Name: a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue at JoVE.com

Yazarlar LSU Sağlık Bilimleri proje finanse Merkezi tarafından sağlanan kurumsal destek kabul etmek istiyorum.

Tüm görevler uyum içinde #8759 ve #9189, iletişim kuralları için gerçekleştirilen IRB Office LSUHSC-NO. tarafından onaylanmış Uyum içinde iletişim kuralı # LSUHSC-No IACUC ofiste tarafından onaylanmış 3285 için gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri
1. hücre sayfaları sandviç tohum
Not: Bkz. Şekil 1.
<ol><li>Tohum ADSCs, yaklaşık % 80'i confluency doku kültürü tabak (6 cm veya 6-şey tabak) içinde. 1 geleneksel doku kültürü iyi ve 1 kuyusu doku kültürü poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) kaplı plastik plaka üzerinde karşılık gelen boyut SWAT istenen her şey için tohum. Not: Buna göre bir 6-şey tabak SWAT hücreleri bir 6-şey standart doku kültürü plaka (temel katman) ve bir doku kültürü 6-şey pNIPAAm kaplı levha (üst katman) tohum gerektirir. pNIPAAm kaplamalı plakalar ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvar12,13,14üretilen.</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO2 içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (10 ile desteklenmiş DMEM) ADSCs korumak % FBS ve 1 x penisilin/streptomisin. Medya 2 günde değiştirin.</li>
	<li>Onlar % 100 birleşmesi olmak ve bir çizgili desen (yaklaşık 6-8 gün) almak kadar birleşim hücrelere izin. Not: Bu hücreler batmaz yağ dokusu stabilize etmek için bir tek sağlam hücre sayfası çalışması gerekir. Yeterince konfluent hücreleri WAT ile tohum üzerine parçası.</li>
</ol>2. SWAT malzemeleri hazırlanması
<ol><li>Birkaç 10 mL aliquots, 1 x Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) hazırlamak; yedek birim ile plakalar için istediğiniz sayıyı yetecek hazırlayın.</li>
	<li>
Dalgıç aparatı SWAT tohum için hazırlayın. Yuvarlak bir diske bağlı bir kök oluşur, basit akrilik plastikler kullanarak pistonu oluşturmak. Doku kültürü wells çevresi içinde sığdığından emin olun (çapı: < için 6 cm çanak, 6 cm < 6-şey plaka için 3,5 cm; yaklaşık kitle: 6 cm yemek, bir 6-şey plaka için 5,1 g için 6,7 g).
	<ol>
<li>Yordamı sorunsuz durumda herhangi bir bireysel pistonu ile ilgili bir sorun çalışır emin olmak için ekstra itici hazırlayın.</li>
		<li>Laboratuvar bant dalgıç diskin kenarında etrafında sarın jelatin çözüm kaçağı önlemek için en az 2 x.</li>
		<li>Biyogüvenlik kabini (BSC) % 70 ile sprey alkol. 15 mL konik tüp raf BSC boş, kapağını 15 mL konik tüpler içinde aşağı sprey; tüpler jelatin itici yerleşimini güvenli yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Her bant sarılmış dalgıç iyice %70 alkol ve yer ile raf bir 15 mL konik tüp içine sprey. Metal rondelalar (yaklaşık kitle 6.3 g) sprey ve bir çift çengel forseps ile birlikte rafta koyun; contalar ağırlık-ecek eklemek için itici SWAT tohum sırasında.</li>
		<li>BSC kanat ve UV kurutma ve sterilizasyon kolaylaştırmak ışık. Not: İdeal olarak, bu adım SWAT tohum önce 24 h kuralları. Alternatif olarak, işlem doku toplama/SWAT tohum günde yapmak; Ancak, bu durumda, 15-45 dk UV kurutma/sterilizasyon için izin verir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. jelatin itici hazırlanması — üst hücre sayfalara uygulama
<ol><li>Bir su banyosu ile 75 ° c ısı</li>
	<li>
Jelatin çözüm 1 x HBSS 10 mL hisse senedi için 0.75 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. Bir duman başlık altında çözüm pH dengelemek için 1 M NaOH 100 µL ekleyin.
	<ol>
<li>10 mL hisse senetleri için su banyosu ekleyin ve çözüm toz eriyene kadar şiddetle her 5 dk sallamak. Yakında sıcak su banyosu ekledikten sonra toz jelatin boşanmak hedefliyoruz.</li>
		<li>BSC üfleyici açmak, UV ışığı söndür ve kanat yükseltmek. BSC yüzey sprey ve filtre malzemeleri (5 mL radarı-kilit şırınga ve 0.2 µm şırınga filtreler) hazırlamak. Verimli bir şekilde jelatin itici için uygulamak için yeterli miktarda zorlanma için birden çok filtre hazır olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jelatin çözüm homojen bir tutarlılık ulaştığında, çözüm filtre ve itici için uygulayın. Jelatin şırınga yükleyin. Jelatin şırınga filtresi (~2.5 mL 6-şey tabağı, 6 cm yemek için ~4.5 mL) ile plastik itici uygulayın ve (~ 20 dk) kuvvetlendirmek için izin.</li>
	<li>Jelatin katı olduğunda, itici kenarından teyp paketini açmak. Çengel forseps ile jelatin pistonu dış kenarından kaldırmak (Yani, menisküs yükseltilmiş kenarlarını). Pistonu merkezinde kalan jelatin tamamen düzeyde olduğundan emin olun iletişim ADSC levha ile en üst düzeye çıkarmak için.</li>
