Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir: NIH R21 EB021870-01A1 ve NSF araştırma projesi hibe: 1517110.

1. eşleme Fastq dosyaları
Not: Başvuru DNA konumunda için DNA dizisi veri okumak her sıra onda eşlenmiş DEEPN bilgisayar yazılımı hem hem birçok Biyoinformatik programı kullanın. Haritalama programları çeşitli bu HISTAT2 programın sonraki adımda kullanılan .sam dosyaları üretmek için kullandığı MAPster arabirimi eklemek için kullanılabilir.
<ol><li>Sıralı veri genom doğru sürüme eşleyin. Y2H kitaplıkları için fare kökenli, UCSC mm10 genom kullanın; o insan genleri kullanarak, UCSC hg38 başvuru soykırım, Saccharomyces cerevisiae genler için kullanın, UCSC SacCer3 başvuru genom kullanın.</li>
	<li>
MAPster yükleyin.
	<ol>
<li>MAPster yazılımını indirin ve yükleyin. Aşağıdaki, bir web tarayıcısı kullanarak yazılım bulunabilir: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 bir Apple Macintosh gibi UNIX tabanlı sistemlerde çalışır. Bu nedenle, MAPster program yalnızca Apple Macintosh ve linux gibi uyumlu sistemlerde çalışır. Not: Bir Apple Mac için sistem gereksinimleri şunlardır: OSX 10.10 +, > 4 Gb RAM, > 500 Gb disk alanı ve başvuru genleri indirmek için internet bağlantısı. Kullanıcılar kendi kurumsal yönetici haklarını ve izinlerini kısıtlayarak güvenlik protokolleri varsa bir kurumsal ile o kişinin danışmanız gerekebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerekli dosyaları ve "Ana" sekmesini (Şekil 1) aracılığıyla parametreleri girin. Dosyaları girmek için uygun "Pairwise" düğmesini ya da gibi çiftleri ile FASTQ olarak varsayılan dosya biçimi unpaired seçin.
	<ol>
<li>DEEPN analiz için tek okuma biçimde çalıştırmak için "Off" "Pairwise" seçeneğini kapatın.</li>
		<li>Dosyaları sürükle ve bırak uygun pencere içine sadece tarafından MAPster yükleyin.</li>
		<li>Bir referans Y2H av kitaplığı ekler kaynağına karşılık gelen DNA/genom kaynak'ı seçin. Birkaç model organizmalar üzerinden dizin oluşturulmuş genleri "Genom" kutusunda listelenir ve otomatik olarak merkezi Johns Hopkins Üniversitesi'nden-ebilmek var olmak downloaded için İşlemsel Biyoloji. Başvuru genleri daha sonra kullanmak üzere yerel olarak depolanır.</li>
		<li>HISAT2 çekmek multi-iplik beri "Konu" kutusunun altındaki eşleme programa sadık olmak bilgisayar işlem sayısını gösterir. MAPster bilgisayarı arayın ve varsayılan olarak kullanılabilir olan işlemci en fazla sayısını öneririz.</li>
		<li>Çıkış dosyası adı belirtin. Bu yüzden kısa ama açıklayıcı bir ad boşluk veya özel karakterler olmaksızın tavsiye bu dosya adı DEEPN süreci boyunca kullanılır. Çıkış "Açık çıktı dizin" düğmesini kullanarak eşlenen dosyaları için bir klasör belirtin.</li>
		<li>Parametreleri ve uygun dosyaları seçtikten sonra eşleme iş "Eklemek için sıraya al" düğmesini kullanarak işleri sıraya ekleyin. Ana penceresinde dosya adları silinir ve yeni bir örneğe karşılık gelen dosyalarla değiştirilir ve onlar sıraya karşılık gelen bir çıktı dosya adı sağladıktan sonra eklenebilir.</li>
