The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) sonra bilgilendirilmiş onam ve Güney Tirol Eyaleti Etik Kurul onayı imzalı sağlıklı donörlerin insan periferik kan örneklerinden izole edilmiştir. Deneyler Helsinki Bildirgesi ifade esaslar doğrultusunda yapılmıştır. Tüm veriler toplanmış ve anonim analiz edildi. Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMNCs) <ol><li> PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra ince beyaz kat elde edilen. <ol><li> Sodyum sitrat içine venöz periferal kan 8 mL kan, oda sıcaklığında (25 ° C) &#39;de plastik boru ve mağaza tamponlu. Toplandıktan sonra 12 saat içinde Süreç kan. </li><li> Kapatıldıktan santrifüj fren, bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2000 x g&#39;de tüp santrifüjleyin. </li><li> Bulutlu buffy coat (üst plazma fazı ve alt arasındaki katmanı toplayınFaz kriyotüpe tüp içine zenginleştirilmiş PBMNC kısmını (500 ul) ihtiva eden), eritrositlerin en ihtiva etmektedir. </li><li> % 10 DMSO konsantrasyonu ile 1 ml &#39;lik bir toplam hacim elde etmek üzere% 90 FBS ve% 20 DMSO içeren 2x dondurma ortamı içinde 500 ul buffy coat 500 ul yeniden süspanse edin. </li><li> -80 ° C&#39;de, bir hız denetimli dondurma kapta şişeyi dondurun. Daha uzun süreler boyunca sıvı azot içinde mağazası hücreleri. </li></ol></li><li> PBMNCs yoğunluk gradyan ayırma sonrası elde edilen <ol><li> Sodyum sitrat içine venöz periferal kan 12 ml toplamak oda sıcaklığında plastik tüp, ve mağaza tamponlu. Toplandıktan sonra 12 saat içinde Süreç kan. </li><li> 35 ml&#39;lik bir son hacme kadar steril PBS ile kan seyreltin. </li><li> Dikkatli ve yavaş yavaş, katman 50 ml konik bir tüp içinde (yoğunluk gradyan ayırma için kullanılır) polisükroz çözeltisi (p = 1,077), 15 ml seyreltilmiş kan 35 mi (oran 3: 1). </li><li> Oda sıcaklığında, 30 dakika içinde 800 xg&#39;de santrifüj tüpüsallanan bir kova rotor, anahtarlama-off santrifüj frenler. </li><li> Üst, sarı faz içeren plazma aspire ve atın. Dikkatle, yeni 50 ml konik tüp PBMNCs içeren opak beyaz interfaz katmanı aktarın. </li><li> Steril PBS ile 30 ml toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın ve PBS 30 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Tripan mavi eksklüzyonu ile 25 göre canlı hücre sayısı, saymak. </li><li> Santrifüj PBMNCs oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de, süpernatan aspire ve atın. </li><li> 5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek üzere,% 90 FBS ve% 10 DMSO ihtiva eden dondurma ortamına uygun bir miktarda hücre pelletini. </li><li> Kısım başına 1 ml&#39;lik şişe (5 x 10 6 hücre / ml) ve en kabı dondurma hız denetimli bir flakon dondurma - 80 ° C. Daha uzun süreler boyunca sıvı azot içinde mağazası hücreleri. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Çözülme ve PBMNCs ve Kaplama (GÜN 0) <ol><li> PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra ince beyaz kat elde edilen. <ol><li> Dondurulmuş buffy kat arasında PBMNCs kullanarak protokolü başlatmak için 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde hücreleri 1 şişe çözülme ve 2 ml nihai hacme kadar steril PBS ile buffy coat seyreltin. </li><li> 50 ml konik bir tüp içinde seyreltildi buffy coat transfer kırmızı hücre lisis tampon maddesi, 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Kırmızı hücre lisis tampon 500 ml hazırlanması potasyum bikarbonat, 0.5 g amonyum klorür 4,145 g, ultra saf su, 500 ml, pH 7.2-7.4, 0.5 M EDTA çözeltisi 100 ul ekleyin. </li><li> Steril PBS ile 50 ml toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatant atılır ve steril 50 ml PBS ile pelet yıkama, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de buffy coat santrifüj. </li><li> Hücrelerin yeniden süspanseIMDM ve Ham F-12 (oran 1: 1), İnsülin-Transferrin-Selenyum-etanolamin (ITS-X), kimyasal olarak% 1,% 1 Tanımlı lipid Konsantre PBMNC ortamın 1 mi, daha önce oluşan, 22 tarif edilen (KTL),% 1 Penisilin / Streptomisin, L-askorbik asit,% 0.005, Sığır