Bu eser mali Araştırma Konseyi Norveç, Oslo Üniversitesi, Anders Jahre Vakfı, Nansen Vakfı ve Henrik Homan anısına mirası tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Noboru Mizushima ATG5 için teşekkür ederim +/ + MEFs ve ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu ATG7 için +/ + MEFs ve ATG7/MEFs ve Dr. Shizuo Akira ATG9A için +/ + MEFs ve ATG9A/MEFs. Biz Frank Sætre teknik yardım ve Dr başına O. Seglen için yapıcı metodolojik tartışmalar için teşekkür ederim.

1. hücre tohum ve tedavi
<ol><li>
Kültür 75 cm2 doku kültürü şişe oksijen kuluçka söz konusu hücre türü için tercih edilen kültür ortamı kullanarak 37 ° C'de % 5 CO2 yapışık hücreleri. Hücreleri bir birleşmesi yakınındaki hücre katmanı ulaşana kadar büyümeye izin. Not etmek Kullanma ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) LNCaP, HEK293, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), BJ, takıma RPMI 1640 orta MCF-7 ve RPE-1 hücreleri.<ol>
<li>3 mL 37 ° C fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), pH 7.4 hücrelerle yıkayın. PBS yerine 3 mL %0.25 (w/v) tripsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) ve hücreleri (2-5 dk) ayırmak kadar oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.</li>
		<li>Müstakil hücreleri ile 7 mL kültür % 10 içeren orta resuspend FBS. 10 µL hücre süspansiyon aliquot ile 10 µL % 0,4 mix Trypan mavi bir microcentrifuge tüp 0,5-20 µL pipet ucu kullanarak. Hemen bir sayım odası slayt doldurmak için aynı pipet ucu kullanın ve bir otomatik hücre Counter hücreleri saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uygun bir hazırlamak seyreltme (aşağıdaki nota bakın) adım 1.1.2 kullanarak hücre süspansiyon kültür orta içeren %10 FBS ve tohum seyreltilmiş hücre süspansiyon 12-iyi doku kültürü plaka (yüzey alanı ~3.8 cm2) kullanarak her şey aseptik 1 mL tekniği. İstenen hücre yoğunluğu ulaşana kadar Örneğin, 60-%90 izdiham hasat, 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir kuluçka büyüme sağlar. Not: Uygun seyreltme istenen hücre confluency hasat verecek hücre süspansiyon hücre tipi hücre tipi yanı sıra süresi ve deneysel tedaviler türüne göre değişiklik gösterir. Böylece, bu ampirik olarak her durumda değerlendirildi gerekir.<ol>
<li>Yapılacak deneyler için hem tedavi ve tohum, tohum 2.5 x 105 LNCaP, HEK293, veya MCF-7 hücreleri, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ veya 1.5 x 10 sonra 2 gün her şey 12-şey plaka5 RPE-1 hücrelerde hasat.</li>
		<li>Gevşek bağlı hücreler için söz konusu hücre tipi için önerilen kaplama türü ile tabakalar kat. LNCaP (ve HEK293) hücreler için poli-D-lisin ile (PDL) kaplamalı plakalar kullanın.</li>
		<li>Bu amaçla, her şey için 2,5 µg/mL steril H2O 500 µL PDL ekleyin ve plakaları, oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için steril bir ortamda kuluçkaya. PDL emme kaldırmak ve her biri de kısaca 1 mL steril H2o yıkayın Not: Genel olarak, herhangi bir deneysel tedaviler adım 1.2.1 yapılıyor. Ancak, RNAi gerçekleştirmek, bu ters bir transfection ile tohum9başlatmak uygun olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Koşul başına yinelenen veya onaylatılacak Wells deneysel tedaviler gerçekleştirmek.