		<li>Tüm işleri iş kuyruğuna girildikten sonra "Sıra çalıştırmak" düğmesini tıklatın. Not: bir kez bir eşleme iş sırasına yerleştirilir, bu işi seçmek "İş parametreleri" ve "İş komut" penceresinde görüntülenecek tüm bağımsız değişkenler komut satırı deyimiyle görüntülenecek parametre ayarlarını neden olur. Çıkış seçenekleri hizalamak için başarısız devam okuma olup olmadığını yönlendiren ve birincil hizalamaları her okuma için izin sayısını belirten içerir. MAPster varsayılan çıkış dosyasından (Örneğin bir '.sam' dosyası) SAM biçimindedir. Tüm sıra okuma fastq dosyalarından (eşleştirilmiş) olduğunu o da dahil olmak üzere bu örnek için belirtilen ve değildi içereceği (belirtilen geome başarıyla eşlenen eşlenmemiş).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic işleme kullanarak DEEPN yazılımı
Not: DEEPN yazılım şu anda fare cDNA dizileri, insan cDNA dizileri veya S. cerevisiae genomik DNA dizileri içeren av kütüphaneleri ile kullanım için derlenmektedir. DEEPN standart .sam dosya biçimlerini kabul eder ve her eşlenmeyen ve eşlenen okuma için hem eşlenmiş hem de eşlenmemiş okuma veya ayrı dosyalar içeren bir SAM (.sam) dosya kabul edebilir.
<ol><li>DEEPN yazılımını indirin ve yükleyin. Aşağıdaki, bir web tarayıcısı kullanarak yazılım bulunabilir: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Bilgi işlem platformu ve download hangi sürümü ile eşleşen seçin. Yüklemek için karşıdan yüklenen yükleme paketi açın. Not: DEEPN sürümleri için PC, Mac ve Linux sysrems mevcuttur. Mac ve PC sistemleri olmalı > 500 Gb sabit disk alanı ve > 4 Gb RAM.</li>
	<li>
DEEPN yazılımını açın. Ana penceresinden (Şekil 2) karşılık gelen bir av kütüphane bilgi üst seçim kutusundan seçin. İşlem gören dosyaları "Çalışma klasörü" düğmesini ve gezinme ağıl/müdür için gidebilecekleri bir klasör seçin. Gerekirse yeni bir klasör/dizin oluşturabilirsiniz. Bir "çalışma klasörü" seçildikten sonra DEEPN unmapped_sam_files, mapped_sam_files ve sam_files adlı üç alt klasörler oluşturabilirsiniz.
	<ol>
<li>Bu gibi hem eşlenmiş hem de eşlenmemiş okuma içeren .sam dosyaları kullanılarak üretilen MAPster programın varsayılan ayarlarla Eğer onları 'sam_files' klasörüne yerleştirin. Aksi takdirde .sam dosyalarını içine belgili tanımlık unmapped_sam_files ve mapped_sam_files buna göre yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İşleme "Gen sayısı + Kavşağı yapmak" düğmesini tıklatarak başlatın. Not: İşlem eşleme pozisyonlar her gen için kaç defa okundu karşılık saymak için kullanacağı gen sayısı modülü ile başlayacak. Kavşak yapmak sonra kavşak dizileri ayıklamak (dizileri erimiş doğrudan aşağı akım Gal4-harekete geçirmek etki alanından) üzerinden okuma ve patlama algoritmasıyla tanımak. Bu, Şekil 3' te resimde klasörlerin tam bir set oluşturur. İşlem zamanı büyüklüğüne ve sıralı veri dosyası sayısı ve kullanılan bilgisayarın işlem hızından bağlıdır. 12 – 30 h ~ 250 milyon deneysel veri kümesinin aralığından tipik kez okur. Gen sayısı yordam ve Junction_Make yordam tek tek "Gen sayısı" ya da "Kavşağı yapmak" düğmesini tıklatarak başlatılabilir.</li>
	<li>
Karşıdan yükleyip Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Bu bir istatistiksel analiz paketi şu anda yalnızca UNIX Mac sistemlerinde çalışır DEEPN veri kümeleri için dizayn edilmiştir.