	<li>Yavaşça bir kez aşırı jelatin kaldırılır, jelatin itici pNIPAAm kaplı ADSC plakaları için geçerlidir. Metal rondelalar pistonu tartmak için kullanın. Hücre sayfaları itici uygulanırken kesme değil.</li>
	<li>
Oda sıcaklığında 1,5 saat için hücre sayfalardaki itici bırakın. Plakalar/itici ayrılma pNIPAAm kaplı plaka yüzeyinden hücre sayfasının tamamlamak 1,5 saat için bir buzlu su banyosunda kuluçkaya.
	<ol>
<li>Buz banyosunda kuluçka sırasında dikkatli olun; Kuluçka sırasında hücre medya kirletmek buz banyosu izin vermez.</li>
		<li>Kuluçka tamamladıktan sonra alt non-steril su kaldırmak için pNIPAAm kaplı plakaların temiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beyaz yağ doku işleme
<ol><li>İnsan yağ dokusu işletim odasından toplarken, tüm örnekleri buza SWAT seribaşı kadar olan steril bir kap içinde tutun. Steril bakım medya, fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), gibi doku istikrar için yağ dokusu kapsayıcı ekleyin.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge tüpler olmak her şey/yemek için soğuk hücre kültür ortamına seribaşı (6-şey plaka için 100 µL, 6 cm yemek için 200 µL) ekleyin.</li>
	<li>
Yağ dokusu kıyma.
	<ol>
<li>Katı yağ dokusu kesimine yönelik aşağıdaki gibi yapın.<ol>
<li>Yağ dokusu 3 büyük parçalarını yıkayın steril PBS x ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.</li>
			<li>Kaba doku forseps ve steril ustura ile kıyma ve çok damarlara ve fasya mümkün olduğunca kaldırın (daha fazla ayrıntı için konuya bakın).</li>
			<li>İnce kadar kıyılmış doku üzerinde kalın, sıvı tutarlılık alır ustura ile yağlı kıyma. Not: Bu her zaman mümkün olmasa da ideal doku WAT görünür hiçbir bireysel parçaları ile homojen görünür.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lipoaspirate aşağıdaki gibi işlem.<ol>
<li>BSC altında bir ölçek üst üzerinde steril gazlı bez bant ve bu kabı herhangi bir aşırı sıvı toplamak için daha büyük bir ölçek içinde yer.</li>
			<li>25 mL serolojik pipet kullanarak, fazla lipoaspirate gerektiği gibi çizmek ve steril gazlı bez yüzey için geçerlidir. PBS doğrudan bu yüzey için lipoaspirated yağ yıkamayı ve aşırı kan ve lipid kalıntı kaldırmak için geçerlidir.</li>
			<li>Forseps süzülmüş doku kurtarmak, steril bir kıyma yüzeye aktarmak ve lipoaspirate bin dereden su getirmek için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril bir ustura p1000 pipet ipuçları kıyılmış doku aktarmak için distal ucunu kesmek için kullanın; Bu adipocyte lizis yol açabilir kesme stres en aza indirmek olacaktır. Uygun doku tutarlılık ulaşıldığında kıyılmış doku istenen hacmi her 1,5 mL tüp (300-400 µL 6-şey plaka için 500-600 µL 6 cm yemek için) aktarın. Kıyılmış WAT ve tüpler medyada kısaca karıştırın.</li>
	<li>
Taban ADSC plakaları almak ve medya dikkatle boşaltmak/Aspire edin. WAT/medya karışımı her 1,5 mL tüp ile ortamı değiştirin.
	<ol>
<li>Yavaşça jelatin itici pNIPAAm kaplı plakalar kaldır ve WAT karışıma taban ADSC plakaları üzerinde uygulayabilirsiniz. Hücresel dekolmanı onaylamak için bir mikroskop altında pNIPAAm kaplı plakaların monolayer inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yaklaşık olarak 37-40 ° c lisans altında bir ısı blok ayarlayın. Hala yerinde itici ile tabakalar ısı bloğunun yüzeye hareket. 2-3 mL ılık kültür hücreleri kuluçkaya ve jelatin erime kolaylaştırmak için medya ekleyin.</li>
	<li>~ 30 dakika sonra plaka yüzeyinden itici yavaşça çıkarın. Temel doku kültürü tabak kapakları yerine ve bir hücre kültür kuluçka taşıyın. Jelatin tamamen 37 ° C'de sıvılaşmış, Aspire edin ve hücre kültür ortamı değiştirin.</li>
	<li>Fenol red-Alerjik M199 orta 7 µM insülin, 30 µM deksametazon, 1 x 37 ° C ve % 5 CO2 ' de SWAT korumak penisilin/streptomisin. Ortamda yaklaşık 2 mL 6-şey plakaları için ve 3 mL 6 cm yemekler için korumak. Medya 2 günde değiştirin.</li>
</ol>5. SWAT hasat
<ol><li>Collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM Adenozin, PBS) hazırlamak aliquots 15 mL konik tüpler (yaklaşık hacmi 10 mL). Tüpler donma ve onları-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Herhangi bir kültür ortamından hücreleri Aspire edin, 1 x PBS ile yıkayın ve PBS Aspire edin. Collagenase aliquots bir 37 ° C su banyosunda çözdürme tarafından hazırlayın. Not: İdeal olarak, 37 ° C collagenase çözüm ulaşacak; hemen sonra doku ekleyin.</li>
	<li>
Tüm doku SWAT plaka için bireysel aliquots ekleyin. Bir steril hücre kavgacı tip kullanarak SWAT hasat ve collagenase aliquots kesme p1000 pipet ucu ile aktarmak. Doku collagenase solüsyon içeren doğrudan 15 mL konik tüpler için ekleyin.