Serum Albümini (BSA)% 0.5, 1-Tiogliserol (nihai konsantrasyon 200 uM), Hücre Faktörü SCF (100 ng / ml) ile kök, İnterlökin -3, IL-3 (10 ng / ml), Eritropoietin (EPO 2 U / ml), insülin-benzeri büyüme faktörü, IGF-1 (40 ng / ml), deksametazon (1 uM) ve holo-transferrin (100 ug / ml ). </li><li> 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta, kaplama olmayan, standart doku kültürü tedavi yüzeyi olan bir 12-yuvalı plakanın bir kuyunun içine aktarın. Orta değiştirme aşamasına kadar (bakınız Bölüm 3), 37 ° C&#39;de, 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> PBMNCs yoğunluk gradyan ayırma sonrası elde edilen <ol><li> Sonra donmuş PBMNCs kullanarak protokolü başlatmak içinyoğunluk gradyanlı ayrıştırma, çözülme 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde hücreleri 1 şişe, PBMNC ortamın 5 ml hücre transfer edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> PBMNC ortam 1 ​​ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta bir 12-yuvalı plakanın bir kuyunun içine aktarın. Orta değiştirme aşamasına kadar (bakınız Bölüm 3), 37 ° C&#39;de, 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile inkübe hücreleri. </li></ol></li></ol> 3. Kültür ve PBMNCs genişletilmesi (GÜN 2-13) <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj, 1 ml ucu olan bir pipet kullanılarak, süspansiyon kültüründe PBMNCs toplayın. </li><li> Süpernatantı atın ve taze PBMNC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Kaplama olmadan, standart doku kültürü muamele edilmiş yüzey ile 12 oyuklu plaka 1 kuyuya hücreleri aktarın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe. </li><liOnlar (% 80 civarında) Uygun izdiham ulaştığınızda 2:&gt; iki günde bu adımları yineleyin ve oranı 1 hücreleri bölmek. </li></ol> Episomal plasmidler ile PBMNCs 4. transfeksiyonu (14. GÜN) Not: Dört ticari intergation içermeyen epizomal plasmidlerin izole gerçekleştirme plazmid arıtma için bir ticari kit kullanılarak pluripotense genleri taşıyan bir agaroz jel analizi kullanılarak saflaştırılmış plasmidler kalitesini değerlendirmek, üreticinin talimatlarına göre yöntem. <ol><li> 15 ml konik bir tüp içinde PBMNCs toplamak ve 25 (tripan mavi dışlama bazında) canlı hücre sayısı. </li><li> Santrifüj oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 2 x 10 6 hücre. </li><li> 100 Tekrar süspansiyona, Tampon T ul ve her bir plazmid DNA 1 ug ihtiva eden transfeksiyon karışımı içinde süspanse 2 x 10 6 hücre (p53 karşı Zeiss OCT3 / 4 ve shRNA taşıyan bir plazmid, bir plazmid taşıyan ve Sox2 Klf4, tek birplazmid L-MYC ve LIN28 taşıyan ve bir plazmid) transfeksiyon verimini kontrol etmek, EGFP taşıyan. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 100 ul ucu içine hücreleri ihtiva eden transfeksiyon karışımı aspire ve elektroporasyon makinesi pipet istasyonuna yerleştirilen Elektrolitik Tampon E2 3 ml ile doldurulmuş tüp içine dikey olarak örnek, pipet yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki programı kullanarak Verimli electroporate hücreler: 1.650 V, 10 msn, 3 bakliyat. </li><li> 0.25 mM sodyum bütirat (NaB) ekleyerek önceden ısıtılmış PBMNC ortamının 2 ml Elektroporasyona tabi tutulan hücreler (2 x 10 6 hücre) yeniden süspanse edin ve 25 (tripan mavi dışlama bazında) elektroporasyon protokolü sonra yaşayan hücrelerin sayısını. </li><li> Kaplama olmadan 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna transfer hücreleri hafifçe plaka kaya ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe hücreleri. </li><li> elektroporasyon, ülkeleri gün sonratransfeksiyon etkinliğini değerlendirmek için, 8-10 rastgele alanlardan floresan mikroskobu altında GFP-pozitif hücrelerin sayısını t. </li><li> MEF&#39;ler (Bölüm 6) bunları kaplama kadar 3 gün boyunca bölme olmadan transfekte hücreleri korumak. </li><li> Taze PBMNCs ortam 2 ml artı 0.25 mM NaB her iki günde bir değiştirin. </li></ol> 5. Ortak kültür için Besleyici-hücreleri ile Yemekleri hazırlayın (GÜN 16) <ol><li> Ceket 15 dakika