	<ol>
<li>Stat_Maker açın ve tıkırtı belgili tanımlık düğme "Doğrulamak yüklemeyi" (Şekil 4). İlk kez çalıştırıyorsanız, Stat_Maker otomatik olarak R, KEŞLER ve Bioconductor internetten bu kaynakları çekerek yükler. Kez R, KEŞLER ve Bioconductor algılandı, Stat_Maker aktif hale gelir ve daha fazla kullanıcı girişi sağlar.</li>
		<li>DEEPN işlenen çalışma klasöre gitmek için "Klasörünü Seç" düğmesini tıklatın. Stat_Maker otomatik olarak bulmak ve penceredeki istatistiksel analiz için dosyaları listelemek.</li>
		<li>Uygun dosyaları dosya listesi penceresinden dosya windows altında her vektör ve yem veri kümesi için ve her büyüme koşulları için sürükleyip bırakamazsınız: seçili olmayan (onun + medya) ve (onun - medya) seçili. Önemlisi, Stat_Maker boş için yinelenen veri kümelerini tek başına, seçili olmayan nüfusun iki örnek vektör ve iki örnekleri seçili gerektirir. Bu tahmini değişkenlik deneme içinde verir.</li>
		<li>"Çalıştır" düğmesini tıklatın. Bilgisayarın hızına bağlı olarak, hesaplama 5-15 dakika arasında sürer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiketli "Stat_Maker sonuçlar" ana çalışma klasörü içinde yeni bir alt klasör yerleştirildiği Stat_Maker çıktı sonuçları gözden geçirin. Not: Sonuçları ortak elektronik tablo programları açılabilir bir CSV (virgülle ayrılmış değerler) dosyasında bulunur. Stat_Maker differentially faiz ile yem seçimi boş pTEF-GBD (Şekil 5) zenginleştirilmiş muhtemeldir gen sayısı rütbe olacak. Ayrıca tablo her veri kümesi için okuma yüzdesi gen ekleme, veya açık okuma çerçevesi ve olsun gene de doğru translasyonel okuma çerçevesi içinde bulunan içinde ters yönde, bulunursa nerede. Çoğu zaman, DEEPN bir yem sağlam Y2H etkileşimleri ile ilgili protein uygun okuma çerçevesi dışında veya bir karşılık gelen onun açık okuma çerçevesi aşağı akım cDNA parçasıdır verilen cDNA bölümlerini yakalayacaktır. Stat_Maker birleştirilmiş çıktısı tarama algılama ve bu alakasız sayısı ortadan kaldırılması basitleştirir.</li>
	<li>
Her potansiyel aday üzerinde verileri gözden geçirmek için açık DEEPN bilgisayar yazılımı, karşılık gelen av kütüphane bilgi ve sonra "Çalışma klasörü" kullanarak doğru çalışma klasörü seçin.
	<ol>
<li>"Patlama" sorgu"düğmesini tıklatın. Bu yeni pencere (Şekil 6) yükler. Üst metin kutusuna gen adını veya aday gen ilgi seçmek için GenBank NM numarasını yazın. Bu gen adları StatMaker çıktı dosyasında listelenen adlarına karşılık gelir. Türü enter veya return, hangi ilgi gen alınmasını başlatır.</li>
		<li>Hangi veri kümeleri "Veri kümesi seçin" menüleri kullanarak çözümleme için kullanılacak seçin. Genellikle, bunlar sadece vektör içerir ve selektif olmayan koşullar altında yetiştirilen örnekleri ve seçimi koşullar altında yetiştirilen yem örnek yem. Başlangıçta, veri kümelerini yüklemek için bir kaç saniye sürecek, ancak, aynı veri kümeleri farklı genler ile sonraki sorgu hızla gidecek. Blast_Query ilgi ve nasıl bol miktarda her erime noktası sıra boyunca füzyon noktaları görüntüler. Bu hem "Sonuçlar" sekmesini kullanarak tablo biçiminde veya bir grafik biçiminde "Komplo" sekmesini kullanarak görüntülenebilir. Bu sonuçlar bir .csv dosyasına sağ üst köşesinde ".csv Kaydet" düğmesini tıklatarak dışa aktarılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DEEPN tarafından belirlenen adaylar doğrulanması
Not: DEEPN ve Stat_Maker amacı bir pozitif Y2H etkileşim vermek aday genler belirlemektir. Böyle Y2H etkileşimleri doğrulama de bitmiş yem plazmid ilgi kullanarak geleneksel ikili Y2H biçimini kullanarak boş Gal4-harekete geçirmek etki alanı 'av' plazmid ile eşleştirilmiş olarak faiz gen/cDNA parçası taşıyan av plazmid ile eşleştirilmiş. Gerçek plazmid DNA Y2H Seçime tabi Maya popülasyondan izole karışımı içinde ilgi izole etmek mümkün değildir. Ancak, bir hesaplama açısından ne o Y2H etkileşim üretiyor gen/cDNA parçası olan yeniden yapılandırma, astar 5' ve 3' ucunda bu parça için tasarım ve o parça Maya popülasyondan izole DNA yükseltmek. Bu bölüm 5' ve 3' sonunda aday av parçasının bulmak açıklar.