	<ol>
<li>Alternatif olarak, bir 50 mL konik tüp doku/collagenase karışımı kuluçkaya; artan yüzey alanı daha fazla enzimatik sindirim kolaylaştıracaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek tüpler bir inkübe orbital çalkalayıcı 45 ° açıyla yerleştirin. 30-60 dk 37 ° C'de 200 devirde kuluçkaya.</li>
	<li>Yer 250 µm koleksiyonu için yeni 15 mL konik tüp içine filtre kafes. Filtre sindirilmiş adipocyte solüsyonu dökün. Not: Bu tüm hücreleri fibröz doku filtreleme süre geçmesine izin verir.</li>
	<li>Faz ayrılması için izin vermek için oda sıcaklığında 5 min için oturmak akışı aracılığıyla izin. Not: yağ stromal hücreler (ASCs) alt aşamalar halinde razı olacak iken adiposit çözüm dön yüzer olacak. Santrifüjü 500 x g de 5 min için Ayrıca hücre ayırma veya ADSCs Pelet çevreleyen hasat maksimize edebilirsiniz.</li>
	<li>
Bir kesme p1000 pipet ucu kullanarak, adipositler (collagenase çözüm üst yüzen tabaka) 1.5 mL microcentrifuge toplama tüp aktarın. Yavaş yavaş adiposit toplamak için tüp kenarı boyunca pipet ~ 250 µL teker teker alarak.
	<ol>
<li>Tüpü yavaşça içeriye doğru kalarak hücre kurtarma maksimize etmek için adiposit toplarken döndürün. 1.5 mL microcentrifuge tüp dolu olduğu kadar daha fazla hücre çizim tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşırı sıvı bir iğne (~ 21 G) bağlı bir Ģırınga kullanarak izole adiposit kaldırın. İğneyi yüzen adipocyte tabaka altında daldırın. Kısa bir süre için iğne mili kalarak hücreler çıkarmak için iğne kışkırtmak ve sonra dön yüzer yerinden çıkar adiposit bekleyin.</li>
	<li>Yavaş yavaş adiposit istenmeyen kaldırılmasını önlemek için dikkatli olmak aşırı sıvı çizin. Microcentrifuge tüp mezuniyet sürekli örnek birimleri belirlemek için kullanın (Örneğin,. 0.1 mL her örnek için).</li>
	<li>İzole hücre DNA/RNA ayıklama, Glikoz alımı tahlil, lipoliz tahlil, vb için kullanın
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medical+costs+of+obesity:+An+instrumental+variables+approach.">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li><li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medical+Risks+of+Obesity.">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li><li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro.">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells:+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties.">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li><li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components.">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li><li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients.">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li><li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline.">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li><li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine.">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li><li>. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017)</li><li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwiched+White+Adipose+Tissue:+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue.">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li><li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+'smart'+polymers.">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li><li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+onto+microtextured+poly(dimethylsiloxane)+for+aligned+cell+sheet+engineering.">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li><li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering:+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets.">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).</li><li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion/detachment+control.">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li><li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men.">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li><li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brite/beige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis?.">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı sandviç insan beyaz yağ dokusu ADSCs kullanımına detayları; insan ADSC hücre hatları via köklü protokolleri15ayrılmış olabilir. Ancak, sistem (örneğin sandviç fare WAT hücrelere 3T3L-1 kullanarak) bireyselleştirilmiş araştırma gereksinimleri için adapte edilebilir. Bu işlem birincil insan dokusu işleme içerir. Standart güvenlik önlemlerini istihdam edilmelidir; insan doku (Örneğin, HIV, HepC) BSL-2 patojen işlemek. Sadece doğrudan bir lis...

