Name: a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue at JoVE.com

著者は、ルイジアナ州立大学健康科学センター、プロジェクトに資金を提供によって提供される制度上のサポートを確認したいと思います。

IRB LSUHSC-NO. オフィスによって承認されたすべてのタスクが #8759 と #9189 プロトコルに準拠しました。すべての動物の仕事を行った #3285 激しい情緒号所 IACUC によって承認プロトコルへの準拠
1. 細胞シートを挟むの播種
注: は、図 1を参照してください。
<ol><li>組織培養プレート (6 cm または 6 ウェル プレート) で約 80% の confluency に種子 ADSCs。SWAT 希望のウェルのシードよく 1 従来の組織文化と組織文化の poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) コーティング プラスチック プレートに対応するサイズの 1 も。 注: したがって、SWAT の 6 ウェル プレートが必要になります 1 つ 6 ウェル標準組織培養プレート (ベースレイヤー) 上のセルと 1 つ 6 ウェル pNIPAAm 被覆組織培養プレート (上層) シードします。pNIPAAm コーティング プレート、市販で購入することができます。 またはラボの12,13,14。</li>
	<li>維持 ADSCs 37 ° C および 5% の CO2のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10 %fbs と 1 ペニシリン/ストレプトマイシン. x2 日ごとにメディアを変更します。</li>
	<li>100% 合流になる紋パターン (約 6-8 日) を取るまでを合体します。 注: これらの細胞は、浮揚性の脂肪組織を安定させるために単一のまま細胞シートとして機能する必要があります。不十分な合流するセルをワットと播種時にフラグメント化します。</li>
</ol>2. SWAT の準備用品します。
<ol><li>いくつかの 10 mL の因数の 1 x ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS); を準備します。余裕量板の所望の数の十分を準備します。</li>
	<li>
SWAT のシードのプランジャー装置を準備します。円形ディスクに接続されている幹から成る単純なのアクリル プラスチックを使用してプランジャーを構築します。組織培養の井戸の円周内に収まることを確認 (直径: < 料理は 6 cm、6 cm < 6 ウェル プレート用 3.5 cm; おおよその質量: 6 cm 皿、6 ウェル プレート用 5.1 g 6.7 g)。
	<ol>
<li>プロシージャを実行できるように円滑にケースで任意の個々 のプランジャーに問題があるに余分なプランジャーを準備します。</li>
		<li>ラボ テープ プランジャー ディスクの縁の周りをラップ、少なくとも 2 倍、ゼラチン液の漏れを防止します。</li>
		<li>スプレー安全キャビネット (BSC) 70 %etoh。空、上限なしの 15 mL の円錐管; と BSC 内 15 mL の円錐管ラック ダウン スプレーします。チューブは、ゼラチン プランジャーの配置をセキュリティで保護するのに役立ちます。</li>
		<li>ラックに 15 mL の円錐管に各テープ巻プランジャーを 70 %etoh と場所で徹底的にスプレーします。金属ワッシャー (おおよその質量 6.3 g) をスプレーし、フック鉗子; のペアと一緒にラックの上に置きますワッシャーは、SWAT がシード処理中にプランジャーに重量を追加します。</li>
		<li>BSC サッシを閉じる、UV 乾燥と殺菌を容易に光を入れます。 注: は理想的には、この手順の SWAT の播種前に 24 h を行います。また、組織コレクション/SWAT 播種; の日にプロセスを実施します。ただし、この場合、UV 乾燥・殺菌のための 15-45 分を許可します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ゼラチン プランジャーの準備-シート上のセルへの適用
<ol><li>75 ° c の水浴を熱します。</li>
	<li>
ゼラチン溶液を準備するには、1 x HBSS の 10 mL のストックにゼラチン パウダーの 0.75 g を追加します。ヒューム フードの下で、溶液の pH のバランスをとる 1 M NaOH の 100 μ L を追加します。
	<ol>
<li>風呂の水に 10 mL の株式を追加、ソリューションに粉末が溶解するまで精力的に 5 分ごとを振る。温水のお風呂に追加した後すぐに粉ゼラチンを溶解する目的。</li>
		<li>BSC 送風機をオンに、UV ライトをオフに、サッシュを上げ。BSC 表面をスプレーし、フィルターの供給 (5 mL ルアーロック注射器や 0.2 μ m シリンジ フィルター) を準備します。複数のフィルターをプランジャーに適用するゼラチンの十分なボリュームを効率的にひずみを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゼラチン溶液が均一な整合性に達したら、ソリューションをフィルター処理し、プランジャーに適用。ゼラチンで注射器をロードします。シリンジ フィルター (~2.5 mL 6 ウェル プレート、6 cm 皿 ~4.5 mL) を通じてプラスチック製プランジャーにゼラチンを適用し、(~ 20 分) を固化することができます。</li>
	<li>ゼラチンがしっかりと、プランジャーの端からテープの包みを開けます。フック鉗子でプランジャーの外側のエッジからゼラチンを削除 (すなわちメニスカスの縁の隆起)。プランジャーの中央に残りのゼラチンが完全にレベルを確認 ADSC シートとの接触を最大化します。</li>
	<li>過剰なゼラチンを取り外したら、優しく pNIPAAm コーティング ADSC プレートにゼラチン プランジャーを適用します。金属の洗濯機を使用して、プランジャーを圧迫します。細胞シートはプランジャーを適用中のせん断しません。</li>
	<li>
室温で 1.5 h の細胞シートにプランジャーを残します。プレート/プランジャー pNIPAAm コーティング プレート表面から細胞シートの解離を完了する 1.5 h の氷水風呂で孵化させなさい。
	<ol>