<ol><li>DEEPN yazılımını açın ve parametreleri "Select Parameter" ve "İş projeye karşılık gelen klasör seç" çalışma klasörü seçin. Blast_Query modülü "Patlama" sorgu"düğmesini tıklatarak başlatın.</li>
	<li>
Faiz veya onun GenBank "NM" gen adını yazın en iyi metin kutusuna numara. Aşağı açılır menüden birleşme pozisyonları 'Sonuç' sekmesinin altındaki tablo almak için seçilen Maya popülasyon için yem ilgi için karşılık gelen veri kümesini seçin. Varsayılan olarak, veritabanı içinde bulunan kavşak sayısı ppm tarafından sayısal veri kümesi, onların bereket göre farklı pozisyonlar Blast_Query sipariş edecek.
	<ol>
<li>En bol pozisyon bulmak "ORF içinde" ve "çerçevesinde". Pozisyon için değer üst metin kutusunda bulunan nükleotit konumunu gen NCBI başvuru sırası ('NM' numarası) ile karşılık gelir. Bu sıra GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) alınan veya Blast_Query pencerenin alt metin kutusuna kopyalanır. Not: Bir örnek Şekil 6' da, orta masası bulunur. Merkezi veri kümesinde 'Sonuç' en bol kavşak göster: 'Konum': 867; '#Junctions': 20033.821; 'Sorgu Başlat', 1; CD: ORF; ve 'Çerçeve': çerçeve içinde. Nükleotit 867 GenBank NCBI başvuru sırası NM_019648 av parçası başlıyor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sorguyu başlatın 1 ise, 5' ucuna pozisyon numarasına karşılık gelen nükleotit dahil etmek için astar tasarım ve o konumdan (Şekil 7) 25 nükleotit aşağı genişletme. Sorguyu başlatın 1 den fazla ise, Gal4 harekete geçirmek etki alanı ve faiz av dizisi arasındaki fazladan nükleotid vardır ve astar aşağı sorguyu başlatın değerine göre daha başlaması gerektiğini gösterir.</li>
	<li>DEEPN penceresinden "Verileri çözümleme" altında "Okuma derinlik" düğmesini tıklatın. Okuma derinlik penceresi açıldıktan sonra NCBI başvuru sırası (NM) numarası veya gen adı üst metin kutusuna yazın. İlgi zenginleştirilmiş gen içeren ilgili veri kümesi seçmek için açılan menüyü kullanın. Soldaki tablo kullanın ve kaç defa okundu faiz (Şekil 7B) gen için karşılık gelen veri bulunamadı belirlemek için sağdaki grafik görüntüler.</li>
	<li>Okuma derinlik tarafından hesaplanan gen parça dizisi ele geçirecek bir 3' son astar tasarım. Okuma zenginliği ORF giderse ve dur kodonu, o katmak kodonu ve sadece akıntıya karşı bölgenin kodonu astar tasarlayın. Gen dizileri için kodonu genişlemediğine sonuçları tablo tespit edilebilir ve bu pozisyon en uzak 3' kullanabileceğiniz en uzak 3' bölgesini bulmak için kullanırsanız, astar yerleştirmek için konumu. Not: Okuma derinlik program belirtilen gen/cDNA ilgi maç dizileri bulamadı aralıklarla tarar. Bu en bol av parçası 5' ve 3' sonu o gen örnek için nerede tahmin yardımcı olur. Şekil 7' de görüldüğü gibi dizinin uzunluğunu okuma derinliğine dalgalanmaları normaldir. Okuma derinlik açıkça kodonu ise, av parçası kodonu genişletir ve böylece 3' astar sadece kodonu çevresindeki karşılık gelebilir gösterir.</li>
	<li>
Gen başına 50 µL PCR reaksiyonu gerçekleştirmek. Her reaksiyon 25 pmol av-Kütüphane plazmid eşleşen her ileriye ve geriye doğru astar içerir (bkz. tablo malzeme). Reaksiyonlar da yüksek-sadakat 2 x PCR Master Mix 25 µL, DNA örneği ve 50 µL kadar su 5 µg içerir.