Yağ dokusu içinde ABD1147 milyar dolar ve 210 milyar dolar arasında doğrudan yıllık tıbbi maliyeti taşır obezite birincil organıdır. Yağ doku birikimi de önde gelen diğer kalp hastalığı, tip II diyabet ve kanser2belirli türleri gibi ölüm nedenleri katkıda bulunur. Vitro kültür modelleri metabolik çalışmaları ve ilaç geliştirme için gerekli olan, ama yağ dokusu geçerli araştırma modelleri büyük eksiklikleri var. Adiposit kırılgan, neşeli ve ölümcül hücre kültür plastikler için uygun olmaz ve bu nedenle geleneksel hücre kültür yöntemleri kullanarak kültürlü cant hücreleri Ayrıştırılan. Cam coverslips, tavan kültür, süspansiyon kültür ve ekstraselüler matrisler3,4,5, kullanımı da dahil olmak üzere bu engelleri aşmak için girişimleri birkaç yöntem kullanılmıştır 1970'lerden beri 6 , 7. ancak, bu yöntemlerin hücre ölümü ve dedifferentiation tarafından işaretlenmiş ve genellikle en fazla bir iki haftalık çalışma dönemi için kullanılır. Ayrıca, bu modeller yapmak değil kalkışmak gibi sağlam ECM korumak değil, etkileşimleri adiposit arasında ve stromal hücreler destek, ne de contractile kuvvetleri hücrelerin birbirlerine içinde içinde vivo sarfetmek yerli adipose microenvironment özetlemek WAT.
Altın standart birincil adipose kültür yöntemi yokluğunda, öncelikle farklılaştırılmış öncesi adiposit üzerinde (diffAds) yağ araştırma güvendi. DiffAds multilocular, yapışık ve metabolik olarak aktif. Buna karşılık, birincil beyaz adiposit üniloküler, nonadherent ve nispeten düşük metabolizma göstermek. Sağlıklı Olgun yağ dokusu fizyolojisi özetlemek için geçerli adipose kültür modellerin büyük olasılıkla doğrudan hedef adiposit FDA onaylı ilaçlar yokluğunda önemli bir faktör başarısızlıktır. Aslında, fizyolojik vitro organ modelleri büyük bir sorun birçok organ ve hastalık olmaması.
Onun pozisyon kağıt, Microphysiological sistemleri (MPS) programın yaratılması duyurmak Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tüm insan ilaç klinik çalışmalar arasında 2013 başarı oranı sadece %18 için faz II ve Evre III için % 50 olduğunu bildirdi Klinik çalışmalarda8. MPS programı doğrudan vitro Monokültür yetersizlik modeli insan fizyolojisi için karşılayacak şekilde tasarlanmıştır. NIH MPSs insan birincil veya kök hücreler organ işleyen özetlemek çok hücreli 3D yapıları içinde oluşan kültür sistemleri olarak tanımlar. Homojen, ölümsüzleştirdi hücre kültürleri indirgemeci modellerinin MPSs doğru bir şekilde hücre-hücre, hücre içi uyuşturucu, ilaç-ilaç ve organ-ilaç etkileşimleri9modeli. Kısa vadeli birincil kültür yöntemlerinden farklı olarak, NIH standartları 4 haftadan kültür8MPS sürdürülebilirlik dikte. NIH'ın RFAs (#RFA-TR-18-001)10, MPS programının daha fazla bilgi bulunabilir.
Basit, bir roman, uyarlanabilir, geliştirdiğimiz ve ucuz yağ MPS olarak adlandırdığı "beyaz yağ dokusu sandviç" (SWAT)11. "Sandviç" kıyılmış birincil yağ dokusu stromal hücreler (ADSCs) (resim 1) yağ kaynaklı levha arasında tarafından adiposit doğal yüzdürme üstesinden gelmek. Elde edilen 3D yapı hücre-hücre iletişim ve doğal yağ microenvironment bir doğal adipocyte destek hücre popülasyonu içeren olgun adiposit çevreleyen tarafından beyannamedir. SWAT 8 haftalık canlılığı, eksojen sinyal, adipokine salgılanması ve engraftment bir hayvan modeli içine yanıt gösteren tarafından doğrulandı.

