Yazarlar R37 DK045729 (JLM için) R01 AR060837 (için HX) ve University of Michigan Gastrointestinal araştırma merkezi moleküler çekirdek P30 DK034933 destek kabul etmek istiyorum.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri kullanımı ve bakımı hayvanların University of Michigan'ın Komitesi tarafından kabul edildi.
1. steril Poly-D-lizin (PDL) ve Laminin çözümleri hazırlanması
<ol><li>En az bir gün önce hücre izolasyon, poli-D-lizin (PDL) ve laminin kaplamalı plakalar hazırlayın. Not: 6-şey ve 12-iyi plakaları bağlı olarak deneysel gol hazırlanmıştır. Tipik olarak, 12-şey plakaları kantitatif Batı açıkları kullanarak analiz için kullanılmıştır; Oysa 6-şey plakaları immünhistokimya için autoclaved (steril) coverslips tutmak için kullanıldı. 24-şey plakaları EGCs Ca2 + için kültür için kullanılan akı görüntüleme.</li>
	<li>DNaz-alerjik ve RNase free su doku kültürü Hood Hava HEPA filtre ile ultrasaf doku kültürü notu ile hisse senedi çözümleri sulandırmak.</li>
	<li>
Cam coverslips sterilize
	<ol>
<li>Coverslip steril forseps ile tutun ve coverslips bir ölçek % 100 etanol 15 dk. doku kültürü mahallede buharlaşır ve 6-şey plakayı yerleştirmek için izin ver'etanol için bırakın.</li>
		<li>Alternatif olarak, birkaç coverslips tek tek bir Plastik Konteyner ve sonra otoklav 2 mm kalınlığında Bloting kağıt yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kaplama plakalar
Not: bir steril doku kültürü laminar akış başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>1 mg/mL PDL hisse senedi çözülme ve böylece nihai toplama 100 µg/mL steril, doku kültürü sınıf su ile 1:10 oranında seyreltin. 2 mL iyi 6-iyi tabaklar, 12-şey plaka bir şey kapsayacak şekilde 1 mL ve 0.5 mL 24-şey plakaları bir kuyuda için kat için kullanın. Kalan seyreltilmiş PDL 12 mL aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Kuyular için en az 1 h kat PDL izin sonra steril bir pipet ile PDL kaldırın. Hava plakalara doku kültürü laminar akış başlık altında tamamen kuru izin. Not: PDL çözüm steril bir pipet ile kaldırıldıktan sonra bu olabilir iki kez daha 1 hafta içinde 0.22 µm filtreden geçirerek ve 4 ° C'de depolamak sonra kullanılan</li>
	<li>Jel oluşumunu önlemek için buz laminin stokta çözülme. Not: Su katılmamış laminin 8 ° c sıcak zaman katı haline gelir</li>
	<li>Laminin hisse senedi (0,5 mg/mL) 1:50 ile steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (10 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için DPBS) oranında seyreltin. Seyreltilmiş laminin 12 mL aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Seyreltilmiş laminin içeren wells için PDL kurutulmuş ekleyin. 1 mL 6-şey yüzey ve 12-şey tabak dibinde kapsayacak şekilde 0.5 mL kapsayacak şekilde kullanın. Coverslips için 400 µL seyreltilmiş laminin, yüzey kapsama alanı elde etmek için coverslips ekleyin.</li>
	<li>Plaka aynı gün (hızlı kaplama) kullanılırsa, kaplamalı plakalar için 2 h, 37 ° C'de kuluçkaya. Eğer değilse, plastik wrap ile plakalarının ve gecede 4 ° C'de (yavaş kaplama) saklayın. Not: Sızdırmazlık kurutma ve kontaminasyonu önlemek için önemlidir.</li>
