Bu protokol, insan IPC'lerini araştırma ve rejeneratif uygulamalar için karmaşık üç boyutlu nöro retinal organoidlere ayırmanın basit ve etkili bir yöntemini açıklamaktadır. Bu teknik, hem retinal organoidlerin hem de RP hücrelerinin seçici olarak toplanmasına ve zenginleştirilmesine izin veren hem yapışkan hem de süspansiyon kültürlerini içerir. Retinal dejeneratif hastalıklar için hücre bazlı tedaviler geliştirmek için uygun ve düzenli bir hücre kaynağı kaynağı sağlayabilir.
Bu tür kök hücre kaynaklı retinal organoidler ve RPE hücreleri, göz gelişimini ve kalıtsal retina hastalıklarını incelemek için in vitro modeller gibi yararlıdır. Bu yöntem, insan IPSC kültürlerini ele almaya aşina olan araştırma laboratuvarları tarafından kolayca çoğaltılabilir. Görsel gösterim, göz alanlarının tanımlanmasını ve nöro retinal bardakların mekansal konumlarına ve morfolojik özelliklerine göre izole edilmesini büyük ölçüde desteklemektedir.
Başlamak için, harcanan ortamı% 70 ila% 80 arasında aspire edin.İnsan IPSC kültürleri altı kuyucuklu plakalarda. Kuyucuklara PBS ekleyin, onları döndürün ve yıkama tamponunu aspire edin. Daha sonra her bir kuyucuğa bir mililitre hücre ayrışma çözeltisi veya CDS ekleyin ve hücreler toplanana kadar plakayı beş ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
CDS'yi aspire edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Tüpü oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1.000 RPM'de döndürün. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1.2 mililitre Essential 8 ortamında yeniden askıya alın.
1,5 mililitre IPSC kültür ortamı ve 10 mikromolar Y27632 içeren matris kaplı altı delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. 12 ila 24 saat sonra, harcanan ortamı çıkarın ve kültürleri korumak için Y27632 olmadan önceden ısıtılmış tam yükseliş ortamı ekleyin. Kültürler% 70 ila% 80 birleşime ulaşana kadar her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin.
Sıfır gününde, insan IPSC bakım ortamını aspire edin ve altı kuyucuklu plakaya mililitre BFGF başına bir nanogram ve mililitre Noggin başına bir nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İlk gün, harcanan ortamı aspire edin ve mililitre BFGF başına bir nanogram ve mililitre Noggin başına 10 nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin.
Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin. İkinci ve üçüncü günde, harcanan ortamı çıkarın ve mililitre Noggin başına 10 nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin. Altı delikli bir plakaya kuyu ortamı başına iki mililitre ekledikten sonra, hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin.
Dördüncü günde, harcanan ortamı çıkarın ve retinal farklılaşma ortamını veya RDM'yi ekleyin. Altı delikli bir plakaya kuyu ortamı başına iki mililitre eklemek ve kültürleri inkübe etmek için aynı prosedürü izleyin. Ortamı her gün değiştirin.
14. ve 18. günlerde, erken göz alanı progenitörlerinden oluşan nöral rozet benzeri alanların ortaya çıkması için kültürleri mikroskop altında 10X büyütmede gözlemleyin. 21 ve 28. günlerde, nöro epitel ve oküler yüzey epitelinin bitişik çıkıntıları ile çevrili merkezi bir dairesel 3D nöro retinal yapı adası ile kendi kendini organize eden farklı EFP'lerin ortaya çıkışını gözlemlemek için kültürleri mikroskop altında 4X ve 10X büyütmede gözlemleyin. Steril bir Pasteur pipet alın ve tabanı bir elinizde ve kılcal ucu diğer elinizde tutun.
Alev, kılcal ucun ortasına yakın bölgeyi, cam esnek hale gelene kadar dönme hareketleriyle sterilize eder ve ısıtır. Ardından alevden uzaklaşın ve kapalı lümenli ince bir kılcal uç oluşturmak için kılcal ucu hızla dışarı doğru çekin. İnce ucu alevin önünde yatay olarak tutun ve pürüzsüz bir kanca veya L şeklinde bir kılcal uç oluşturmak için alevin içinden dışa doğru bir hareketle hızla geçirin.