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Phenol red-free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;m Mesh Filter</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe Filter</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Metal Washers</td><td></td><td></td><td>These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Heated Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubated Orbital Shaker</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>Samples should be pitched at 45&amp;deg; angle to facilitate collagenase digestion</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Set to 37-40 &amp;deg;C and placed under Biosafety Cabinet</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td>Set to ~75 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialized Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell</td><td>Nunc</td><td>174902&amp;nbsp; or 174901</td><td>These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: &amp;lt;6 cm for 6 cm dish, &amp;lt;3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate</td></tr><tr><td>Plastic Plunger Apparatus</td><td></td><td></td><td>These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics</td></tr></tbody></table>

a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) ağırlık ve her gün sağlık düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Yine de, mevcut birincil kültür modelleri, tüm bunların sadakatle adipose microenvironment özetlemek veya WAT canlılık iki hafta ötesinde genişletmek için başarısız olmuş önemli sınırlamalar vardır. Güvenilir birincil kültür manken eksikliği ciddi araştırma WAT metabolizma ve ilaç geliştirme engellemektedir. Bu amaçla NIH'ın standartları için WAT birincil kültür 'SWAT' (gözükeceksin beyaz yağ dokusu) adı verilen yeni bir platform geliştirmek için bir microphysiologic sisteminin kullanılan. Adiposit doğal yüzdürme kıyılmış WAT kümeleri stromal hücreler yağ kaynaklı levha arasında sandviç tarafından üstesinden gelmek. Bu yapıyı kültür uygun üzerinde sekiz hafta WAT örnekleri var. SWAT sağlam ECM, hücre hücre kişiler ve in vivo WAT koşullardan fiziksel baskılara tutar; Ayrıca, SWAT sağlam bir transkripsiyon profil eksojen kimyasal sinyal ve bütün doku fonksiyon duyarlılık korur. SWAT birincil adipose kültür basit, tekrarlanabilir ve etkili bir yöntem temsil eder. Büyük olasılıkla, WAT fizyolojisi, patofizyolojisi, metabolizma ve ilaç geliştirme araştırmaları genel olarak uygun bir platformdur.

