Yazarlar kendi giriş için Goureau'nın ekibinin sırasında belgili tanımlık yöntem tanımlamak burada ve G. Gagliardi ve M. Garita up kendi eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser ANR gelen hibe tarafından desteklenmiştir (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), Retina Fransa Derneği ve teknoloji transferi şirket SATT Lutech. Ayrıca Investissements d'Avenir programı (ANR-11-IDEX-0004-02) içinde ANR tarafından desteklenen LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) çerçevesinde gerçekleştirildi.

Bu raporda açıklanan protokol Institut de la vizyon'ın Araştırma Etik Komitesi kuralları izler. Institut de la vizyon geçerli Fransız yönetmelik göre insan numune işleme izin verdi. Numune işleme Helsinki ilkeleri doğrultusunda hasta veri koruma ve ulusal düzenlemeler "Comité de koruma des Personnes (CPP) Ile-de-France V" etik onaylandıktan sonra takip eder.
1. hazırlanması Kültür Medya ve yemekleri
<ol><li>
Kültür medya
	<ol>
<li>IPSC orta, pluripotent kök hücre kültür besleyici-Alerjik koşulları16adanmış bir kimyasal olarak tanımlanmış ortam kullanın. 500 mL orta üreticinin protokolüne göre hazırlayın.</li>
		<li>Kullanım bazal IPSC (BI) orta, IPSC orta olmadan fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) veya dönüştürme büyüme faktörü Beta (TGFß) kimyasal olarak tanımlı.</li>
		<li>500 mL (Bın2 orta), %1 N2 ilave ile desteklenmiş bı orta hazırlamak 10 adet/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin.</li>
		<li>500 mL oluşan DMEM:Nutrient karışımı F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), %1 MEM önemli olmayan amino asitler, %1 N2 ek, 10 adet/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin proneural Orta (ProN2 orta) N2 tabanlı hazırlayın.</li>
		<li>DMEM:nutrient karışımı F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), %1 MEM önemli olmayan amino asitler oluşur proneural Orta (ProB27 orta) B27 tabanlı hazırlamak, %2 B27 ek, 10 adet/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kültür gemi hazırlık
	<ol>
<li>
İnsan IPSC kültür için
		<ol>
<li>10 mL 5 μg/mL 1 x PBS vitronectin de içeren bir vitronectin çözeltisi hazırlamak. 10 mL 1 x PBS, 100 µL çözdürülen vitronectin hisse senedi çözüm (100 x) ekleyin.</li>
			<li>2 mL başına 0,5 µg/cm2' ye karşılık gelen 6 cm kültür çanak vitronectin çözeltisi dağıtın. (RT) Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Vitronectin çözüm tarafından aspirasyon bir vakum-aspirasyon sistemi veya 5 mL pipet kullanarak kaldırın.</li>
			<li>IPSC orta 6 cm çanak başına 4 mL ekleyin.</li>
			<li>Bulaşıkları 37 ° C ve % 5 CO2 30 dk kullanmadan önce en az bir hücre kültür kuluçka kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İnsan IPSC kaynaklı RPE (hiRPE) hücre kültürü için</li>
		<li>Pluripotent kök hücre nitelikli matris veya substrat wells üreticinin protokolüne göre kat için kullanın. Yeterli matris veya tüm büyüme yüzey alanı kapsayacak şekilde substrat ekleyin. Örneğin, matris 300 µL 24-şey plaka ve T-25 cm2 şişeye matrix 3 mL başına koy.</li>
		<li>En az 1 h 37 ° C'de kaplamalı kültürü kapları kuluçkaya Matris vakum-aspirasyon sistemleri veya 5 mL pipet kullanarak kaldırın.</li>
		<li>ProN2 orta iyi başına 1 mL 24-şey tabaklarda ekleyin ve kültür gemi kuluçka makinesi en az 30 dk sıcak ve orta equilibrate geri dönün. T-25 cm2 şişeler için bkz: adım 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bakım ve genişleme insan iPSCs
<ol><li>
