식과 정화는 그의6-스모 Httex1 융합 단백질.  (A)는 그의 아미노산 시퀀스6-스모-Httex1-QN 퓨전 구문 (그의6-스모 녹색에서 및 주황색에서 Httex1 QN ); (B) 표현과; 융해 단백질의 정화의 도식 개요 (C) 식과 세포; 후 융합 단백질의 용 해도의 SDS 페이지 분석 융해 단백질의 아이맥 정화 및 SDS 페이지 분수의 분석 (D) 크로마 (빨간 바: 언바운드 분수, 블루 바: 세척 분수, 검은 바: 분수 차입 피크 포함 된); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> 그림 2 . 그의 분열6 스모 태그 및 태그 무료 Httex1 QN 단백질의 정화. (A) 회로도 개요; UPLC에 의해 ULP1와 스모 태그의 분열의 (B) 분석 (파란색: ULP1;의 추가 하기 전에 블랙: 20 분 (23Q), 각각 10 분 (43Q) ULP1의 추가 후에) 및 WB (MAB5492 1: 2000, 보조 염소 안티 마우스 항 체 1: 5000); Httex1;의 대리점 RP HPLC 정화의 (C) 크로마 D: UPLC에 의해 순화 Httex1의 분석 SDS 페이지와 ESI-MS; 예상된 분자량 각각 9943 다 (23Q)와 12506 다 (43Q) 이다. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> 그림 3 . Httex1-43Q의 집계: UPLC에 따라 (A) 침전 분석 결과. (B)와 48 h에 집계의 48 h. (C) 가장 현미경에서 이차 구조의 CD 스펙트럼 (스케일 바는 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K 조회수.  Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). 여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

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Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.

We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the cell, ATP. The ETC is composed of 5 massive protein complexes, which also assemble into supercomplexes called respirasomes (C-I, C-III, and C-IV) and synthasomes (C-V) that increase the efficiency of electron transport and ATP production. Various methods have been used for over 50 years to measure ETC function, but these protocols do not provide information on the assembly of individual complexes and supercomplexes. This protocol describes the technique of native gel polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), a method that was modified more than 20 years ago to study ETC complex structure. Native electrophoresis permits the separation of ETC complexes into their active forms, and these complexes can then be studied using immunoblotting, in-gel assays (IGA), and purification by electroelution. By combining the results of native gel PAGE with those of other mitochondrial assays, it is possible to obtain a completer picture of ETC activity, its dynamic assembly and disassembly, and how this regulates mitochondrial structure and function. This work will also discuss limitations of these techniques. In summary, the technique of native PAGE, followed by immunoblotting, IGA, and electroelution, presented below, is a powerful way to investigate the functionality and composition of mitochondrial ETC supercomplexes.

This protocol describes the separation of functional mitochondrial electron transport chain complexes (Cx) I-V and supercomplexes thereof using native electrophoresis to reveal information about their assembly and structure. The native gel can be subjected to immunoblotting, in-gel assays, and purification by electroelution to further characterize individual complexes.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

유전학

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 kDa. While the cellular function of FL HTT is not entirely understood, a mutant expansion of the polyQ tract above ~36 repeats is associated with Huntington's disease (HD), with the polyQ length correlating roughly with the age of onset. To better understand the effect of structure on the function of mutant HTT (mHTT), large quantities of the protein are required. Submilligram production of FL HTT in mammalian cells was achieved using doxycycline-inducible stable cell line expression. However, protein production from stable cell lines has limitations that can be overcome with transient transfection methods. 
This paper presents a robust method for low-milligram quantity production of FL HTT and its variants from codon-optimized plasmids by transient transfection using polyethylenimine (PEI). The method is scalable (&gt;10 mg) and consistently yields 1-2 mg/L of cell culture of highly purified FL HTT. Consistent with previous reports, the purified solution state of FL HTT was found to be highly dynamic; the protein has a propensity to form dimers and high-order oligomers. A key to slowing oligomer formation is working quickly to isolate the monomeric fractions from the dimeric and high-order oligomeric fractions during size exclusion chromatography. 
Size exclusion chromatography with multiangle light scattering (SEC-MALS) was used to analyze the dimer and higher-order oligomeric content of purified HTT. No correlation was observed between FL HTT polyQ length (Q23, Q48, and Q73) and oligomer content. The exon1-deleted construct (aa 91-3,144) showed comparable oligomerization propensity to FL HTT (aa 1-3,144). Production, purification, and characterization methods by SEC/MALS-refractive index (RI), sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE, and Blue Native PAGE are described herein.

We provide scalable protocols covering construct design, transient transfection, and expression and purification of full-length human huntingtin protein variants in HEK293 cells.

일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide (AON)-mediated therapy. While SMN1 mutations are responsible for the disease, AONs targeting intronic splice silencer (ISS) sites in SMN2, including FDA-approved nusinersen, have been shown to restore SMN expression and ameliorate the symptoms. Currently, many studies involving AON therapy for SMA focus on investigating novel AON chemistries targeting SMN2 that may be more effective and less toxic than nusinersen. Here, we describe a protocol for in vitro evaluation of exon inclusion using lipotransfection of AONs followed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and Western blotting. This method can be employed for various types of AON chemistries. Using this method, we demonstrate that AONs composed of alternating locked nucleic acids (LNAs) and DNA nucleotides (LNA/DNA mixmers) lead to efficient SMN2 exon inclusion and restoration of SMN protein at a very low concentration, and therefore, LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides may be an attractive therapeutic strategy to treat splicing defects caused by genetic diseases. The in vitro evaluation method described here is fast, easy, and sensitive enough for the testing of various novel AONs.

Various antisense oligonucleotides (AONs) have been shown to induce exon inclusion (splice modulation) and rescue SMN expression for spinal muscular atrophy (SMA). Here, we describe a protocol for AON lipotransfection to induce exon inclusion in the SMN2 gene and the evaluation methods to determine the efficacy in SMA patient fibroblasts.

평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

의학

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

신경과학

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

생물학

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...