Bir stereo mikroskop altında, kılcal kancanın pürüzsüz dış eğrilik bölgesini ince bir kepçe olarak kullanarak iyi biçimlendirilmiş nöro retinal kapları bireysel EFP'lerden manuel olarak seçin. 25. ve 30. günlerde, kültüre düşük bir bağlantı 60 milimetrelik bir kapta dört mililitre önceden ısıtılmış retinal farklılaşma ortamı ekleyin ve 3D retinal organoidler üretmek için retinal kapları koruyun. Bu, nöro retinal bardakların toplanmasından önce yapılmalıdır.
100 mikrolitreyi aspire etmek için bir milimetrelik bir mikropipet ayarlayın ve yüzen retinal kapları aspire etmek ve daha önce hazırlanan taze, düşük yapışkanlı kültür yemeklerine aktarmak için geniş delikli açıklıklara sahip bir mililitre mikro uç kullanın. RDM'deki retinal kapları yapışkan olmayan süspansiyon kültürleri olarak tutun ve% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 30. ve 45. günlerde, kısmi bir besleme yöntemini izleyerek, harcanan ortamın hacminin yarısını çıkarın ve eşit miktarda taze ortam ile değiştirin.
45. ve 60. günlerde, nöro retinal progenitörlerin daha iyi sağkalımını ve soy farklılaşmasını ve olgun retinal hücre tiplerinin gelişimini desteklemek için 100 mikromolar taurin içeren RDM'de retinal organoidleri iki hafta daha kültürleyin. Retinal organoidler, RT-PCR ve immünohistokimya kullanılarak çeşitli retinal progenitör belirteçlerin ekspresyonu için olgunlaşmanın farklı aşamalarında karakterize edilir. RT-PCR sonuçları, bir aylık retinal organoidlerde ve iki aylık retinal organoidlerde nöro retinal belirteçlerin indüksiyonunu ve ekspresyonunu doğruladı.
Burada nöro retinal progenitör belirteçleri Chx10, PAX6 ve Otx2'ye karşı antikorlar kullanan olgunlaşmamış retinal organoidlerin immün işaretli kesitlerinin konfokal görüntüleri ve fotoreseptör öncü belirteçleri recoverin ve CRX'e karşı antikorlar kullanan olgun retinal organoidlerin konfokal görüntüleri gösterilmiştir. Farklılaşan fotoreseptör hücrelere sahip retinal organoidlerin belirgin dış tabakası yakınlaştırılır ve bu görüntülerde gösterilir. İlkel iç segment benzeri uzantılar beyaz oklarla işaretlenmiştir.
Merkezde nöroretinal fincan bulunan EFP kümeleri ve göç eden RPE çıkıntıları, ön kenarlar boyunca pigmentasyon gösterir. Burada nöro retinal adanın her yerindeki çoklu EFP'lerden iyi diferansiye pigmente epitel çıkıntıları gösterilmiştir. Bir EFP'nin daha yüksek büyütmesi, RPE progenitörlerinin göç bölgesini ve bir nöro retinal kabı çevreleyen oküler yüzey epitelini gösterir.
Hem pigmentli hem de pigmentli olmayan hücreleri içeren olgunlaşmamış RPE hücrelerinin monokatmanlarını geliştiren genişletilmiş yapışkan kültürler burada gösterilmiştir. Tam olgun ve pigmentli RPE hücrelerinin tek katmanlı kültürleri 60. günde parke taşı morfolojisi gösterir. PAX6, MITF ve RPE65'i eksprese eden RPE hücreleri bu şekilde gösterilmiştir.
Bu görüntüler, retinal progenitörlerin anormal agregaları olan EFP'leri, çarpık laminasyon ve çizik eksikliği ile temsil eder. Minyatür nöroretinal fincan ile EFP, ancak RPE ve oküler yüzey epitelinin çevresindeki bölgeden yoksun olarak bu şekilde gösterilmiştir. Temsili görüntü, süspansiyon kültüründe oluşan düzensiz nöroretinal agregaları göstermektedir.
Üç ila dört hafta içinde göz alanlarının verimli bir şekilde indüksiyonunu sağlamak için IPC'lerin neredeyse birleşen büyüyen kültürlerini kullanarak farklılaşma sürecine başlamak çok önemlidir. Normal ve hastaya özgü IPC'lerden üretilen retinal organoidler ve RPE hücreleri, retina hastalığı modelleri olarak ve yeni terapötik ilaçların test edilmesinde kullanılabilir.