İnsan iPSCs bakım
	<ol>
<li>3 mL IPSC orta 15 mL tüp içinde hazırlamak ve RT 15dk kullanmadan önce en az tutun. Kaplamalı 6 cm çanak 1.2.1 içinde açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>Kuluçka 30 37 ° C'de bir su banyosunda tarafından insan iPSCs bir sıvı azot tankı veya-150 ° C dondurucu kriyojenik örneği çözülme s.</li>
		<li>Dikkatle kriyojenik şişeyi bir dezenfektan çözüm sprey kullanarak dezenfekte edin. Çözdürülen insan iPSCs RT önceden ısınmış IPSC orta 3 mL içeren 15 mL tüp cryotube aktarmak</li>
		<li>3 dakika süreyle santrifüj tüpü 110 x g de bir vakum-aspirasyon sistemi veya 5 mL pipet kullanarak aspirasyon tarafından süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Hücre Pelet IPSC Orta 2 mL pipet kullanarak bir 6-cm kültür vitronectin kaplı yemek üzerinden 1 mL ile resuspend ve hücreleri yemek için transfer. Çanak 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 24 h en az orta değiştirmeden önce dönün. Not: 10 µM, Y-27632 gibi bir ROCK inhibitörü apoptosis azaltmak için 6 cm kültür yemekleri IPSC ortamda eklenebilir.</li>
		<li>Orta her gün değiştirin ve insan iPSCs her hafta geçirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İnsan iPSCs passaging
	<ol>
<li>İnsan IPSC % 70-80 izdiham klasik kültür 7 gün sonra geçmek.</li>
		<li>1.2.1. adımda açıklandığı gibi passaging için 6 cm yemekleri hazırlamak. Konfluent iPSCs bulaşıkta IPSC orta kaldırmak ve RT. 2 mL 6 min için bir ayrılma çözeltisi ekleyin Not: Kuluçka süresi IPSC klonlar üzerinde bağlıdır. 6 dk kuluçka başlangıç olarak deneyin.</li>
		<li>Vakum-aspirasyon sistemleri veya 5 mL pipet kullanarak ayrılma çözüm kaldırın ve 2 mL IPSC orta dik Resuspend IPSC kolonileri 1.000 µL pipet ile 5-10 x yukarı ve aşağı onları pipetting tarafından önceden ısındı ekleyin. Uyarı: aşırı pipetting üzerinden tek hücre ayrılma kaçının.</li>
		<li>Resuspended hücre kümeleri yeni bir 6-cm kültür tabak 30-200 µL aktarın. Bulaşıkları 24 h en az 37 ° C ve % 5 CO2 hücre kültür kuluçka orta değiştirmeden önce dönün. Not: Passaging için gerekli resuspended hücre kümeleri hacmi IPSC klonlar üzerinde bağlıdır.</li>
		<li>Orta her gün değiştirin ve insan iPSCs her hafta geçirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. nesil Retina Organoids
<ol><li>Şekil 1A ' koloniler % 60-70 izdiham (Şekil 1B) ulaştığında kapsamlıdır protokol sonrası IPSC farklılaşma başlatın.</li>
	<li>Bi orta 6 cm çanak başına 4 mL hazırlayın. Bi orta ile 37 ° c sıcak IPSC orta bı orta olarak değiştirin. Bu kez gün 0 (D0) olarak unutmayın.</li>
	<li>D2 bı ortamda daha önce 37 ° C'de ısındı Bın2 orta kültürleri Orta 2-3 günde değiştirin.</li>
	<li>Şekil 1 c içinde gösterildiği gibi acil kendini oluşturan Retina organoids neuroepithelium tomurcukları tarafından tespit -1E. Not: Bu erken Retina organoids, optik cup, onların gelişimsel aşamaya içinde karşılık gelen el ile aşağı akım deneme için ayrılmış olabilir.</li>
</ol>4. Retina Organoids olgunlaşma
<ol><li>D28 4 mL/iyi başlangıçta 10 ng/mL ile FGF2 takıma ProB27 orta içeren 6-şey tabak hazırlamak (Şekil 1A). Not: medya tabakaları bana hemen eklenmeden önce FGF2 ekleyin. Dikkat: FGF2 filtre uygulamayın.</li>
	<li>Retina yapıları 6 cm yemeklerini el ile kurtarmak. Bunu yapmak için Şekil 1Eiçinde gösterildiği gibi etrafında neuroepithelial bud, iğne ile dikey yivler yapma yapıları ayırma ve nazikçe onları çizilmemesi tarafından iğne ile organoids ayırmak.</li>