boyunca bazal membran matrisi, 1 ml olan bir 6-yuvalı plakanın yuvalarına 37 ° C&#39;de ve FBS ihtiva 2 ml% 10 ile / oyuk 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) plaka DMEM (MEF ortamı) MEF besleyici hücreleri üzerine elektropore PBMNCs Pasajlanması bir gün önce. </li></ol> MEF&#39;ler üzerine 6. Kaplama transfekte PBMNCs (GÜN 17-19) <ol><li> 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp santrifüj transfekte PBMNCs olarak 1 mi ucu olan bir pipet kullanılarak, süspansiyon kültüründe PBMNCs toplamakoda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> MM NAB Süpernatantı atın ve taze PBMNC orta 2 ml pelletini artı 0,25. </li><li> MEF kaplı 6 iyi levha üzerine, hücreler plaka ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe hücreleri. </li><li> İki gün sonra, ortam aspire ve DMEM (KO-DMEM),% 20 KO-serum Değiştirilmesi (KOSR), 1 mM NEAAs,% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 mM nakavt oluşan iPSC ortam, 2 ml ile değiştirin L- Glutamin, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml FGF (temel bFGF) ve 0.25 mM NaB. </li><li> Taze iPSC orta 2 ml her gün değiştirin ve günlük hücreleri kontrol ediniz. Not: yaklaşık günde 22-25 anda, iPSCs ilk kolonileri görünür olmalıdır. </li></ol> 7. Toplama ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Genişleme (iPSCs) klonlar (GÜN 30-35) Not: transfeksiyondan sonra yaklaşık 30-35 gün sonra, iPSC kolonileri toplama ve şarjı için hazır olmalıdır. yeniden programlama verimliliği esti olmalıdırDaha önce rapor edildiği gibi 26, iPSC koloni / elektroporate edilmiş hücrelerde toplam sayısı sayısının yüzdesi olarak şeklindeki. <ol><li> iPSC koloniler pasaj bir gün önce, 12 oyuklu plaka (1.25 x 10 5 hücre / oyuk) MEF besleyici hazırlar. </li><li> Aspire MEF orta ve 10 ng / ml bFGF ve 10 uM Y-27632 ile birlikte iPSC ortamı 1 mL değiştirin. El, bir ızgara elde etmek için çekme başlığı içinde mikroskop altında her seferinde bir iğne, bir koloni ile incelemek pipetleme küçük kümeleri toplamak ve MEF&#39;ler ile kaplanmış 12-yuvalı plakanın bir kuyuya her biri tek tek aktarın. </li><li> Daha fazla yayılması için 4: 1 oranında daha sonra, 2 adet 6-çukurlu plaka: Geçiş oranı 1, 6 gözlü bir plakanın her bir 12-çukurlu plaka genişletmek. Incelemek ve daha sonra bir enzim ayrışma yordamı kullanın (as iyice aşama 7.2 tarif edilmiştir) ilk 2-3 geçişleri için elle iPSCs genişletin (adım 7.4 başlayarak). </li><li> Bir enzim ayrışma protokolü için, temiz iPSC kolonitoplama-kaput diseksiyon mikroskop altında, farklılaştırılmış bölümlerini aspire es. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kolajenaz IV, 1 ml (1 mg / ml) ile iPSCs inkübe edin. </li><li> Enzim çözeltisi aspire KO-DMEM, 1 ml hücre yıkayın ve 15 ml konik bir tüp içinde koloniler toplanır. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı havalandırın, MEF-kaplı 6 çukurlu bir levha üzerinde 10 ng / ml bFGF ve 10 uM Y-27632 ve bunların plaka iPSC ortamının 2 ml koloniler tekrar süspansiyon (oran 1: 4). </li></ol> IPSCs 8. Karakterizasyonu (5-15 geçiş arasında) <ol><li> Alkali Fosfataz Boyama <ol><li> Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 3-5 gün süreyle iPSC kolonileri. </li><li> Bir alkalin fosfataz boyama protokolü çalıştırmak için, bir kez PBS ile yıkayın iPSCs ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA 1 ml sabitleyin. </li><li> Artık PFA kaldırmak için, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Kullanarak Leke sabit hücrelerüreticinin talimatlarına göre bir ticari bir alkalin fosfataz boyama kiti. </li></ol></li><li> İmmünofloresan <ol><li> Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 3-5 gün süreyle iPSC kolonileri. </li><li> Bir imüno-deneyi başlatmak için, bir kez PBS ile yıkayın iPSCs ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA 1 ml sabitleyin. </li><li> Artık PFA kaldırmak için, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 keçi serumu,% 0.1 BSA,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.05 