	<li>Laminin çözüm yüzeyi çizilmemesi önlemek için dikkatli bir pipet ile kaldırın. Yavaşça wells üç kez steril DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Tam gliyal büyüme medya her şey ve 37 ° C'de plakaları EGC süspansiyon eklemek için hazır kadar korumak ekleyin. Not: Poly-D lizin ve laminin kaplamalı plakalar 4 ° C'de 3 gün saklanabilir Birkaç gün kala plakasını ceket ve 4 ° C'de depolayın, steril DPBS ile plakalar üç kere yıka. 2 mL steril DPBS her şey için nihai yıkama sonra ekleyin. Parafilm ve 4 ° C'de mağaza ile plaka mühür Laminin kurumasına olduğunu emin olmak için önemlidir.</li>
</ol>3. hazırlık yalıtım çözümleri
<ol><li>EDTA/HEPES/DPBS ayrılma çözüm hazırlamak. Çözümün 500 mL için kullanın (kalsiyum ve magnezyum) olmadan steril DPBS 10 mM HEPES ve 5 mM EDTA son bir çözüm yapmak. DPBS 490 mL için 1 M HEPES tampon 5 mL ve 5 mL 0.5 M EDTA stok çözeltisi ekleyin. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
	<li>Tablo 1' de listelenen reaktifler kullanarak gliyal hücreye resuspension ortam hazırlamak.</li>
	<li>Tablo 2' de listelenen reaktifler kullanarak gliyal büyüme ortam hazırlamak. Not:-Ebilmek var olmak stok GDNF içeren gliyal büyüme medya 4 ° C'de bir hafta için</li>
</ol>4. bağırsak Segment kaldırılması
Not: Fareler yiyecek ve su euthanization önce ücretsiz erişim isoflurane bırak yöntemini ve kaldırma-in hayati bir organ tarafından izin verildi. C57BL/6 fareler 8 hafta-in yaş eskisinden daha fazla. Her iki cinsiyette hazırlık göze çarpan farklılıklar olmadan kullanılmıştır.
<ol><li>Fare ile bir doz aşımı isoflurane ötenazi ve parçalanmış bir tepsi içinde sırtüstü yerleştirin. Ekstremitelerde pin ve karın % 70 etanol ile sterilize. Forseps ile cilt çadır ve karın makasla açın.</li>
	<li>Karaciğer kaldırın ve distal mide/mide tanımlar. Proksimal bağırsak 7 cm kaldır. Bağırsak gözyaşı için dikkatli olun.</li>
	<li>
Mide uzağa bıçaklanmasından kırpma iken forseps ile tutun.
	<ol>
<li>Künt Diseksiyon makas arka ile dış görev yapisan pankreas kazımak için kullanın.</li>
		<li>Bağırsak segment Ca2 + veya Mg2 + (Şekil 1A) olmadan buz gibi DPBS içine koyun. Not: Bağırsak veya iki nokta üst üste diğer kesimleri de aynı tekniği kullanarak kaldırılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 veya 10 mL şırınga bağlı bir künt son 20 G iğne buz ile dışkı içeriğini dışarı floş için kullanım soğuk DPBS (Şekil 1B).</li>
	<li>Bağırsak başlangıçta Smith et al. tarafından açıklanan tekniği kullanarak boyuna kas kaldırmak için 3 cm parçalara bölmek 12 ve Sundaresan vd. değiştirilmiş olarak 10. Not: En çok iki fareler gelen bağırsak kesimleri 30 mL HEPES/EDTA/DPBS yalıtım çözeltisi kullanılır.</li>
	<li>Tahta sopa pamuk uç--dan ayırmak için yaklaşık 4 cm koparmak. Tahta sopa DPBS (Şekil 1 c) emmek.</li>
	<li>Sorunsuz üzerine ıslak sopa (Şekil 2A-C) bağırsak kesimleri biri kayıp.</li>
	<li>Yapisan bıçaklanmasından hâlâ iğne-burun forseps (Şekil 2B) kullanarak bağlı kaldırın.</li>
	<li>
Temiz bir jilet kullanın ya da nerede olduğunu bıçaklanmasından bağırsak boyunca iki boyuna rumuz yapmak için neşter (2E rakam) bağlı.