<li>氷浴; で抱卵中は注意します。氷浴孵卵中における携帯メディアを汚染することはできません。</li>
		<li>インキュベーションを完了すると、非滅菌水を取除く pNIPAAm 被覆板の下部をきれい。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 白色脂肪組織の処理
<ol><li>ひと脂肪組織を手術室から収集する場合は、氷の上、SWAT がシード処理するまで滅菌コンテナーにすべてのサンプルをしてください。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などの無菌維持媒体を組織安定のため脂肪組織コンテナーに追加します。</li>
	<li>冷たいセル培地ごとの井戸/料理する 1.5 mL 遠心チューブにシード (6 ウェル プレート用 100 μ L、200 μ L 6 cm 皿) を追加します。</li>
	<li>
脂肪組織をミンチします。
	<ol>
<li>固体脂肪セグメントの次の手順に従います。<ol>
<li>脂肪 3 の大規模なセグメントを洗って滅菌 PBS で x を外し、可能ように同様に多くの PBS。</li>
			<li>粗く組織鉗子と滅菌のかみそりをミンチし、多くの血管と可能な限り筋膜を削除 (詳細については、の説明を参照)。</li>
			<li>細かくみじん切りにした組織が厚く、液体の一貫性にまで剃刀で脂肪をミンチします。 注: 理想的には組織が表示されますワットのない目に見える個々 のセグメントで均質なこれは常に可能ではありませんが。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lipoaspirate のように処理します。<ol>
<li>BSC、下、ビーカーの上に滅菌ガーゼをテープ、余分な液体を収集する大きなビーカーにこのビーカーを配置します。</li>
			<li>25 mL の血清ピペットを使用して、必要に応じて同様に多くの lipoaspirate を描画し、滅菌ガーゼの面に適用します。Lipoaspirated 脂肪を洗浄し、余分な血液と脂質の残基を削除するこの表面に直接 PBS を適用します。</li>
			<li>排水組織を回復、滅菌肉挽き表面にそれを転送し、lipoaspirate をミンチ鉗子を使用します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>みじん切りにした組織を転送する p1000 ピペット チップの遠位端を切断する滅菌かみそりを使用します。これは、脂肪細胞の換散につながることができるせん断応力を最小限になります。適切な組織の整合性に達する (6 ウェル プレートの 300-400 μ L、6 センチメートルの皿のための 500-600 μ L) 各 1.5 mL チューブにみじん切りにした組織の適切なボリュームを転送します。ひき肉のワットとチューブで簡単にメディアをミックスします。</li>
	<li>
ADSC のベース プレートを取るとメディアのデカント/吸引。メディアを各 1.5 mL チューブからワット/メディアの混合物に置き換えます。
	<ol>
<li>優しく pNIPAAm コーティング プレートからゼラチン プランジャーを削除し、ADSC のベース プレートにワットの混合物に適用します。細胞の剥離を確認する顕微鏡下で pNIPAAm 被覆板の単分子膜を調べます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヒート ブロックを BSC 約 37-40 ° C に設定します。まだ場所でプランジャー、ヒート ブロックの表面にプレートを移動します。温めた培細胞をインキュベートし、ゼラチンの溶解を容易にする 2-3 mL を追加します。</li>
	<li>~ 30 分後に静かにプレート面からプランジャーを取り外します。基本組織培養皿の蓋を交換して、セル文化振興に移動します。ゼラチンは、37 ° C で完全に液化して、一度吸引し、細胞の培養基を置き換えます。</li>
	<li>7 μ M インスリン、30 μ M デキサメタゾン、1 x フェノールレッド フリー M199 培地で 37 ° C、5% CO2で SWAT を維持ペニシリン/ストレプトマイシン。6 ウェル プレートと 6 cm 料理 3 mL 約 2 mL メディアで維持されます。2 日ごとにメディアを変更します。</li>
</ol>5. 収穫を SWAT します。
<ol><li>準備コラゲナーゼ (0.5 mg/mL コラゲナーゼ、500 nM アデノシン、PBS) 15 mL コニカル チューブ (おおよそ量 10 mL) の因数。チューブを固定し、-20 ° C で保存</li>
	<li>細胞から培地を吸引、PBS、1 x を洗浄し、PBS を吸引します。コラゲナーゼ因数を準備するには、それらを 37 ° C の水浴で解凍。 注: 理想的には、コラゲナーゼの解決が 37 ° C に達する;その後すぐに組織を追加します。</li>
	<li>
個々 の因数に SWAT 板からすべての組織を追加します。無菌細胞スクラッパーを使用して SWAT を収穫し、カットオフ p1000 ピペット チップとコラゲナーゼ因数に転送。コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管に直接組織を追加します。
	<ol>
<li>また、50 mL のコニカル チューブ; 組織/コラゲナーゼ混合物をインキュベートします。面積の増大により、更に酵素消化を促進します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>45 ° の角度でインキュベートした軌道シェーカーにサンプル チューブを配置します。30-60 分の 37 ° c、200 rpm で孵化させなさい。</li>
	<li>コレクションの新しい 15 mL コニカル チューブにメッシュ フィルターを 250 μ m の場所です。フィルターを通して消化脂肪溶液を注ぐ。 注: これは線維組織をフィルタ リングを通過するすべてのセルになります。</li>
	<li>相分離を許可する部屋の温度で 5 分間座って通過できます。 注: 脂肪細胞は、脂肪間質細胞 (Asc) 低い段階に解決する間ソリューションの上にフロートします.500 × gで 5 分間遠心分離は、細胞分離やペレットの ADSCs を囲む収穫を最大限ことができます。</li>
	<li>