	<li>10-15 organoids 1000 µL pipet kullanarak Aspire edin ve ProB27 orta içeren 6-şey plaka tek bir kuyuda aktarabilirsiniz.</li>
	<li>Retina organoids ProB27 orta bir hücre kültür kuluçka kayan kültür koşullarda 37 ° C ve % 5 CO2' de unutmayın. Orta yarısı 2-3 günde değiştirin. Not: D35 kadar organoids FGF2 ile tedavi.</li>
	<li>İtibariyle D35, orta yarısı kaldırın ve taze prewarmed ProB27 orta FGF2 olmadan 37 ° C'de ekleyin.</li>
	<li>Orta yarısı her 2-3 gün boyunca Şekil 2' de gösterildiği gibi Retina hücre tipleri, istenen Retina hücre tipleri ortaya çıkması göre elde etmek için gereken süreyi değiştirin.</li>
</ol>5. nesil ve amplifikasyon insan IPSC kaynaklı RPE (hiRPE) hücreleri
<ol><li>
İnsan hiRPE hücre üretimi
	<ol>
<li>Kolonilerin 3A rakamkapsamlıdır protokol sonrası % 60-70 izdiham ulaştığınızda iPSCs farklılaşma içinde meşgul.</li>
		<li>6-cm çanak bı orta başına 4 mL hazırlamak ve 37 ° C'de bı orta sıcak IPSC orta bı orta olarak değiştirin. Bu kez gün 0 (D0) olarak unutmayın.</li>
		<li>D2 bı ortamda daha önce 37 ° C'de ısındı Bın2 orta kültürleri Orta 2-3 günde değiştirin.</li>
		<li>D28 daha önce 37 ° C'de Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi sıcak taze bir ProN2 orta orta değiştirin. Not: Bu adım adım 4'te açıklanan organoid malzeme çekme sonra yapılabilir.</li>
		<li>ProN2 Orta 2-3 günde değiştirin.</li>
		<li>D42 acil hiRPE hücreleri pigmentli yamalar gözlem tarafından 3B şekilgösterildiği gibi tanımlayın. Not: HiRPE hücre pigmentasyon D35 D56 bağlı olarak IPSC klonlar için arasında görünür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE hücreleri amplifikasyon
	<ol>
<li>D42 daha önce 1.2.2. adımda açıklandığı gibi matris ile kaplı ve ProN2 orta iyi başına 1 mL içeren bir 24-şey plaka hazırlayın. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 kullanmadan önce plaka 15 dakika yerleştirin.</li>
		<li>HiRPE yamalar 6 cm çanak el ile kurtarmak. Yamalar izole, pigmentli epitel çevresinde iğne ile dik bir striation yapmak ve yavaşça iğneyle çizilmemesi tarafından sayfası ayırmak için. 1000 µL pipet kullanarak 10 pigmentli yamalar Aspire edin ve 24-şey plaka tek bir kuyuda aktarabilirsiniz.</li>
		<li>HiRPE yamalar ProN2 orta bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 48 h için orta değiştirmeden önce tutmak. Bu hiRPE hücre geçiş 0 (hiRPEp0) Not. Orta 2-3 günde ProN2 orta ile değiştirin.</li>
		<li>Hücreleri konfluent ne zaman hiRPEp0 hücreleri geçmek.<ol>
<li>Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak orta kaldırmak ve her şey 1 x 1 mL 5 mL pipet kullanarak PBS ile yıkayın.</li>
			<li>Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak PBS atmak, 200 µL % 0.25 tripsin kuyu başına ekleyin ve en az 15 dk 37 ° C'de bir kuluçka kuluçkaya ProB27 orta tripsin devre dışı 800 µL ekleyin. Not: Tripsin etkinliğini durdurmak için ProN2 orta kullanımı tavsiye edilmez.</li>
			<li>HiRPE hücreleri sayfa yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak. Hücre süspansiyon bir 15 mL tüp içinde yerleştirin ve 110 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Not: ProN2 orta ProB27 orta fazlalığı kaldırmak için ek bir yıkama yapılabilir.</li>
			<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça 37 ° C'de önceden sıcak ProN2 Orta 2 ml hücre Pelet resuspend Bir hücre sayaç içeren hücreleri saymak.</li>
