Geliştirilmiş maya tek melez tahlillerin amacı, bir DNA ilgi dizisine bağlanan transkripsiyon faktörleri kümesini tanımlamaktır. Bu tekniğin avantajı, gelişmiş maya tek melez tahliller tek bir deneyde 1000'den fazla transkripsiyon faktörleri değerlendirebilirsiniz. Tersine, kromatin immünopresidivarı aynı anda sadece bir transkripsiyon faktörünü değerlendirir.
Bu yöntem, gen yükselticilerine ve arttırıcılarına bağlanan transkripsiyon faktörlerinin repertuarını belirlemek ve kodlamayan varyantlara bağlanan değiştirilmiş transkripsiyon faktörünü belirlemek için fonksiyonel genomikler için önemli bir araçtır. Prosedürü gösteren Dr.Xing Liu benim laboratuvarımdan bir doktora sonrası olacak. Buz üzerinde TF av dizisi ile maya gliserol stok plakaları çözültün.
12 kanallı pipet kullanarak mayayı yeniden askıya alın ve 1 ila 3 dakika içinde bir sonraki adıma geçin. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar içine maya nokta için, kaynak olarak multiwell 96 plakaları seçmek için yüksek yoğunluklu bir dizi robot kullanın, hedef olarak 96 agar plakaları, ve 96 uzun pin pedleri. Pin pedleri yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.
96 kuyu plakası başına iki kopya yapmak için Spot Birçok programını seçin. Dondurulmuş stokların geri kontaminasyonunu önlemek için geri dönüşüm veya yeniden kullanım seçeneklerini kullanmayın. Ayrıca, maya karıştırmak için kaynak yukarı ve aşağı girdap seçeneği seçin.
Plakaları nereye ve ne zaman yerleştirebileceğinize yönelik talimatları uygulayın ve robotun mayayı Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalara yerleştirmesine izin verin. Çanta benekli dizi ve 2 ila 3 gün boyunca 30 derece santigrat kadar agar tarafı kuluçka. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalarda 384 koloni dizisi oluşturmak için kaynak olarak 96 agar plaka, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa iğne pedi seçin.
Ardından 1:4 dizi tek kaynak programını seçin. Bu şekilde, dört adet 96 koloni plakası bir 384 koloni plakasında birleştirilir. Farklı plakalar arasındaki kirlenmeyi önlemek için geri dönüşüm veya yeniden kullanım seçeneklerini kullanmayın.
Plakaları poşetle ve benekli 384 koloni dizisini 2 gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar 1536 koloni dizileri oluşturmak için, kaynak olarak 384 agar plakaları seçin, hedef olarak 1536 agar plakaları, ve 384 kısa pin pedleri. Ardından 1:4 tek kaynak programını seçin.
Amaç, dört katına çıkarmak için her koloniyi dört koloniye kopyalamaktır. Her koloninin 4 kez kopyalanması yla ilgili olarak geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneklerini kullanın. Robotun talimatlarına uyun ve robotun 3 gün boyunca 30 santigrat derecede benekli 1536 koloni dizisini paketlemeden ve kuluçkaya yatırmadan önce mayayı plakalara göre tespit etmesine izin verin.
Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar 1536 koloni dizi yükseltmek için, kaynak olarak 1536 agar plakaları seçin, hedef olarak 1536 agar plakaları, ve 1536 kısa pin pedleri. 3 ila 4 kopyayı çoğaltmak için Çoğaltma Çok programını seçin. Geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneğini kullanın, ancak çapraz kontaminasyonu önlemek için dizinin farklı bir plakasına geçerken pedi atın.
Robotun Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar içinde 1536 koloni dizisini yükseltmek için izin verin. Son olarak, plakaları torba ve 30 derece santigrat kadar 3gün boyunca miyon adımlar için kullanmak için benekli 1536 koloni dizisi agar tarafı kuluçka. Dna yem zorlanma çimleri mite için hazırlamak için, bir Sc eksi urasil ve histidine plaka üzerinde DNA maya yem suşları nokta ve 3gün boyunca 30 santigrat derece büyümek.
Her plaka 12-16 farklı suşları sığacak şekilde steril bir kürdan kullanarak 15 santimetre Sc eksi urasil ve histidin plaka içine maya Streak. Tabağı bir gün 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her plaka 4 farklı suşları sığar, böylece steril bir kürdan kullanarak 15 santimetre Sc eksi urasil ve histidin plaka içine maya çizgi.
Tabağı bir gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, steril bir kürdan kullanarak maya kazıyın, herhangi bir agar kazımak için emin olun. 500 mikrolitre steril su ile 1,5 mililitrelik bir tüp içine maya ekleyin.
Şimdi 10 ila 15 steril cam boncuk ve maya süspansiyon bir YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya plaka boyunca yayılır sağlamak için bir dakika boyunca her yöne iyice çalkalayın. Plakayı hemen ters çevirin ve boncukların kapağına gitmesi için dokunun.