カットオフ p1000 のピペット チップを使用して、1.5 mL 遠心管を脂肪細胞 (コラゲナーゼの解決の上にフローティング レイヤー) を転送します。脂肪細胞を収集するために管の端に沿ってゆっくりピペット一度に 〜 250 μ L を取るします。
	<ol>
<li>内部に付着した細胞の回復を最大限に脂肪細胞を収集しながらチューブをゆっくりと回転します。1.5 mL 遠心チューブが完全になるまでより多くの細胞を描画してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>注射器の針 (~ 21) に接続されているを使用して孤立した脂肪細胞から余分な液体を削除します。フローティングの脂肪層の下に針を沈めます。任意の細胞を針軸に付着を除去するために簡単に針を扇動し、上に浮かぶに外れ脂肪細胞の待ちます。</li>
	<li>脂肪細胞の意図しない削除を避けるために注意しながら、余分な液体をゆっくりと描画します。一貫してサンプル ボリュームを分離する遠心チューブ卒業式を使用 (など。サンプルごとに 0.1 mL)。</li>
	<li>DNA ・ RNA の抽出、グルコース取り込みアッセイ、脂肪分解法等の隔離されたセルを使用します。
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medical+costs+of+obesity:+An+instrumental+variables+approach.">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li><li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medical+Risks+of+Obesity.">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li><li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro.">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells:+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties.">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li><li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components.">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li><li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients.">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li><li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline.">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li><li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine.">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li><li>. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017)</li><li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwiched+White+Adipose+Tissue:+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue.">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li><li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+'smart'+polymers.">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li><li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+onto+microtextured+poly(dimethylsiloxane)+for+aligned+cell+sheet+engineering.">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li><li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering:+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets.">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).</li><li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion/detachment+control.">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li><li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men.">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li><li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brite/beige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis?.">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルの詳細 ADSCs を使用してサンドイッチひと白色脂肪組織;人間 ADSC 細胞は十分に確立されたプロトコル15を介して分離できます。ただし、システムは個別研究の要件 (サンドイッチ マウス ワット 3T3L 1 セルを使用して) などの適応することができます。主な人体組織にはこのプロセスが含まれます。標準的な安全上の注意を採用する必要があります。BSL 2 病原体 ...

脂肪は肥満は、米国1の $ 1470 億と $ 2100 億との間の直接の年間医療費を運ぶの主な臓器です。脂肪の蓄積は、心臓病、II 型糖尿病、特定の種類のがん2などの死の他の原因にもつながります。文化モデルの in vitro代謝の研究と医薬品開発に不可欠なが、現在の研究モデル脂肪組織の主要な不足があります。脂肪細胞は壊れやすく、軽快な, と終末分化した細胞細胞培養プラスチックを遵守しない、従って従来の細胞培養法を用いた培養することはできません。1970 年代、いくつかの方法がガラス coverslips、天井文化、懸濁培養細胞外マトリックス3,4,5,の使用を含む、これらの障壁を克服する試みで使用されています。6,7します。 ただし、これらのメソッドは、細胞死と脱分化、によってマークされていると、彼らは通常以上の 2 週間の研修期間に使用されます。さらに、これらのモデルがしないでそのまま ECM は保持していません、脂肪細胞と間質の相互作用サポート細胞も収縮力細胞を互いにで生体内で発揮ネイティブ脂肪微小環境を再現ワット。
ゴールド スタンダード脂肪培養法のない場合は、脂肪の研究は分化前脂肪細胞 (diffAds) の主に頼っています。DiffAds は多房性、付着性、および代謝活性です。対照的に、プライマリの白色脂肪細胞は単房性、非粘着性と比較的低代謝を示します。健康な成熟脂肪組織の生理を要約する現在脂肪培養モデルの失敗は、脂肪細胞を直接対象とする FDA 承認薬の不在で主要な要因では可能性が高い。実際には、生理学的体外臓器モデルの欠如は、ほとんどの臓器や疾患にわたって主要な問題です。
Microphysiological システム (MPS) プログラムの創設を発表したそのポジション ペーパー、国立衛生研究所 (NIH) 報告医薬品臨床試験のすべてにわたって 2013年成功率もすぎなかった 18 のフェーズ II の %、第 III 相 50%臨床試験8。MPS プログラムは、直接体外単作のモデル人間の生理にできないことに対処するためです。NIH は、人間のプライマリまたは器官の機能を要約するだろう多細胞の 3 D 構造で幹細胞から成る文化システムとして MPSs を定義します。同質で、不死化細胞培養の還元主義的モデルとは異なり MPSs をオルガン薬物相互作用9薬物、薬セル セル セル正確にモデルする必要があります。短期の初代培養方法とは異なり NIH の基準は文化8で 4 週間にわたって MPS 持続可能性を指示します。NIH の RFAs (#RFA-TR-18-001)10MPS プログラムの詳細を見つけることが。
適応可能な単純な小説を開発した、安価な脂肪の MPS は「白色脂肪組織に挟まれた」と呼ばれる (SWAT)11。私たちは「挟む」みじん切りにした主な脂肪脂肪由来間質細胞 (ADSCs) (図 1) のシートの間で脂肪細胞の自然な浮力を克服します。結果として 3 D 構築サポート セル人口は自然な脂肪細胞と成熟脂肪細胞を囲む細胞間接触とネイティブ脂肪微小環境を繰り返します。SWAT は、8 週間生存率、外因性シグナリング、アデポカイン分泌と動物モデルに生着する応答を実証によって検証されています。