			<li>1.25 milyon hücre alıp bir matris kaplı T-25 cm2 şişeye yerleştirebilirsiniz (bkz. Adım 2.2.2) 5 mL ProN2 orta de içeren önceden 37 ° C'de ısındı Bu hiRPE hücre geçiş 1 (hiRPEp1) unutmayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HiRPE hücreleri hücre kültür kuluçka ProN2 ortamda 48 h 37 ° C ve % 5 CO2 orta değiştirmeden önce tutmak.</li>
		<li>Medya her 2-3 gün değiştirin. HiRPEp1 hücreleri izdiham ulaştığınızda, sonraki geçit veya dondurma gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. dondurma Retina Organoids ve hiRPE hücre
<ol><li>
Bütün Retina organoids için
	<ol>
<li>5 ila 20 Retina organoids bir transfer damlalıklı kullanarak seçin ve onları kriyojenik bir şişede yerleştirin. Organoids tüp alt dokunmadan 1.000 µL pipet ile aşırı her ortam kaldırın ve soğuk dondurma orta 250 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Bir isopropanol tabanlı dondurma konteyner-80 ° c en az 4 h Transfer şişeleri donmuş şişeleri-150 ° C dondurucu veya uzun süreli depolama için sıvı azot Tankı durdur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE hücreler için
	<ol>
<li>Hücreleri konfluent olduğunda 1 geçiş hiRPE hücreleri ayırmak. Not: Bir dondurma hiRPEp0 hücre tavsiye edilmez.</li>
		<li>Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak T-25 cm2 şişeye ortamından Aspire edin ve yıkayın 1 x 3 mL 5 mL pipet kullanarak PBS ile.</li>
		<li>Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak PBS kaldırmak, 1 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve en az 15 dk 37 ° C'de bir kuluçka kuluçkaya Tripsin etkinliğini durdurmak için ProB27 orta 5 mL ekleyin. Not: ProN2 orta tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için kullanımı tavsiye edilmez.</li>
		<li>HiRPE hücreleri yaprağı 10 mL pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak. Hücre sayacı ile hücreleri saymak. Hücre süspansiyon bir 15 mL tüp içinde yerleştirin ve 110 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi. Not: Ek bir yıkama ile ProN2 orta ProB27 orta fazlalığı kaldırmak için gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>Vakum-aspirasyon kullanarak süpernatant Aspire edin ve yavaşça hücreleri dondurma orta 250 µL 2 milyon hücre elde etmek için resuspend.</li>
		<li>Hücre süspansiyon kriyojenik şişe başına 250 µL aktarın. Bir isopropanol tabanlı dondurma konteyner-80 ° c en az 4 h şişeleri dondur.</li>
		<li>Donmuş şişeleri-150 ° C dondurucu veya uzun süreli depolama için sıvı azot tankı aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. çözdürme Retina Organoids ve hiRPE hücre
<ol><li>
Bütün Retina organoids çözme
	<ol>
<li>Sıcak ProB27 orta 37 ° C'de (2 mL kriyojenik her şişe için gerekli olacak).</li>
		<li>Sıvı azot tankı ya da -150 ° C dondurucu kriyojenik bir şişe Retina organoids 37 ° C'de bir su banyosunda 30 s. dezenfekte için dikkatli bir dezenfektan çözüm sprey kullanarak kriyojenik flakon içeren çözülme.</li>
		<li>Şişe açın ve önceden ısıtılmış ProB27 orta 1 mL ekleyin. Organoids 1.5 mL tüp transferi pipet ile aktarın.</li>
		<li>Orta yavaşça Retina yapıları tüp alt dokunmadan pipetting tarafından çıkarın. Organoids 1 1 mL ile daha fazla zaman önceden ısıtılmış ProB27 orta yıkayın.</li>
		<li>Organoids bir transfer damlalıklı ile Aspire edin ve 1 de önceden ısıttı ve 37 ° C ve % 5 CO2bir kuluçka equilibrated ProB27 orta içeren 6-şey plaka koyun. Not: 6-şey plaka kuyu 10-15 Retina organoids yerleştirin.</li>
		<li>Orta yarısı her 2-3 gün boyunca Şekil 2' de açıklandığı gibi istenen Retina hücre tiplerine göre onların ortaya çıkması, elde etmek için gereken süreyi değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE hücreleri çözme