SWAT canlılığı başlangıçta bireysel WAT kümeleri seri aydınlık alan görüntüleme tarafından değerlendirildi (n = 12) yaklaşık 7.6 hafta içinde. Kümeleri güvenli monolayer bu süre boyunca üzerinde yerinde kaldı. Hafif morfolojik değişiklikler ile biraz çözgü veya konumları değişen bireysel adiposit gözlendi. Ancak, adipositler de zamanla dedifferentiation eksikliği gösteren multilocular haline, ne de herhangi bir görünür işaretleri hücresel blebbing, l...

Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue at JoVE.com

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

a-microphysiologic-platform-for-human-fat-sandwiched-white-adipose

Research

JoVE Journal

Behavior

6.3K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Sciences Center. Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

Video: A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

Genetik

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Tıp

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Mikrovasküler Fragmanlardan Vaskülarize Termojenik Yağ Dokusunun Üç Boyutlu Kültürü

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Biyomühendislik

Using a Combination of Indirect Calorimetry, Infrared Thermography, and Blood Glucose Levels to Measure Brown Adipose Tissue Thermogenesis in Humans

In mammals, brown adipose tissue (BAT) is activated rapidly in response to cold in order to maintain body temperature. Although BAT has been studied greatly in small animals, it is difficult to measure the activity of BAT in humans. Therefore, little is known about the heat-generating capacity and physiological significance of BAT in humans, including the degree to which components of the diet can activate BAT. This is due to the limitations in the currently most used method to assess the activation of BAT-radiolabeled glucose (fluorodeoxyglucose or 18FDG) measured by positron emission tomography-computerized tomography (PET-CT).
This method is usually performed in fasted subjects, as feeding induces glucose uptake by the muscles, which can mask the glucose uptake into the BAT. This paper describes a detailed protocol for quantifying total-body human energy expenditure and substrate utilization from BAT thermogenesis by combining indirect calorimetry, infrared thermography, and blood glucose monitoring in carbohydrate-loaded adult males. To characterize the physiological significance of BAT, measures of the impact of BAT activity on human health are critical. We demonstrate a protocol to achieve this by combining carbohydrate loading and indirect calorimetry with measurements of supraclavicular changes in temperature. This novel approach will help to understand the physiology and pharmacology of BAT thermogenesis in humans.

Here, we present a protocol to quantify the physiological significance of the impact of brown adipose tissue (BAT) activity on human metabolism. This is achieved by combining carbohydrate loading and indirect calorimetry with measurements of supraclavicular changes in temperature. This novel approach can help develop a pharmacological target for BAT thermogenesis in humans.

İnsanlarda kahverengi yağ dokusu termojenezini ölçmek için dolaylı kalorimetri, kızılötesi termografi ve kan şekeri seviyelerinin bir kombinasyonunu kullanma

In mammals, brown adipose tissue (BAT) is activated rapidly in response to cold in order to maintain body temperature. Although BAT has been studied ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biyoloji

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan SATMVEC'leri: İzolasyon ve Adiposit Çapraz Konuşma Çalışmaları

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Deri Altı Yağ Dokusu Mikrovasküler Yüzey Çalışmaları ile Kardiyometabolik Hastalıklara Bakış

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.