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Phenol red-free&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;m Mesh Filter</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe Filter</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Metal Washers</td><td></td><td></td><td>These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Heated Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubated Orbital Shaker</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>Samples should be pitched at 45&amp;deg; angle to facilitate collagenase digestion</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Set to 37-40 &amp;deg;C and placed under Biosafety Cabinet</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td>Set to ~75 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialized Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell</td><td>Nunc</td><td>174902&amp;nbsp; or 174901</td><td>These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: &amp;lt;6 cm for 6 cm dish, &amp;lt;3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate</td></tr><tr><td>Plastic Plunger Apparatus</td><td></td><td></td><td>These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics</td></tr></tbody></table>

a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue

白色脂肪組織 (WAT) は、重量と毎日の健康の調節に重要な役割を果たしています。 まだ、忠実に脂肪の微小環境を要約またはワット 2 週間を超えて生存を拡張に失敗したすべての利用可能な初代培養モデルに大幅な制限があります。 信頼性の高い培養モデルの欠如は深刻なワット代謝および医薬品開発の研究を妨げます。このため「SWAT」(サンドイッチ白色脂肪組織) と呼ばれるワットの一次文化のための新規プラットフォームを開発する microphysiologic システムの NIH の基準を活用しています。我々 は、みじん切りのワット クラスター脂肪由来間質細胞のシートの間に挟むによって脂肪細胞の自然な浮力を克服します。 このコンス トラクターには、ワットのサンプルは、文化の実行可能な以上 8 週間です。 SWAT そのまま ECM、細胞-細胞間の接触、ワット条件体内の物理的な圧力を維持します。また、SWAT は、堅牢な転写プロファイル、外因性化学シグナリングと全体の組織の機能に対する感度を維持します。SWAT は、脂肪培養の再現性のある、シンプルで効果的なメソッドを表します。 潜在的に、ワット生理学、病態生理、代謝、及び医薬品開発の研究のための広く適用可能なプラットフォームです。

SWAT の生存率が個々 のワット クラスターのシリアル明視野イメージングによる評価された当初 (n = 12) 約 7.6 週間。クラスターは、この時間を通して単分子膜上の場所にセキュリティで保護された残った。わずかな形態学的変化は、少し歪むか、またはシフト ポジションを個々 の脂肪細胞で観察されました。しかし、脂肪細胞も房になって、脱分化の欠如を示すも細?...

Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue at JoVE.com

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス トラクターは、ワットの一次文化のため安定的かつ適応可能なプラットフォームを提供します。

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

a-microphysiologic-platform-for-human-fat-sandwiched-white-adipose

Research

JoVE Journal

Behavior

6.3K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. 白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス トラクターは、ワットの一次文化のため安定的かつ適応可能なプラットフォームを提供します。

ビデオ: A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

マウス脂肪デポのローカライズ、識別、および切除

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

医学

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in humans. Detecting BAT is typically confirmed by the uptake of the injected radioactive tracer 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) into adipose tissue depots, as measured by positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) scans after exposing the subject to cold stimulus. Fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI) has the ability to distinguish BAT without the use of a radioactive tracer. To date, MRI of BAT in adult humans has not been co-registered with cold-activated PET-CT. Therefore, this protocol uses 18F-FDG PET-CT scans to automatically generate a BAT mask, which is then applied to co-registered MRI scans of the same subject. This approach enables measurement of quantitative MRI properties of BAT without manual segmentation. BAT masks are created from two PET-CT scans: after exposure for 2 hr to either thermoneutral (TN) (24 &#176;C) or cold-activated (CA) (17 &#176;C) conditions. The TN and CA PET-CT scans are registered, and the PET standardized uptake and CT Hounsfield values are used to create a mask containing only BAT. CA and TN MRI scans are also acquired on the same subject and registered to the PET-CT scans in order to establish quantitative MRI properties within the automatically defined BAT mask. An advantage of this approach is that the segmentation is completely automated and is based on widely accepted methods for identification of activated BAT (PET-CT). The quantitative MRI properties of BAT established using this protocol can serve as the basis for an MRI-only BAT examination that avoids the radiation associated with PET-CT.

The method presented here uses 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) and fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI), each scanned following 2 hr exposure to thermoneutral (24 &#176;C) and cold conditions (17 &#176;C) in order to map brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects.

人間の褐色脂肪組織デポは自動的に陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法で区分されると磁気共鳴画像登録

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

生物工学

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

生物学

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>ヒトSATMVECs:単離と脂肪細胞クロストーク研究

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:皮下脂肪組織微小血管系研究による心血管代謝疾患への洞察

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた

要約

さらに動画を探す

この動画の章

マウス脂肪デポのローカライズ、識別、および切除

人間の褐色脂肪組織デポは自動的に陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法で区分されると磁気共鳴画像登録

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究