	<ol>
<li>Sıcak ProN2 orta 37 ° C'de (8 mL kriyojenik her şişe için gerekli olacak).</li>
		<li>Sıvı azot tankı ya da -150 ° C dondurucu hiRPEp1 hücreleri kriyojenik örneği 37 ° C'de bir su banyosu içine bir kuluçka tarafından 30 s. dezenfekte için dikkatle dezenfektan çözüm sprey kullanarak kriyojenik şişe çözülme.</li>
		<li>Tüp açın ve önceden ısıtılmış ProN2 orta 1 mL ekleyin ve hücre süspansiyon önceden ısıtılmış ProN2 Orta 2 mL içeren bir 15 mL tüp aktarmak. 110 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça 37 ° C'de önceden sıcak ProN2 Orta 2 ml hücre Pelet resuspend</li>
		<li>Bir hücre sayaç içeren hücreleri saymak.</li>
		<li>1.25 milyon hücre alıp matris kaplı T-25 cm2 şişeye yerleştirebilirsiniz (bkz. Adım 2.2.2) 5 mL ProN2 orta de içeren önceden 37 ° C'de ısındı Bu aşamada, geçiş 2 (hiRPEp2) olarak unutmayın.</li>
		<li>HiRPEp2 hücreleri hücre kültür kuluçka ProN2 ortamda 48 h 37 ° C ve % 5 CO2 orta değiştirmeden önce tutmak.</li>
		<li>Medya her 2-3 gün değiştirin. HiRPE hücreleri izdiham ulaştığınızda, sonraki geçit veya dondurma gerçekleştirin. Not: daha fazla Hollow'a için 8-10 milyon hiRPE hücre kültüründe 2 hafta sonra toplanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+retinal+diseases:+recapitulating+development+to+replace+degenerated+cells.">Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells.</a> Development. 144, 1368-1381 (2017).</li><li>Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light:+Gene+and+Cell+Therapy+for+Blindness.">Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness.</a> Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).</li><li>Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+custom+therapeutics+for+retinal+repair:+Progress+and+rationale.">Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale.</a> Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+with+Ocular+Disease.">Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).</li><li>Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., P&#233;bay, A., Wong, R. C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Retinal+Ganglion+Cell+Differentiation+From+Pluripotent+Stem+Cells.">Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells.</a> Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).</li><li>Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Patient-specific+stem+cells+to+interrogate+inherited+eye+disease.">Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).</li><li>Nakano, T., Ando, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li><li>Reichman, S., Terray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).</li><li>Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment.">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).</li><li>Zhong, X., Gutierrez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047 (2014).</li><li>Mellough, C. B., Collin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+Signalling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three+dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li><li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li><li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium.">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li><li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina.">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li></ol>