	<ol>
<li>Tavlama sıcaklığı 55 ° C 30 72 ° C'de 3 dk. uzantılı kez 25 döngüleri için tepkiler yükseltmek s ve 10 98 ° C'de denaturing 98 ° C'de 30 s denatürasyon tarafından Bisiklete binme Precede s. ve 72 ° C'de 5 dk kuluçka ile takip edin</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26813401">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13(2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Burada açıklanan yazılım paketi bir tamamen işlemek ve DEEPN deney yüksek işlem hacmi DNA sıralama verileri çözümlemek izin verir. Kullanılan ilk DNA dizisi okuma standart fastq dosyalarında alır ve konumlarını DEEPN yazılım da dahil olmak üzere bilişim programları bir bütün ana tarafından aşağı akım işleme için bir referans DNA üzerine haritalar MAPster bir programdır. Belgili tanımlık yarar MAPster arabirimi ve birden çok iş birleştirmek giriş dosyaları, sıraya yeteneğini coveni...

Protein etkileşimleri keşfetmek için bir yaklaşım hangi olağanüstü başarı bir protein ilgi etkileşen bir ortak1bir parçası için bağlandığında büyümek Maya hücreleri mühendislik Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Birden çok Y2H etkileşimleri tespiti şimdi büyük paralel yüksek üretilen iş sıralama yardımı ile yapılabilir. Birkaç biçimi olmuştur nerede nüfus toplu üretmek plazmid içeren Maya için seçin koşullar altında yetiştirilen geliştirdiğimiz bir dahil olmak üzere2,3,4,5 açıklanan bir pozitif Y2H etkileşim6. İş akışı geliştirilen, DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı, fark interactomes bir protein (veya etki alanı) vsile etkileşim proteinler tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlar. başka bir protein veya doğurmak farklı mutant etki alanı. Bu iş akışındaki temel adımlardan uygun işleme ve DNA sıralama veri analizi biridir. Bazı bilgiler sadece her gen için okuma önce ve sonra seçimi bir moda Y2H etkileşimlerin sayısını benzer bir RNA-seq deney sayarak panoda. Ancak, çok daha ayrıntılı bilgi Y2H etkileşim üretebilen bir verilen protein alt etki alanı hakkında bilgi de dahil olmak üzere bu veri kümeleri elde edilebilir. DEEPN yaklaşım değerli ise, buna ek olarak, birçok örnek çoğaltır analiz hantal ve pahalı olabilir. Bu sorun özellikle DEEPN veri kümeleri için geliştirilmiş istatistiksel bir modelini kullanarak çoğaltır sayısı sınırlı6nerede ortadan kalkar. İşleme ve analiz DNA sıralama veri kümeleri Biyoinformatik uzmanlık olmadan bu araştırmacılar için güvenilir, tam, sağlam ve erişilebilir yapmak için a maiyet-in tüm adımları analiz kapak yazılım programları geliştirdi.