	<ol>
<li>DPBS pamuk ucuyla ıslak. Islak pamuk uç boyuna kas/myenteric pleksus (LMMP) gevşetmek için boyuna kas boyunca ovalayın. Sonra yatay olarak uzak gelen bağırsak kesimin uzunluğu boyunca dairesel kas LMMP LMMP kaldırma sırasında alay pamuk uç taşıyın.</li>
		<li>Başparmak ve işaret parmağı arasında sopa ucu orta ve dördüncü parmak (Şekil 2F) segment sabitleme süre tutun. Tamamlandığında, LMMP kolayca bağırsak kesimi soyma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMMP bağırsak tüpünden striptiz yapıp, para için pamuklu çubukla myenteric pleksus EGCs hasat sürece bağlı atma isteniyorsa.</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı açık paylamak için boyuna ahşap sopa kaldırmak bağırsak segment kullanın.</li>
	<li>Sökülen bağırsak dokusu (ağırlıklı olarak mukoza ve submukoza artı dairesel kas) DPBS buzda saklayın. Tüm bağırsak kesimleri hazırlanır 4.4-4.11 tamamlayana dek.</li>
</ol>5. epitel mukoza kaldırılması
<ol><li>Bağırsakların iyi makasla ~0.5 cm daha küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Doku 30 mL buz gibi EDTA/HEPES/DPBS çözeltisi içeren bir steril 50 mL konik santrifüj tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Kaya dokusu içeren çözüm 4 ° c ~ 60 Eğer min başına 10 dakika için.</li>
	<li>Önceden bir kez yukarı ve aşağı EDTA/HEPES/DPBS tampon pipetting tarafından bir 5 mL plastik pipet nemlendirin ve doku pipette ve süspansiyon (toz) yukarı ve aşağı 20 kez tampon için önceden ıslatılmış pipet kullanın epitel mukoza çıkarmak için.</li>
	<li>Doku EDTA kuluçka 100 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla karışımı dökerek toplamak. Bulanık mukus dolu akışı-den (Şekil 3) atmak.</li>
	<li>Buz 30 mL içeren bir yeni 50 mL konik santrifüj tüpüne süzgeç muhafaza doku yer soğuk EDTA/HEPES/DPBS iğne-burun forseps kullanarak.</li>
	<li>4 ° c ~ 60 Eğer ek epitel mukoza şerit için dakika başına 10 min için doku Rock yaparak EDTA/HEPES/DPBS kuluçka ikinci kez tekrarlayın.</li>
	<li>Ön tampon ile 5 mL pipet nemlendirin ve mukoza hücreleri çıkarmak için 20 kat yukarı ve aşağı doku süspansiyon pipette. Not: Doku daha epitel kaldırıldı için pipet içinde sopa eğiliminde olacaktır.</li>
	<li>100 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla karışımı dökerek ikinci kuluçka sonra doku toplamak ve aracılığıyla akış atın. İkinci akışı aracılığıyla ilk (Şekil 3) daha belirgin bir şekilde daha az bulanık olmalıdır.</li>
	<li>Kadar çözüm yaklaşık 10 dk EDTA incubations temizleyin (yaklaşık 3-4 incubations doku miktarını ve toz verimliliğini bağlı olarak) tekrar (Şekil 3).</li>
</ol>6. Lamina Propria ve submukoza enterik Gliyal hücreler topluluğu
<ol><li>Doku piyasada bulunan hücre kurtarma çözümü ve rock için 25 – 30 dk 4 ° C'de 5 mL içeren 15 mL konik santrifüj tüpü naylon süzgeç aktarmak</li>
	<li>
Lamina propria enterik gliyal hücrelerden ayırmak için hafifçe 10 x triturate.