Sacha Reichman, Olivier Goureau ve José-Alain Sahel mucitler Retina hücreleri üretimi için insan pluripotent kök hücre ile ilgili patent bekleyen yanıyor.

Bu iletişim kuralı RPE hücrelerinin ve Retina organoids, Retina RGCs ve photoreceptors, xeno ve besleyici özgür koşullarda insan pluripotent kök hücrelerden içeren üretmek nasıl açıklar. Burada sunulan uyumlu iyi üretim uygulaması (GMP) süreci, ekili yöntemi ile retina hücreleri IPSC kaynaklı büyük bir üretim RPE hücrelerinin, RGCs ve photoreceptors kök hücre tabanlı terapiler ve ilaç geliştirilmesi için izin verir. keşif için Retina Dejeneratif hastalıkları tedavi gelecekte yaklaşıyor....

Retina Merkezi sinir sistemi (MSS) ayrılmaz bir parçasıdır ve travmatik bir yaralanma veya hastalık kendiliğinden yeniden oluşturmak için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu nedenle, dejeneratif patolojiler kesin Retina hücre kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glokom ve diyabetik retinopati, gibi neden genellikle geri dönüşü olmayan körlük neden. Dejenere retina tahlisiye kök hücre tabanlı terapiler bozuk veya eksik hücrelerin yerini alır amaçlayan en umut verici yaklaşımlar1,2,3biri olan büyük bir sorun olduğunu. Pluripotent kök hücreler insan embriyonik kök hücreleri (ESCs) hücreler olarak veya insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) kültürü süresiz olarak genişletilecek kapasitesine sahip ve herhangi bir hücre tipleri üretmek potansiyeline sahip. Vitro geliştirilmesi ve Retina geliştirme anlayışımızı gelişmeler protokolleri insan IPSC farklılaşma sonuçlandı için Retina organoids7,8,9üretimi, 10,11,12. Retina ganglion hücrelerinin (RGCs), photoreceptors ve Retina pigmentli epitel (RPE) hücreleri, dahil olmak üzere büyük Retina hücreleri başarıyla insan ESCs ve iPSCs4,5dan, Ayrıştırılan 6. Eiraku vd tarafından geliştirilen SFEB (serum serbest kültür embryoid vücut benzeri toplamları) yöntemine dayalı 13, Retina organoids öz oluşumu ESC veya IPSC türetilmiş tanımlı hücre dışı matriks bileşenlerinin7,10,14embryoid vücut benzeri toplamları üzerinden elde edilebilir. Ama bu tedavi yaklaşımları veya uyuşturucu tarama için adımları değil her zaman hücreler büyük üretim ile uyumlu çok sayıda gerektiren karmaşık iletişim kurallarıdır. Böylece, insan Retina hücreleri üretmek için yöntem seçiminde önemlidir ve Yöntem sağlam, ölçeklenebilir ve etkin olması gerekir.
Burada, bizim önceki yayın15tarihinde dayanarak, biz her adım bir besleyici ve xeno özgür durumda ekili yapisan insan iPSCs üzerinden Retina organoid öz oluşumu ile retina hücreleri basit ve etkili bir nesil için açıklamak. Yapisan insan iPSCs rutin kültürleri başlayarak, bu iletişim kuralı yalnızca basit bir ardışık orta IP'leri türetilmiş RPE (hiRPE) hücreleri ve neuroretinal yapıları nesil 4 hafta içinde izin vermek için değiştirme gerektirir. El ile bir yalıtım sonra hiRPE-ebilmek var olmak genişlemek ve Retina yapıları Retina progenitör hücre içine tüm Retina hücre tipleri sıralı vivo insan ile tutarlı ayırt etmek mümkün nerede organoids yüzen olarak kültürlü retinogenesis. Son olarak, araştırma gelişme veya klinik çeviri için biz onların fenotipik özellikleri ve işlevselliği etkilemeden bütün Retina organoids ve hiRPE hücreleri uzun süreli depolama sağlayan bir dondurma yöntemi açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14700</td><td>Coating</td></tr><tr><td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A27940</td><td>Coating</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>medium</td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1516401</td><td>medium</td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1370701</td><td>supplement CTS</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td>supplement</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>supplement</td></tr><tr><td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td>supplement CTS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320074</td><td>medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td>supplement</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>CellStart CTS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1014201</td><td>Matrix CTS</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1569601</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>dissociation solution</td></tr><tr><td>Cryostem Freezing Media</td><td>clinisciences</td><td>05-710-1D</td><td>Cryopreservation medium</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>FGF2</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>FGF2 Xeno free</td></tr><tr><td>AGANI needle 23G</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Flask 25 cm&amp;sup2; Tissue Culture Treated</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>T-25 cm&amp;sup2;</td></tr><tr><td>24 well plate Tissue Culture Treated</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>24-well plate</td></tr><tr><td>6 well plate Tissue Culture Treated</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>6-well plate</td></tr></tbody></table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