Boncukları çıkarın ve geri dönüştürün. Tabakları poşetleyin ve 30 santigrat derecede 1 ila 2 gün boyunca agar tarafını kuluçkaya yatırın. Daha sonra, miyon adıma geçin.
Maya DNA yemi ve TF dizi suşlarını çiftleştirmek için TF dizisini robotla birlikte YAPD dikdörtgen plakaya aktarın. Kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma Çok programı seçin.
4 kaynak plakası ve geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneklerini seçin. Her TF dizi plakası 3-4 YAPD plaka transferi için kullanılabilir. Miteleme için kullanılan TF dizi plakaları 2 ila 3 günlük olmalıdır, ancak daha fazla değil, miyelik verimsiz olabilir.
DNA yem sürüncünün çimlerini Zaten TF dizisini içeren YAPD plakalarına aktarmak için kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma Çok programı seçin. Aynı noktadan maya alarak önlemek için yaklaşık 0,6 milimetre yarıçapı ile kaynak rasgele bir ofset kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak için Hedef Mix seçin.
Kaynak olarak DNA yem suşlarını içeren çimleri ve plakaları poşetleri poşetleyip bir gün boyunca 30 derecede agar tarafını kuluçkaya yatırmadan önce benekli TF dizisini içeren YAPD plakalarını hedef olarak kullanın. Diploid maya seçimi için kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını seçin ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma programını seçin.
Kaynakta ve Hedef'te Mix'i seçin. Robotun, plakaları poşetleyip 30 derecede 30 derecede 2-3 gün kuluçkaya yatırmadan önce, yapd plakalarından mated mayayı Sc eksi urasil ve triptofan plakalarına aktarmasını bekleyin. Şimdi, kaynak ve hedef ve 1536 kısa pin pad olarak 1536 agar plakaları seçin.
Çoğaltma programını seçin. Diploid mayayı Sc eksi urasil ve triptofan plakalarından robotu kullanarak plakaiçeren okuma dikdörtgen 3-AT ve X-gal'a aktarın. Plakaları poşetleyin ve 7 güne kadar 30 santigrat derecede agar tarafını kuluçkaya yatırın.
Yüksek arka plan muhabiri aktivitesi ile DNA yem suşları için, gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, gün 4 ve 7 fotoğraf çekmek. TF dizi plakalarını oda sıcaklığında tutun ve yeni bir tarama turu için 7 gün sonra tekrar kopyalayın.
Gelişmiş maya tek melez tahliller kullanılarak elde edilebilir sonuçların türünü göstermek için, CCL15 ve IL17F genlerin organizatör bölgeleri 1086 insan TFs bir dizi karşı taranmış edildi. CCL15 organizatörü, etkileşimlerin, hatta zayıf olanların bile kolayca tespit edilebildiği, otoaktif olmayan DNA yemi örneğidir. IL17F organizatörü bazı etkileşimler tespit edilebilir düzensiz arka plan muhabiri etkinliği ile bir otoaktif DNA yem bir örnektir, birkaç TFs için ise, muhabir etkinliği arka plan daha yüksek olup olmadığı belirsizdir.
Gelişmiş maya tek melez tahliller yaparken oluşabilir çeşitli sorunlar vardır. Bu durumda, koloniler çok küçük ve aktarmak için başarısız oldu. Tipik olarak, TF av kolonilerinin yaklaşık %95'i normal büyüme gösterir.
Bu örnekte, plakanın bir kısmında maya büyümesi yoktur. 1536 pin pad DNA yem süzme çim maya ile temas yapmak için başarısız olursa bu sorun genellikle meting adımda bir başarısızlık ile ilgilidir, TF dizi, ya da miyelik plaka. Bu iki örnekte, hiçbir etkileşim algılanır.
Bu sorun genellikle muhabir genlerde istenmeyen inaktive mutasyonlar ile ilgilidir, özellikle LacZ, ya da çok yüksek otoaktivite maske etkileşimleri. Bu durumda, plaka genellikle bakteriyel kontaminasyon ile ilgili rasgele mavi lekeler sunar. Göz önünde bulundurulması gereken en önemli şey uygun plaka hazırlama.
Sonraki tüm adımlar buna bağlı olduğundan, tüm bileşenlerin eklenmediğinden ve agar yüksekliğinin tek düze olduğundan emin olun. Çoğu reaktif tehlikeli olmasa da, numune lerin ve plakaların kirlenmesini önlemek için her zaman eldiven takmak önemlidir. Herhangi bir DNA bağlayıcı testinde olduğu gibi, muhabir tahlilleri, transkripsiyon faktörü nakavt veya nakavt gibi fonksiyonel tahliller kullanılarak tanımlanan etkileşimleri doğrulamak ve ardından hedef genin ekspresyonunu ölçmek önemlidir.
Bu yöntem, belirli biyolojik süreçlerde yer alan genleri düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin ve kodlamayan hastalıkla ilişkili varyantlara alternatif bağlanma ile transkripsiyon faktörlerinin tanımlanmasına olanak sağlamıştır.