	<ol>
<li>40 µm filtre ile filtre ve filtrate temiz 50 mL tüp içinde toplamak.</li>
		<li>Doku naylon filtre DPBS 1 mL ile yıkayın.</li>
		<li>Doku atmak ve transfer ~ 5-6 mL filtrate temiz 15 mL konik santrifüj tüpü için.</li>
		<li>Filtrate 4 ° C'de 5 min için sallanan bir kova santrifüj 2.000 x g de spin</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gliyal hücreyi içeren pelet resuspension arabellek en az 1 mL yavaşça yukarı ve aşağı Pelet 500 µL pipet ucu ile pipetting tarafından yeniden askıya alma. Kabarcıklar tanıtan kaçının. Not: resuspension sesi wells ve plaka sayısı için gerektiği gibi ayarlayın. Örneğin, bir 6-şey plaka için 1.2 mL; 2.4 mL iki 6-şey plakaları için; 2.4 mL bir 12-şey plaka için.</li>
	<li>6-iyi veya 100 µL gliyal büyüme ortamı içeren 12-şey PDL-laminin kaplamalı plakalar için her kuyuya hücre süspansiyon 200 µL pipet.</li>
	<li>Bulaşıkları plakaları için hücreleri ekleme ve hücreleri bağlı kalmak için maksimum sayıda izin vermek için 37 ° C kuluçka makinesine yerleştirerek sonra rahatsız etmeyin. Not: Hücrelerinin sağlıklı bir hazırlık içinde 6-8 h takmak ama nazikçe yapışık olmayan hücreleri ile birlikte medya kapalı pipetting tarafından medya değiştirmeden önce en az 24 saat bekleyin.</li>
	<li>Hücreleri deneyler için 3-4 gün sonra bunlar kültür (Şekil 4) yerleştirilir kullanın. Antikorlar ilgi belirli protein işaretleri (Tablo 3) kullanarak immünfloresan çözümlemesi gerçekleştirin. Örneğin, GFAP'nin, S100b ve p75NTR veya Sox10 burada kullanılmıştır. E-cadherin veya Alfa düz kas aktin antikorlar diğer hücre tipleri kirlenme derecesini değerlendirmek için kullanılmıştır.</li>
</ol>7. immünfloresan boyama
<ol><li>Basına kapalı kültürler Aspire edin ve iki kez PBS ile durulayın.</li>
	<li>Kültürler 20 dk için oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ile düzeltmek.</li>
	<li>Sabitleştirici kaldırmak ve sonra 3 kez PBS ile durulayın.</li>
	<li>Hücreleri % 0,2 içeren PBS ile permeabilize Triton X-100 oda sıcaklığında.</li>
	<li>Permeabilized hücreleri Anti-tavuk IgY, Anti-tavşan veya oda sıcaklığında 2 h için anti-fare IgG oluşan engelleme çözümleri ile kuluçkaya.</li>
	<li>
Birincil antikorlar bir gecede, Örneğin, GFAP'nin (1:1, 000) içeren hücreleri kuluçkaya.
	<ol>
<li>Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Colocalization gerçekleştirmek için adım 7,7 devam ederseniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oda sıcaklığında en az 2 h için birincil antikorlar sonraki kümesini kuluçkaya, ama tercihen 4 ° C'de gece 1: 1000 seyreltme tavşan anti-S100 olarak veya fare anti-p75NTR bir 1:500 seyreltme kullanın. Not: Tüm antikorlar PBS içinde seyreltilmiş.</li>
	<li>Birincil antikorlar kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle durulayın. Daha sonra durulanır hücreleri (Tablo 3) Oda sıcaklığında 2 h için uygun fluorescently öğesini ikincil antikorlar ile kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez ikincil antikorlar kaldırmak için PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Coverslips 1-2 damla montaj ortamının DAPI ile kullanarak slaytlar üzerine monte ve hücreleri floresan mikroskop altında görüntüleyin.</li>
</ol>8. akış sitometresi
<ol><li>DPBS bir kez hücrelerle durulama tarafından akış sitometresi yapisan gliyal hücrelerini kaldırın ve sonra % 0.25 tripsin-EDTA üreticinin iletişim kuralı başına ekleyin. Tripsin-EDTA çözüm 3 dk. sonlandırma sindirimi için 37 ° C'de hücrelerde tam gliyal hücre büyüme medya hücrelerde toplayarak kuluçkaya.</li>
	<li>400 x g 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak ve PBS hücrelerde yeniden askıya.</li>
	<li>Hücreleri % 4 paraformaldehyde 10 dk ile düzeltin ve sonra % 0,2 ile adım 7,4 içinde açıklandığı gibi PBS Triton X-100 permeabilize.</li>
	<li>Hücreleri % 1 BSA ve doku belirli immünglobulin 20 dk, Örneğin, eşek Anti-tavuk IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) veya eşek Anti-keçi IgG (H + L) (1:1, 000) içeren PBS ile engelleyin.</li>
	<li>Birincil antikorlar GFAP'nin (1:2, 000), hücrelerle kuluçkaya E-cadherin (1: 400), α-düz kas aktin (1:500) veya Pgp9.5 (1:500) bir gecede 4 ° C'de</li>
	<li>
PBS ile antikor silsin.
	<ol>
<li>Antijen-antikor kompleksi ile ikincil antikorlar fluorescently öğesini 30 dk için oda sıcaklığında inkübe kuluçkaya.</li>
		<li>İkincil antikor ile inkübe hücre ayrı bir aliquot izotip kontrol hizmet etmek için kullan. Her iki örneğin alınma olasılığını hücre yıkanmış ve PBS içinde akış sitometresi önce resuspended.</li>
		<li>İki popülasyonun bir akış sitometresi sayfasında bulunan bir hücreler üzerinde canlı hücreleri çoğunluğuna göre analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. hazırlanıyor fare dokulara hGFAP-Cre:tdTomato fareler
Not: Somon balığı-STOP-Lox-tdTomato cDNA ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) ifade edilir ve Cre recombinase (hGFAP-Cre) ifade bir fare için yetiştirilmiş zaman endojen floresans oluşturur. Situ çözümleme donmuş doku bölümler oluşturarak yapılır.
<ol><li>Bağırsak dokusu %4 paraformaldehyde 1 h için fix ve gecede 1 M Sükroz PBS içinde içinde kurutmak.</li>
	<li>Ticari olarak % 10 Polivinil alkol oluşan en uygun kesme doku (OCT) bileşik satın alınan doku katıştırmak ve % 4.2 Polietilen glikol ve sonra ek sıvı azot içinde dondurma.</li>
	<li>5 µm cryosections hazırlamak ve ortam DAPI ile takma bir antifade kullanarak bağlayabilirsiniz.</li>
	<li>Akış Sitometresi için EGCs hGFAP hazırlamak-4.1-6.5 adımlarda açıklandığı gibi Cre:tdTomato+ fareler.</li>
	<li>Kültürlerinde olduğu gibi adım 8.1 3 gün sonra plaka hücrelerden trypsinize ve % 4 paraformaldehyde 10 min için düzeltin.</li>
	<li>Cre negatif fareler hGFAP izole hücreler ile paralel olarak gelen izole hücreler analiz-Cre:tdTomato+ fareler üzerinde bir akış sitometresi. Not: Gates ölü hücreleri ve enkaz önlemek için inşa edildi.</li>
</ol>10. Ca2 + akı görüntüleme
<ol><li>24-şey tabağa 3 µM ile kaplama EGCs kuluçkaya Fluo-4-AM için 30 dk 37 ° C'de.</li>
	<li>Ca2 + sinyal ticari olarak satın alınan Tyrode'nın çözüm dönen disk confocal mikroskop ve uyarma dalga boyu 480 kullanarak görüntü CCK veya gastrin peptid ekledikten sonra nm (F480). Görüntü analizi Sundaresan vd. bildirildi 10 .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grubisic, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia:+the+most+alimentary+of+all+glia.">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).</li><li>Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Glia+Regulate+Gastrointestinal+Motility+but+Are+Not+Required+for+Maintenance+of+the+Epithelium+in+Mice.">Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice.</a> Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).</li><li>Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+express+proteolipid+protein+1+and+are+a+transcriptionally+unique+population+of+glia+in+the+mammalian+nervous+system.">Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system.</a> Glia. , (2015).</li><li>McClain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++responses+in+enteric+glia+are+mediated+by+connexin-43+hemichannels+and+modulate+colonic+transit+in+mice.">Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li><li>Cunha Franceschi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+reactivity+to+systemic+LPS+administration+Changes+in+GFAP+and+S100B+protein.">Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein.</a> Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).</li><li>Kabouridis, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+controls+the+homeostasis+of+glial+cells+in+the+gut+lamina+propria.">Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria.</a> Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).</li><li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier.">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li><li>Clairembault, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+GFAP+expression+and+phosphorylation+in+Parkinson's+disease.">Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).</li><li>Sundaresan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrin+Induces+Nuclear+Export+and+Proteasome+Degradation+of+Menin+in+Enteric+Glial+Cells.">Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells.</a> Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).</li><li>Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Glia:+The+Origin+of+Duodenal+Gastrinomas?.">Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?.</a> Gastroenterology. , (2017).</li><li>Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+preparation+of+isolated+enteric+neurons+and+glia+from+the+myenteric+plexus+of+the+adult+mouse.">An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Fried, D. E., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+of+the+enteric+nervous+system.">In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).