Özel hücreler pluripotent kök hücrelerinin üretimini rejeneratif tıp için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir araç sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) nerede Retina hücre IPSC kaynaklı modelleri anlamak ve körlük mücadele için önemli bir adım ileri işaretlemek Retina dystrophies, nörodejeneratif hastalık çalışmaları için özellikle çekici kullanmaktır. Bu yazıda, biz oluşturmak, Olgun ve Retina organoids cryopreserve için basit ve ölçeklenebilir iletişim kuralı tanımlamak. Orta değiştirilmesi hakkında temel, bu yöntemin ana avantajı birden fazla önlemek için ve zaman alıcı adımları yaygın olarak iPSCs bir rehberli farklılaşma içinde gerekli. Retina gelişme erken aşamalarında başarılı değişiklikleri yapisan insan IPSC kültürler üzerinde tanımlanan medya tarafından taklit eden, bu iletişim kuralları, neuroretinal yapıları ve Retina pigmentli epitel (RPE) hücreleri kendi kendini oluşturan eşzamanlı üretimi sağlar bir 4 hafta tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde. Retina progenitör hücre (RPC'ler) içeren bu yapılar için daha fazla olgunlaşma RPC farklılaşmaya yetişkin insan retinada mevcut yedi Retina hücre türlerine izin kayan bir kültür durumda kolayca ayrılmış olabilir. Ayrıca, Retina organoids dondurma için hızlı yöntemleri ve RPE hücrelerinin uzun süreli depolama için açıklar. Birlikte birlikte, burada açıklanan yöntemleri üretmek ve insan IPSC kaynaklı Retina hücreleri veya doku temel ve klinik araştırma için banka yararlı olacaktır.

İlk insan IPSC farklılaşma besleyici-Alerjik koşulları16 ekili için spontan farklılaşma (Şekil 1A) teşvik için Bi orta kullanarak kendini yenileme makine kapatmaya adımdır. O zaman, D2 Bi orta tamamlanmaktadır sinirsel ve Retina soy karşı ayırt iPSCs hücreleri gösterecek bir N2 takviyesi ile. Bu işlem neuroretinal tomurcukları etrafında D28 görünümünü yol açar (Şekil 1 c -<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models at JoVE.com

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K Görüntüleme.  Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France. Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Video: Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Gelişim Biyolojisi

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

Biyoloji

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Gelişmiş 3D Nöral Retina Farklılaşması

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

Yazar Spotlight: Hastalık Modellemesi için Basit ve Verimli Nöral Retina Organoid Üretimi

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması