Bu yöntem, insan karaciğeri simerik fare modeli, ailesel hiperkolesterolemi nasıl üretilir gibi alandaki önemli soruları yanıtlamadı. Bu tekniğin en büyük avantajı in vivo ilaç testleri yapılmasına olanak sağlamasıdır. Bu teknik ailesel hiperkolesterolemi tedavileri için sendikasyon vardır.
Bu hastalık için yeni bir tedavi olarak, bu tür cihimeric hayvan modelleri kullanılarak test edilebilir. Bu yöntem ailesel hiperkolesterolemi içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer kalıtsal karaciğer hastalıklarına uygulanabilir. Engraftment önce 24 saat, fare başına ekstrasellüler matris 40 mikrolitre çözülme, bir buzluk yerleştirerek, soğuk bir odada.
Her fare nin enjekte edilmesi için bir insülin şırıngasını ve dört derecelik santigrat buzdolabında 200 mikrolitrelik bir kutuyu soğutun. Engraftment bir saat önce, hücre dissosyasyon enzimi Sıcak, DNAase mililitre başına 50 mikrogram ile takviye 1, oda sıcaklığına ve yer RPMI 1640 orta, buz üzerinde yüzde 20 serum replasmanı ile takviye. Hücre morfolojisi, büyüme ve hücre yoğunluğu da dahil olmak üzere durumlarını kaydetmek için iHeps faz kontrast görüntüleri alın.
Daha sonra, oda sıcaklığında kalsiyum ve magnezyum iyonsuz PBS 2 mililitre ile iHeps her kuyuyı yıkayın ve daha sonra her kuyuya önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma enziminin bir mililitresini ekleyin. Hücreleri 8-10 dakika boyunca kuvöze geri verin. Hücre morfolojisini mikroskop altında izleyin.
Hücrelerin çoğu yuvarlak hale geldiğinde, iyi başına soğuk orta eşit hacimde ekleyin, pipet yavaşça plaka ayırmak için hücreleri, ve yeni bir hücre süspansiyon aktarın 15 mililitrelik tüp. Bu adım hepatosit güvenilirliği için çok önemlidir. Hücreler plakadan ayrılması zorsa, bazıları plakaüzerinde bırakılabilir.
Ve eğer hücreler ayrışırsa, santrifüjden sonra pipet yavaşça tek hücreli süspansiyon elde etmek için. Neredeyse tüm bağlı hücreler toplanana kadar her kuyu için hücre ayırma yordamını tekrarlayın. Sonra 200 gr'da santrifüj, dört derece santigrat derecede üç dakika.
Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve on beş mililitre tüp soğuk PBS iki mililitre ile hücreleri yeniden askıya. Pipet hücreleri yavaşça tek hücreli süspansiyon elde etmek için. Daha sonra, agregaları kaldırmak için 40 mikron hücreli süzgeç aracılığıyla hücreleri geçmek.
Normalde, yaklaşık bir ila iki milyon hücre birkaç-ter-ing sonra hasat edilebilir. Daha sonra, hücre süspansiyon 20 mikrolitre için yüzde 0,4 Trypan mavi çözeltisi mikrolitre ekleyin. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonkonsantrasyonu kaydedin C.Fare başına bir milyon hücre enjekte etmek için gerekli hücre süspansiyon hacmini hesaplayın.
Daha sonra gerekli hücre süspansiyon hacmini 15 mililitrelik tüplere ayırın ve 200 g'da santrifüjü dört santigrat derecede üç dakika ayırın. Süpernatant'ı çıkardıktan sonra, fare başına 27,5 mikrolitre soğuk PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Ve sonra fare başına 55 mikrolitre son hacmi için ekstrasellüler matris eşit hacimekleyin.
Şimdi, soğuk insülin şırıngalarından birini buza koy. Pistonun fişini çekin, 55 mikrolitre hücre süspansiyonu şırınganın içine aktarın ve sonra pistonu geri koyun. Kabarcıkları dikkatlice boşaltın ve şırıngayı tekrar buza koyun.
Enjeksiyon işlemine başlamadan önce LRG farelerinin düzgün bir şekilde anestezi altına alındığından emin olun. Anestezi işlemi sırasında kuruluk önlemek için gözler üzerinde veteriner merhem uygulayın. Fare stimülasyon için kas refleks kaybettikten sonra, sağ, lateral, dekübitus pozisyonda yerleştirin.
Sol kanattaki kesi bölgesine kalın bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın ve 5-8 dakika bekletin. Bir su nemlendirilmiş gazlı bez ped ile alanı silerek tüy dökücü krem ve saç çıkarın. Sol kanadı yüzde 70 etanolle üç kez temizleyin.
Daha sonra sol kanatta görülebilir dalak, bulmak. Dezenfeksiyon için betadine ile son bir sırılsıklam izledi. Deri ve karın duvarında 0,5 ila bir santimetrelik bir kesi yapmak için makas kullandıktan sonra, çevredeki yağ dokusunu yavaşça çekerek dalağını dışlaştırmak için forceps kullanın.
Bir bez kullanarak dalağını yavaşça stabilize edin. İnsülin şırıngasının iğnesini dalak parankimine 3-4 milimetre yerleştirin ve yaklaşık 50 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. İğneyi geri çekin ve kanamayı ve malzeme dökülmesini önlemek için bir dakika boyunca enjeksiyonüzerine pamuklu bir bez yerleştirin.
Dalağını peritoneye geri ver ve yarayı beş-oh naylon dikişlerle kapatın. Dikiş sonra, yiyecek ve suya kolay erişim ile temiz bir kafese fare yerleştirin. Omurgaya paralel olarak alçalan aort görünür böylece taze ötenazi fareden iç organları kaldırarak başlayın.
Sonra bitişik doku kesip ve kalp kaldırın. Aort incelemek için ince makas kullanın, soğuk içine her biri yerleştirerek, oksijenli Krebs çözeltisi. Koleksiyondan sonra Krebs çözeltisindeki aort aortu silikon kaplı Petri kabına aktarın.
Bağlama dokusunu sabitlemeden aort pozisyonunu düzeltmek için sabitle. Steril bir mikroskop altında, damar duvarına zarar vermeden çevredeki yağ ve adventif dokudan arınmış aortu incelemek için ince çalgılar ve yayma makas kullanın. Sonra bir buçuk ila iki milimetre uzunluğunda parçalar halinde her aorta kesin.
Sonra, 40 mikron kalınlığında paslanmaz tel iki santimetre uzunluğunda parça kesilmiş ve yavaşça aort lümen içine takın. Tel miyograf odasına segment imal etmek için tel tutun, oksijenli Krebs çözeltisi ile dolu. Kontraktilite yi incelerken aort segmentlerinin uzunluğunu ölçmek için, her segmenti çenelerin arasına dik olarak yerleştirin ve D1 okumasını mikrometreye kaydedin.
Sonra segmenti çıkarın ve birlikte çeneleri hareket ettirin. D0 okumasını kaydedin ve segmentin uzunluğunu hesaplayın. Daha sonra teli kenetle ve tornavida ile sabitleyip gerilmemiş parçayı çenelerin arasına yerleştirin.
Denemeden önce normalleştirme için miyografı gerilmemiş konumda sıfıra ayarlayın. Sonra yavaşça çeneleri birbirinden ayırın ve aort geriliminin üç milinewton'a ulaşana kadar değiştiğini gözlemleyin. 15 dakika sonra, miyograf odasından çözeltiyi boşaltın ve taze Krebs çözeltisi ile değiştirin.
15 dakika daha bekledikten sonra gerilimi tekrar üç milinewton'a ayarlayın. Daha sonra standart Krebs çözeltisini 60 milimolar potasyum klorür ile desteklenmisin ve en az on beş dakika kasılmayı teşvik edin. Taze Krebs çözeltisi ile üç kez durulayın, sonra fenilefrin artan konsantrasyonları ekleyin.
Örneğin, 10 nanomolar 100 mikromolar. Sonra, standart Krebs çözeltisi ile yıkandıktan sonra, fenilefrin tek bir konsantrasyon ekleyin, maksimal daralma yaklaşık yüzde 70. Daralma kararlı olduğunda, iki dakikalık aralıklarla asetilkolin artan konsantrasyonları ekleyin.
Örneğin, vazodilatasyon neden on ila otuz mikromolar için bir ila üç nanomolar. Bu resim, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör-eksik iHeps ile repopulated bir fare karaciğerinde insan albumin boyama temsili bir bütün bölüm taranmış görüntü gösterir. Oklar fare karaciğerine aşılanmış insan iHeps kümelerini gösterir.
Engrafted insan iHeps kümeleri burada daha ayrıntılı olarak görülür. Bu scatterplot grafiği, farklı donör iPSC'lerden fare karaciğerinde alanları içeren iHep'e karşılık gelen yeniden doldurulan insan albumin pozitif hücrelerinin yüzdesini gösterir. Bu bir fare karaciğerinde insan çekirdekleri için immünohistokimyasal boyama temsili bir görüntü, engrafted ailesel hiperkolesterolemi iHeps ile.
Çubuk grafik, LRG fare karaciğerlerinde farklı donör iPSC'lerden yeniden doldurulan insan çekirdekleri pozitif iHeps yüzdesini gösterir. Bunlar, fare karaciğerinin arka arkaya iki kesitinde insan albumini ve insan çekirdeğinin boyanarak, vahşi tip iHeps ile yeniden doldurulan temsili görüntüleridir. Son olarak, Bu görüntü ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer simerik farelerde aort endotel bağımlı vazodilatasyon gösterir, asetilkolin artan konsantrasyonlarına yanıt olarak.
Bu videoyu izledikten sonra, insan iPSC kaynaklı hepatositkullanarak, insan karaciğer ihimerik fareler oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