</li><li>Bernstein, C. N., Vidrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+identification,+and+culture+of+normal+mouse+colonic+glia.">Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia.</a> Glia. 12 (2), 108-116 (1994).</li><li>Jaeger, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enteric+ganglia+from+the+myenteric+plexus+of+adult+rats.">Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats.</a> Journal of Neural Transplantation &amp; Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).</li><li>Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+and+transplantation+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells.">Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells.</a> Gut. 56 (4), 489-496 (2007).</li><li>Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enteric+glia+and+establishment+of+transformed+enteroglial+cell+lines+from+the+myenteric+plexus+of+adult+rat.">Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 13 (1), 95-106 (2001).</li><li>Boyen, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+enteric+glia+and+GDNF+during+gut+inflammation.">Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation.</a> BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).</li><li>Rosenbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Myenteric+Glia+during+Acute+Inflammation+In+Vitro+and+In+Vivo.">Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo.</a> Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).</li><li>Zhuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hGFAP-cre+transgenic+mice+for+manipulation+of+glial+and+neuronal+function+in+vivo.">hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo.</a> Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).</li><li>Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+phenotypic+plasticity+of+glial+cells+in+the+mammalian+enteric+nervous+system.">Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system.</a> Glia. 63 (2), 229-241 (2015).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Kabouridis, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+keeps+enteric+glial+cells+on+the+move;+prospective+roles+of+the+gut+epithelium+and+immune+system.">The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system.</a> Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).</li><li>Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+neurally+related+laminin+binding+protein+by+neural+crest-derived+cells+that+colonize+the+gut:+relationship+to+the+formation+of+enteric+ganglia.">Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia.</a> The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

EGCs gut homeostazı önemli rol oynarlar ve yalıtmak ve onları içinde vitroçalışma için önemlidir. Bu protokol için EGCs yetişkin fare bağırsak lamina propria izole için basit bir yöntem enterik gliyal işlev eğitim için kullanılmaya başlandı.
Yapisan bıçaklanmasından ve LMMP ile bir pamuklu çubukla kaldırma bazı boyuna ve dairesel kas arasında ikamet eden Inter-myenteric glia ortadan kaldırır, arabellek submucosal yüzeye erişilebilirliğini artırır ve...

Enterik Gliyal hücreler (EGCs) fonksiyonu ilgi giderek tanınan rolleri olarak gut bütünlüğü ve homeostasis1,2nedeniyle artmıştır. Buna ek olarak, EGCs GI yolu3,4uzunluğu boyunca konumlarına göre değişiklik gösterir. EGCs, gliyal hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) de dahil olmak üzere çeşitli trofik faktörler bırakın hareketliliği1,5 delik deşik ve mikrobiyal yan6,7' ye yanıt vermek için katkıda bulunmak. Çalışmalar EGC nüfus türdeş olmayan ve işlevlerine onlar submucosal veya myenteric pleksus1,7içinde bulunan bağlı olarak değişir belirttiler. Örneğin, EGCs submukoza içinde sıkı kavşak8' e katkıda bulunur. Diferansiyel GFAP'nin ifade ve EGCs fosforilasyon Parkinson hastaligi, gut fenotip Bu bozukluk9olası onların bağlantı telkin için bağlantılı olmuştur. Son zamanlarda, nükleer protein menin EGCs izole kültürlerin proksimal bağırsak submukoza üzerinden kaybı hormon gastrin10ifade ikna etmek yeterli görülmüştür. Sonuç olarak, EGCs duodenal gastrinomas, nöroendokrin tümör10türü kökeni olabilir önerildi. Toplu olarak, bu örnekler nöropatik bozuklukları ve kanser11izole EGCs işlevini ve davranış eğitimi alaka altını çiziyor.
Alan mücadelesine nasıl yalıtmak ve birini veya her ikisini EGC nüfus vitroçalışma kalır. Soy izleme deneyleri EGCs submukoza ve lamina propria progenitör hücre myenteric pleksus7kaynaklanan gösterdi. Birkaç yayımlanmış yalıtım protokol myenteric EGCs12,13,14,15,16,17kültürleri oluşturmaya uygun olmakla birlikte, 18,19, hiçbiri özellikle yalıtım submucosal/lamina propria EGC nüfusunun hedefleyen. Varolan iletişim kuralları EGC yalıtım için özellikle bir arada mekanik ayrılması veya sonunda mukozal hücre katmanı atarak enzimatik ayrılma ile birlikte düz kas mikrodiseksiyon kullanır.
Bu el yazması non-enzimatik lamina propria vitro çalışmalar için gelen birincil EGCs yalıtmak için adımları göstermek için hedeftir. Özellikle myenteric EGCs ayırt alanındaki bu submukoza hiçbir işaretleri olduğundan, düz kas kayma ayrılması epitel Fibromu submucosal EGCs yalıtmak için istismar edildi. Buna ek olarak, EDTA şelasyon enzimatik olmayan ayrılma ile birleştirerek, EGCs ilişkili Inter-myenteric EGCs ile birlikte atıldı düz kas aksine submukoza yalıtılmış. Submukoza ve lamina propria EGCs daha fazla ayrılması gliyal cep dostu yüzeylerde, Örneğin, poli-D-lizin ve laminin hücre kültürü çalışmalarının tarafından oluştu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-D lysine (1 mg/ml stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (0.5 mg/ml stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4544</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL on ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>Dilute 1:100 in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>36216004</td>
			<td>Dilute 1:100 in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/mL stock)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (10 &#181;g stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM stock)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-10004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-a-Smooth Muscle Actin&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab112022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Pgp9.5&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-E-cadherin&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit S100&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse p75 NTR&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B) 250 &#181;g/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Fura-2-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK peptide</td>
			<td>Anaspec, Fremont, CA</td>
			<td>AS-20741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin peptide (Gastrin-17)</td>
			<td>Abbiotec, Bloomington, IN</td>
			<td>350188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Celll Strainer (100 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Celll Strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serologic Pipet 5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of the adult mouse

Nöronlar ve düz kas duvar, submukoza ve lamina propria içinde bulunan enterik Gliyal hücreler (EGCs) enterik sinir sistemi (ENS) oluşur. EGCs gut homeostazı çeşitli trofik faktörler sürümü ile önemli rol oynarlar ve epitel bariyer bütünlüğünü katkıda bulunmak. Birincil enterik gliyal kültürlerin en çalışmaları myenteric pleksus sonra enzimatik ayrılma izole hücreler kullanın. Burada, ayırmak ve bağırsak submukoza ve lamina propria EGCs kültür enzimatik olmayan bir yöntemi açıklanmıştır. Sonra el kaldırma boyuna kas tabakasının EGCs lamina propria ve piyasada bulunan enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka ardından sıralı HEPES tampon EDTA incubations kullanarak submukoza kurtarılmış. EDTA incubations gelen submucosal EGCs kurtarmak hücre kurtarma çözümü sağlayan lamina propria epitelyal mukoza çoğunu şerit yeterliydi. Herhangi bir kalıntı lamina propria ve düz kas myenteric glia birlikte atılır. EGCs kolayca gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) hızlı yeteneğini tarafından tespit edilmiştir. Hücre süspansiyon sadece yaklaşık % 50 GFAP'nin + hücrelerin doku incubations tamamladıktan sonra ve poli-D-lizin/laminin substrat üzerine kaplama öncesi bulunan. Ancak, gliyal hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) hücre kültürü çalışmalarının 3 gün sonra-oluşan yüzey kaplamalı plakalar kalarak hücre nüfus kültür ortamı içeren, > % 95 enterik glia. Biz bir melez fare çizgi hGFAP-Cre fare endojen hücre floresans kullanarak GFAP'nin + hücre yüzdesini izlemek için ROSA-tdTomato muhabir hattına ıslahı tarafından oluşturdu. Böylece, myenteric enterik glia enzimatik olmayan yöntemlerle izole ve en az 5 gün için kültürlü.

Eğer GFAP'nin + hücre vermedi bağlı kalmak ve içinde 24 h (Şekil 4A) yaymak preps başarısız kabul edildi. Hücreleri yapıştırılır ve düz toplamları (Şekil 4B) Yayilim kanıt gösterdi gliyal hücre sayısı 24 saat kadar sonra belirlenemedi. Hücre kümeleri kenarında uzun işlemleri genişletmek eğilimi ve Örneğin, GFAP'nin, klasik gliyal işaretleri, S100b ve p75NTR (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse at JoVE.com

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

isolation-enteric-glial-cells-from-submucosa-lamina-propria-adult

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Görüntüleme.  University of Michigan. Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Video: Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...