Masaüstü bilgisayarlarda tek başına yazılım programları bu paketi MAPster, DEEPN ve Stat_Maker içerir. MAPster aşağı akım uygulamalarda kullanmak için bir standart .sam dosyası üreten her fastq dosya sıraya eşlemek için istimal HISAT2 programı7, genom sağlar bir grafik kullanıcı arayüzü var. DEEPN birkaç modülden oluşmaktadır. Bu atar ve belirli gen 'Gene say' modülü kullanılarak bir RNA-seq türü miktar için benzer karşılık gelen okur sayar. Ayrıca Gal4 transkripsiyon etki alanı ve av dizini arasında kavşak karşılık gelen dizileri ayıklar ve onların muayene karşılaştırmalı tablolar ve grafikler ('Junction_Make' modülü kullanılarak) izin vermek için bu kavşak konumunu harmanlar 'Blast_Query' modülü kolay muayene, Nefelometri ve kavşak Gal4 junction sıralarının karşılaştırma sağlar. Stat_Maker okuma başına gen zenginleştirme veri büyük olasılıkla Y2H sayısı öncelik istatistiksel bir yolu olarak değerlendirir. Burada, biz nasıl kullanma bunlar bilgisayar yazılımı bilgisayar programı ve DEEPN Y2H verilerden deneme DNA dizisi tam olarak çözümlemek için açıklar. DEEPN sürümleri PC, Mac ve Linux sistemleri çalıştırmak kullanılabilir. Eşleştirme programı MAPster gibi diğer programlar ve DEEPN istatistikler modülü Stat_Maker Unix altında çalışan ve yalnızca Mac ve linux sistemlerinde kullanılabilir alt yordamlar kullanır.

<table><tbody><tr><td>Mapster</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td></tr><tr><td>DEEPN software</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Statmaker</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Minimum computer system</td><td>Apple</td><td></td><td>Mac Intel Core i5 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>OS 10.10 or higher</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>Windows 7 or higher</td></tr></tbody></table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Aynı anda onlarca geçici ve statik protein etkileşimleri yüksek üretilen iş kısa okuma DNA sıralama kullanan tek bir ekran içinde ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması. Elde edilen sıra veri kümeleri sadece olumlu Maya 2-hibrid etkileşimleri için seçimi sırasında zenginleştirilmiş hangi genlerin bir popülasyondaki izlemek ama ayrıca protein etkileşimi için yeterli ilgili alt etki alanları hakkında ayrıntılı bilgi verir. Burada, uzman olmayan tüm Biyoinformatik ve işlemek ve DNA dizisi fastq dosyaları toplu Maya 2-hibrid tahlil analiz istatistiksel adımları gerçekleştirmek izin tek başına yazılım programları tam bir süit açıklayın. Bu yazılım tarafından örtülü işlem adımları içerir: bir Maya 2-hibrid av kitaplıkta; kodlanmış her aday protein karşılık gelen 1) haritalama ve sayım sıra okuma 2) zenginleştirme profilleri değerlendirir bir istatistiksel analiz programı; ve 3) translasyonel çerçeve ve kodlayıcı bölge içinde konumunu ilgi etkileşen protein kodlayan her zenginleştirilmiş plazmid incelemek için araçlar.

Fastq veri eşleme: ilk adım DEEPN ilk çıkış, hizalama için genomik tarafından eşlenmelidir kısa sıra okuma bir dosyadır dahil olmak üzere hemen hemen tüm NGS uygulamalarda transcriptomic veya diğer referans DNA8. Son zamanlarda, HISAT2 hizalama program eşleme hız7,9önemli ölçüde artırmak için state-of--art dizin oluşturma algoritmaları kullanan geliştirilmiştir...

Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K Görüntüleme.  University of Iowa. Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Video: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biyokimya

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetik

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biyoloji

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Maya İki-Hibrit Tekniği Kullanılarak Biyomoleküler Etkileşim Çalışmaları 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

Yazar Spotlight: Mayada Etkileşim-Boş Mutantların Gelişmiş İzolasyonu

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...