sodyum azit ihtiva eden bloke etme çözeltisi Permeabilization 1 ml / (NaN3) ile sabitlenmiş iPSCs tedavi edin. </li><li> Bloke solüsyonu aspire edildi ve 4 ° C &#39;de primer% 3 BSA içinde antikorlar ve% 0.05 NaN3 çözeltisi O / N ile sabitlenmiş hücreler inkübe (birincil antikor listesi için malzeme tabloyu kontrol ve antikor seyreltme faktörü tavsiye edilir). </li><li> Ertesi gün, Alexa Fluor 488 keçi anti-fare ve Alexa Fl hücreleri inkübe PBS ile iPSCs üç defa yıkamak37 ° C&#39;de 1 saat boyunca,% 3 BSA ve% 0.05 NaN3 çözeltisi içinde 1000: u veya 555 keçi anti-tavşan antikorları, 1 seyreltilmiştir. </li><li> PBS ile üç kez yıkanır, karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika için DAPI (1 ug / ml) ile çekirdekleri Leke. </li></ol></li><li> Embriyoid Vücudumuzdaki iPSCs Farklılaşma (EBS) <ol><li> Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 5-6 gün süreyle iPSC kolonileri. </li><li> Toplama-kaput diseksiyon mikroskobu altında, aspire iPSC kolonilerden farklı bölümlerini çıkarın. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kolajenaz IV, 1 ml (1 mg / ml) ile iPSCs inkübe edin. </li><li> Enzim çözeltisi aspire KO-DMEM, 1 ml hücre yıkayın ve 15 ml konik bir tüp içinde koloniler toplanır. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire 2 KO-DMEM oluşan EB ortamı mi,% 20 tanımlı sığır fetus serumu (FBS), 1 mM NEAAs,% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 mM L-Glutamin, 0.1 mM koloniler tekrar süspansiyon46; p-merkaptoetanol. </li><li> Sferoidal üç boyutlu embriyoid organları (EBS) oluşumuna izin vermek için, ultra-düşük bağlanma 6 oyuklu plakalar üzerine 6 gün süspansiyon içinde iPSC kolonileri. Taze EB orta 2 ml her iki günde değiştirin. </li><li> 7. günde, EBS toplamak ve EB ortam 2 ml% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine bunları plaka ve 20 gün boyunca farklılaşmasında EBS korumak. </li><li> Taze EB orta 2 ml her iki günde değiştirin. </li></ol></li><li> Gen İfadesi Analizi Mah-PCR <ol><li> Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 5-6 gün süreyle iPSC kolonileri. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari reaktif madde 1 ml kullanılarak PBMNCs, iPSCs veya EBS toplam RNA ekstrakte edin. </li><li> Örneğin 27 (260 / A 280 ve A 260/230 oranları&gt; 1.8 olan, yüksek kalitede RNA), bir spektrofotometre kullanımı gibi uygun yöntemlerle RNA yoğunluğu ve saflığı, değerlendirir. </li><li> KontrolÜreticinin protokolü (yüksek kalitede RNA RQI&gt; 9.5) 28 uygun bir ticari kit kullanılarak RNA bütünlüğü. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir ters transkriptaz kiti kullanılarak total RNA&#39;nın 1 | ig bir ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirmek. </li><li> CDNA, şablon 5 ng, 7.5 ul SYBR Green Supermix, 5 uM primer 2 ul ihtiva eden qPCR karışımları hazırlanması (ileri doğru: 1 ul ve ters: 1 ul) ve her bir tepkime 29 RNaz / DNase içermeyen su 6 ul. </li><li> 45, 60 ° C &#39;de 10 dakika süre ile 95 ° C&#39;de bir ilk denatürasyon adımı, 15 saniye ve primer tavlama ve uzatma aşaması için 95 ° C&#39; de denatürasyon adımı ayrılmıştır 40 döngü ve ardından aşağıdaki programı kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirme sn 29. </li><li> Ev bakıcısı geni 28 olarak GAPDH kullanan diğer genlerin ekspresyonunu normalize (Tablo 1 &#39;de listelenen primerler bakınız). </li></ol></li><li> QPCRTransgen Dışlama için <ol><li> 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCI ihtiva eden liziz tamponu için 1 ml kullanılarak PBMNCs ya iPSCs DNA ekstrakte% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 20 ug / ml proteinaz K </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de DNA çökeltme ve santrifüj olanak sağlamak amacıyla, üç kez,% 100 izopropanol, eşit bir hacmi (1 mi) ilave çevirerek karıştırın. </li><li> Süpernatantı atın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de 70% etanol ve santrifüj 1 ml DNA pelet yıkayın. Aspire ve supernatant atın ve RNaz / DNaz içermeyen su içinde tekrar süspansiyon. </li><li> Örneğin 27 (260 / A 280 ve A 260/230 oranları&gt; 1.8 olan, yüksek kalitede RNA), bir spektrofotometre kullanımı gibi uygun yöntemlerle DNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek. </li><li> (1 ul ve ters: 1 ul ileri) ve 6-DNA örneğinin 5 ng, 7.5 ul SYBR YEŞİL Supermix, 5 mcM primerlerin 2 ul içeren qPCR karışımları hazırlayın# 181; Her reaksiyon 29 RNaz / DNase içermeyen su l. </li><li> (Tablo 1 &#39;de listelenen primerler bakınız) ev idaresi genine 29 olarak FBX-15 kullanarak belirli bir epizomal plazmid EBNA-1 geni ifadesini normalize. </li></ol></li><li> Karyotip Analizi <ol><li> Kültür, imalatçının talimatları izlenerek iPSCs için ticari tanımlandığı gibidir, besleyici içermeyen bakım ortamı ile besleyici içermeyen bazal membran matrisi kaplı plaka üzerine 5-6 gün iPSC kolonileri. </li><li> Kromozom analizi protokolü başlatmak için, tek hücreli bir ayrışma elde edilene kadar, 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, hücre ayırma çözeltisi, 1 ml iPSC kolonileri ayırmak. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve toplayın. </li><li> Bir ortam 2 ml yeniden süspanse iPSCs özellikle prenatal tanı için hücrelerin kültürlenmesi için geliştirilmiştir. Bazal membran matrisi kaplı cam tabaklar üzerine levhalar tek hücreli iPSCs ve 37 ° C de inkübe% 5 CO2 &lt;/ Sub&gt; inkübatör. </li><li> 2-4 gün sonra, kültürlere doğrudan 10 ul / ml kolşisin ekleyebilir ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de 3 saat inkübe edilir. </li><li> Orta aspire ve oda sıcaklığında 10 dakika hipotonik çözelti (% 0.6 sodyum sitrat ve% 0.13 potasyum klorür) 1 ml iPSCs inkübe edin. </li><li> % 5 asetik asit çözeltisi, 1 ml hücre durulayın ve metanol / asetik asit solüsyonu ile iPSCs tamir (oran 3: 1) ile kontrol edilen sıcaklık ve nem içeren bir makine (28 ° C,% 42 bağıl nem). </li><li> Daldırın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca Kinakrin çözeltisi ile leke sabit hücreler 30 (Q-bandı) elde edilmiştir. </li><li> 100X büyütme 29, flöresanlı bir mikroskop altında hücre metafaz elde edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells).">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector.">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li><li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune,+a+non-integrating+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li><li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA.">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li><li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li><li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells,+hair+keratinocytes,+and+skin+fibroblasts.">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li><li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs.">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells.">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li><li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells.">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li><li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood.">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li><li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults:+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li><li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors,+cell-cell+fusion,+and+cytoplast+fusion.">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565 (2010).</li><li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance.">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li><li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties.">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li><li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents.">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li><li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy.">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li><li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis.">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration.">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4/Arf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming.">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li><li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus:+mechanistic+insights+into+efficient,+licensed,+extrachromosomal+replication+in+human+cells.">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Geçmişte, tek yolu, belirli bir genetik mutasyon taşıyan insan pluripotent kök hücreleri elde etmek için pre-implantasyon genetik tanı geçiren anne işe ve onların atılır blastosist 31,32 embriyonik kök hücreleri oluşturmak oldu. Bir yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar şimdi hemen hemen her genotipi taşıyan hastaların iPSCs üretebilirsiniz. olasılık hastaya özgü hücre hattından başlamak ve hastalıkların patofizyolojisi ve yeni terapötik yaklaşımların...

2006 yılında, Shinya Yamanaka 1 grubu, yetişkin farelerde ve insanlarda somatik hücreler, dört yeniden programlama faktörleri (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve ektopik ekspresyonu ile pluripotent haline dönüştürülebilir ilk defa burada gösterilmektedir c-myc), sözde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) 2 üretilmesi. Hastaya özgü iPSCs yakından morfoloji, çoğalması ve üç germ hücre tipleri (mezoderm, endoderm ve ektoderm) içine ayırt etmek için yeteneği bakımından insan embriyonik kök hücreleri (hESC) benzer hESC ve baypas kullanımına bağlı etik kaygıları eksik ise olası bağışıklık reddi 3. Böylece, iPSCs temel araştırma, ilaç tarama, hastalık modelleme, toksisite değerlendirilmesi ve rejeneratif tıp amaçlı 4 hasta-spesifik hücrelerin en önemli kaynaklarından biri olarak görünür. Çeşitli yaklaşımlar iPSC üretimi için kullanılmıştır: Viral entegre vektörler(Retrovirüs 5, lentivirüs 6), viral olmayan entegre vektörleri (adenovirüs 7), Sendai-virüs 8, BAC transposonlar 9, epizomal vektörleri 10, proteinler 11 veya RNA teslim 12. Virüs aracılı yöntemleri kullanımı yüksek verimlilik yeniden programlama neden olabilir, ancak, viral vektörler, konak hücreler ve bu nedenle, potansiyel rastgele girmeyle mutagenez genomu içine entegre, farklılaşması sırasında gen ekspresyonu ve susturulması transgenlerin yeniden aktive kalıcı değişiklik 13 göz ardı edilemez. Rejeneratif tıp iPSCs daha güvenli hale getirmek için, çaba hücre genomlarına ekzojen DNA&#39;nın entegrasyonu olmadan iPSCs elde etmek için yapılmıştır. Vergiye tabi viral vektörler ve transposonlar geliştirilmiş olmasına rağmen, bu kaçınılmaz olarak kesilip çıkarılmasından sonra dönüştürülmüş hücreler kalır ve ifade transposaz kısa vektör sekansları, hücre içinde değişikliğe sebep olup olmadığı hala belirsizular 13 işlev. Yüksek yeniden programlama verimliliği rağmen, Sendai virüsü translasyonel çalışmalarda uygulanmasını sınırlamak potansiyeline sahip bu sistem geliştirdi şirket ile pahalı bir yaklaşım ve ulaşmak geçiş lisans kaygıları temsil etmektedir. Ayrıca, protein ve RNA doğrudan sokulması için bir ihtiyaç bu getirmektedir içsel teknik sınırlamalar molekülleri yeniden programlanması birden fazla teslimat gerektirir ve genel olarak yeniden programlama verimi 14 çok düşüktür. Dikkat çekici bir şekilde, epizomal plasmidlerin kullanımı göre düşük maliyetli bir viral ve serbest olmayan entegre yöntem başarılı bir şekilde deri fibroblastları 15 yeniden programlama için rapor edilmiştir. Daha önce 10,15 bildirdiği gibi Özellikle, mevcut çalışmada biz, ticari mevcut entegrasyon serbest episomal plasmidlerini kullanmaya karar verdi. Bugüne kadar, cilt fibroblastlar en popüler donör hücre tipi 5 temsil etmektedir. Bununla birlikte, diğer hücre kaynakları başarı olmuştursfully keratinositler 16, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin 17, adipoz stromal hücreler 18 olmak üzere iPSCs içine yeniden programlanması, saç folikülleri 19 ve dental pulpa hücreleri 20. Bu hücrelerin izolasyonu cerrahi prosedürler gerektiren ve birkaç hafta birincil hücre kültürünün oluşturulması için in vitro hücre genişlemesi için ihtiyaç vardır. Bu ışığında, hücre tipi başlangıç ​​seçimi kritiktir ve kan gibi kolay erişilebilir ve daha az invazif dokulardan iPSCs üretebilmek için aynı derecede önemlidir. Her iki kordon kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMNCs) 21,22 ve periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) 14,22-24 iPSCs türetilmesi için hücrelerin uygun bir kaynağıdır. Yetişkin PBMNC yeniden programlama verimliliği CBMNCs 22 daha 20-50 kat daha düşüktür rağmen, örnekleme amacıyla en uygun hücre tipi kalır. IçindeAslında, PBMNC numune minimal invaziv olma avantajına sahiptir, ve buna ek olarak, bu hücrelerin yeniden programlama deneyleri daha önce in vitro olarak geniş bir genişleme gerekli değildir. Bugüne kadar, farklı protokoller yoğunluk gradyan ayrıldıktan sonra PBMNCs dondurulup çözülmüş gün birkaç aya kadar dondurma sonra iPSCs 22,23 içine yeniden programlama birkaç gün önce genişletilebilir bildirmiştir. Bununla birlikte, kadarıyla biz hiçbir rapor dondurulmuş buffy kat gelen PBMNCs yeniden programlamayı tarif var farkında olarak. Önemlisi, yoğunluk gradyan ayırımı olmaksızın toplanan dondurulmuş buffy mantolar böylece daha örnek toplama önler iPSC üretimi için malzeme kolay ulaşılabilir bir havuz temsil nüfus çalışmalardan elde büyük ölçekli biyobankalar saklanan en sık kan örnekleri temsil etmektedir. Burada biz, daha önce tanımlanmış olan protokole göre 22 insan dondurulmuş buffy kat ilk defa virüs içermeyen iPSCs üretilmesini rapor etmektedir. IçindeAyrıca, iPSCs olmayan yoğunluk gradyanı saflaştınldı PBMNC sonuçlar için bir kontrol protokolü olarak, yoğunluk gradyanı ayrıldıktan sonra elde edilen dondurulmuş PBMNCs elde edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>VF-054SBCS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>0.5 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Polysucrose solution for density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21056-023</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056&#160;</td>
			<td>1X (Stock: 100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td>1X (Stock: 100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>Final Concentration at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>100 ng/ml (Stock:100 &#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>10 ng/ml (Stock: 10 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-11</td>
			<td>40 ng/ml (Stock: 40 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Erythropoietin (EPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td>2 U/ml (Stock: 50 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#956;M (Stock: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Holo-Transferrin</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>2914-HT</td>
			<td>100 &#956;g/ml (Stock: 20 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium for cytogenetic analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Medium for iPSC feeder-free culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>0.1 mM (Stock: 50 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>0.25 mM (Stock: 0.5 M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic, 145 aa&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>10 ng/ml (Stock: 10 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503&#160;</td>
			<td>10 &#181;M (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Defined Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH 30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA Laboratories GmbH</td>
			<td>L11-007</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)</td>
			<td>Global Stem</td>
			<td>GSC-6201G</td>
			<td>1*106 cells/6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27077</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27078</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27080</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-EGFP</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27082</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Staining Kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9081</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-33759</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Troponin I Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-15368</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7732</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuronal Class III &#223;-Tubulin (TUJ1) Antibody</td>
			<td>Covance Research Products Inc&#160;</td>
			<td>MMS-435P-100</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>657012</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21429</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596-018&#160;</td>
			<td>reagent for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11754050</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>185-5195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>700-7000</td>
			<td>Instrument to check RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion RNA Highsense Analysis kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007105</td>
			<td>Reagent kit to check RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeonTransfection System 100 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK10025</td>
			<td>Reagent kit for electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Instrument used for electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Instrument for DNA/RNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids

Somatik hücreler, dört transkripsiyon faktörlerinin (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve c-myc) ekspresyonunu zorlayarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) içine yeniden olabilir, tipik olarak insan embriyonik kök hücreleri tarafından (hESC) olarak ifade . Nedeniyle hESC ile benzerliği, iPSCs hESC ile ilgili etik sorunlar kaçınarak, olası hastaya özgü rejeneratif tıp için önemli bir araç haline gelmiştir. Klinik uygulamalar için, uygun hücreler elde etmek için, transgen içermeyen iPSCs transgen reaktivasyonu, değiştirilmiş gen ekspresyonunu ve yanlış farklılaşmasını önlemek için söz konusu olacaktır. Ayrıca, yüksek ölçüde verimli ve pahalı olmayan bir yeniden programlama yöntemi, terapötik amaçlar için yeterli iPSCs elde etmek gereklidir. Bu ihtiyacı göz önüne alındığında, etkin bir sivil entegre episomal plazmid yaklaşımı iPSC türetme tercih seçimdir. Şu anda yeniden programlama amaçlı kullanılan en yaygın hücre tipi fibroblastlar vardır, izolasyon hangi bir i doku biyopsisi gerektirirhasta için nvasive cerrahi prosedür. Bu nedenle, insan periferik kan iPSC nesil için en erişilebilir ve en az invaziv doku temsil eder. Bu çalışmada, bütünleşmeyen epizomal plasmidleri kullanılarak uygun maliyetli ve viral içermeyen protokolü tam kan, santrifüj işleminden sonra ve yoğunluk dereceli ayırma olmadan dondurulmuştur buffy kat elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) için iPSCs üretilmesi için rapor edilir.

Bu çalışmada, tam kan merkezkaç ve yoğunluk dereceli ayırma bildirilir sonra elde edilen PBMNCs resetleme ile karşılaştırıldığında sonra dondurulmuş buffy kat izole PBMNCs resetleme viral içermeyen iPSCs üretilmesi için basit ve etkin bir protokol. Şekil 1A şematik bir temsilini göstermektedir ayrıntılı bir protokol. Çözündükten sonra, tipik bir yuvarlak şeklini gösteren izole PBMNCs, 14 gün süre ile belirli bir kan kültür ortamı (Şekil 1B) yayılır ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids at JoVE.com

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-frozen-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Görüntüleme.  European Academy Bozen/Bolzano (EURAC).  Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut. 

Video: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...