	<ol>
<li>Örneğin, 50 hücrelerle tedavi genellikle autophagic haciz verimli bir uyarıcı olduğunu veya hücreleri 1 mL Earle amino asit içermeyen hücrelerle yıkayarak akut serum ve amino asit açlıktan ölecek konu mTOR inhibitörü Torin1 nM'ın dengeli Çözüm (EBSS) orta tuz ve daha sonra EBSS 1 mL oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 hücrelerinde kuluçkaya</li>
		<li>Sedimentable karaciğer arka plan düzeyleri tanımlamak için tedavi edilmezse Wells bir set bırakın.</li>
		<li>Sonrası haciz inhibitörü bafilomycin A1 (Baf) doyurarak bir miktar eklemek3,13,16,18 yokluğu veya varlığı deneysel tedaviler, hücre önce 3-4 h hasat. Hücreleri oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçkaya<ol>
<li>Kullanım 100 nM LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 ve 1 RPE hücrelerinin, Baf ve 10 nM Baf MEFs için.</li>
			<li>Sadece 3-4 h, (genellikle bu örneği içinde adım 1.3.1 varmış gibi) süresi olan deneysel tedaviler için ekleme Baf aynı anda tedaviler ile. Artık bu deneysel tedaviler için 3-4 h önce hasat beklemek ve bir 500 x 2 µL Baf stok doğrudan orta konsantre ekleyin.</li>
			<li>Hemen Baf eklenmesinden sonra plaka Tantanacı tarafından karıştırın. Bu noktada da macroautophagic haciz inhibitörleri denetimleri, Örneğin, pan-fosfoinositid 3-kinaz (PI3K) inhibitörü 3-Metil adenin (3MA)1910 mM ve seçici PI3K Sınıf III 10 µM eklemek için tavsiye inhibitörü SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre hasat ve Electrodisruption için hazırlık
<ol><li>Tedavi süresi sonunda, orta emme Aspire edin ve her şey için 200 µL hücre dekolmanı çözümü (37 ° C-önceden ısıtılmış) ekleyin. Hücreleri (genellikle yaklaşık 5 dk) ayırmak kadar 37 ° C'de kuluçkaya. Not: %0,25 (w/v) tripsin-EDTA hücre dekolmanı çözümü yerine kullanılabilir ise, ikinci DNaz, viskozite müstakil hücre azaltmaya yardım eder içerir. Orta iyice emişli sürece tripsin-EDTA veya hücre dekolmanı çözüm eklenmesi önce hücreleri yıkamak gerekli değildir.</li>
	<li>Her şey için %2 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) içeren 500 µL oda sıcaklığında (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, eklemek ve pipet ile hiçbir hücre kümeleri görünür hale gelene kadar resuspend. Hemen hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüpler için buza aktarın. Not: Aksi belirtilmedikçe, buz üstünde tüm sonraki adımları uygulayın.</li>
	<li>Tortu hücreleri tarafından Santrifüjü 400 x g 4 ° C'de 5 min için de</li>
	<li>İyice süpernatant (ile emme) hücre topakları kadar mümkün olduğunca kuru bırakmak Aspire edin.</li>
	<li>400 µL % 10 (w/v) sukroz (içinde ultrasaf H2O) her tüp için ekleyin.</li>
</ol>3. plazma zarı Electrodisruption ve Sedimentable ve toplam hücre kesirler ayrılması
<ol><li>Hücre Pelet çevre bir tek hücre süspansiyon elde etmek için bir pipet ile resuspend ve 4 mm Elektroporasyon küvet aktarın. Not: alçalarak ~ 10-15 Pipetting zamanlarda, 100 – 1000 µL pipet ucu kullanarak genellikle yeterlidir.</li>
	<li>Küvet bir üstel çürüme dalga electroporator yerleştirin ve tek elektrik nabzı 800 deşarj V, 25 µF ve 400 Ω; Bu ayarları ~ 8 ms süresi bir darbe üretmek.</li>
	<li>
Hücre disruptate 400 µL buz gibi fosfat tamponlu sükroz solüsyon (100 mM sodyum monofosfattır, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA ve %1.75 sukroz, pH 7.5) içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın ve tarafından kısa bir süre karıştırın Pipetting.
	<ol>
<li>İsteğe bağlı: verimli plazma zarı electrodisruption17doğrulamak için seyreltilmiş hücre disruptate adım 3.3 10 µL ile 10 µL % 0,4 mix Trypan mavi bir 1.5 mL microcentrifuge tüp. Aktarım sayım odasına ve Trypan mavi pozitif hücrelerinin yüzdesi olduğundan emin olun > % 99.<ol>
<li>Oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için sayım odasında örnek bırakın ve Trypan mavi pozitif hücrelerinin yüzdesi kalmıştır doğrulayın > % 99.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İsteğe bağlı: electrodisruption değil çok sert oldu, diğer bir deyişle, bu hücre içi organellerin bozulduğu, değil doğrulamak için adımları 1.1-3.3 yukarıda açıklandığı gibi ama daha büyük bir başlangıç materyali (6-şey plaka bir ~ %80 konfluent hücre katmanı ile bir kuyudan), kullanın ve 150 µL % 10 sükroz adım 2.5 ve 150 µL fosfat tamponlu sükroz çözüm DTT olmadan adım 3.3 kullanın.<ol>
<li>Bir pipet seyreltilmiş hücre disruptate çözümü fosfat tamponlu % 8 (w/v) yoğunluk gradient Orta (Örneğin, %8 Nycodenz, 50 mM sodyum fosfat, % 2.2 sukroz, 1 mM EDTA) 1.2 mL yoğunluğu yastık üstüne dikkatle µL katman 200 için bir 2 mL santrifüje kullanın Tüp. 20.000 x g için bir microcentrifuge 4 ° C'de 45 dk ile yumuşak modu görev (için nazik hızlanma ve yavaşlama), santrifüj kapasitesi ve dikkatle tüpler buza koy.</li>
			<li>60 µL ~ 200 µL üst fraksiyonunun değil herhangi bir yoğunluk gradient orta çözüm kadar almak ve aktarmak için bir taze microcentrifuge tüp emin dikkatli bir şekilde çıkarın. Not: Bu olağanüstü saflık, "hücre sap"21olarak adlandırdığı sitozol içermelidir.</li>
			<li>Kesir saflığı proteinlerin standart teknikleri ve % 4-20 degrade jelleri16kullanarak organel yer alan, Batı leke analizleri gerçekleştirerek Yukarıdaki adımda elde test.</li>
			<li>Örneğin cathepsin B21, sitokrom c ve protein disülfür izomeraz, elektrik çarpması adım 3.2 organellerin, mitokondri veya endoplazmik retikulum, sırasıyla, kesintiye değil olduğunu doğrulamak için ve immunoblot için immunoblotting gerçekleştirmek Karaciğer hücre sap bir sitozolik protein varlığını doğrulamak için.</li>
			<li>Buna paralel olarak, immunoblotting kullanılan antikor değerlendirilir organel bulunan proteinler algılayabilir onaylamak için Toplam hücresini disruptate çözüm16 yapılan proteini özleri üzerinde gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.1-3.3 her örnek için yineleyin.</li>
	<li>% 0.5 BSA ve % 0,01 ile 900 µL buz gibi resuspension arabellek (50 mM sodyum monofosfattır, 1 mM DTT, 1 mM EDTA ve % 5,9 sukroz, pH 7.5) içeren 2 mL microcentrifuge tüpler için her seyreltilmiş hücre disruptate çözümü (3.3 adımda elde edilen) 550 µL kaldırmak Ara-20 ve kısa bir süre ile pipetting karışımı.</li>
	<li>4 ° C'de üretmek için 45 dk için 18.000 x g , santrifüj "posalı karaciğer" içeren unsurlardandır. İyice süpernatant (ile emme) granül mümkün olduğu kadar kuru bırakmak Aspire edin. Örnekleri-80 ° C dondurucuya koyun.</li>
	<li>150 µL (3.3 adımda elde edilen) her seyreltilmiş hücre disruptate çözümü için yeni tüpler aktarmak ve örnekleri-80 ° C dondurucuya yerleştirin. Bu örnekler hücrelerdeki "Karaciğer toplam" düzeylerini belirlemek için kullanın. Not: Bu noktada deneme için istenen sürece duraklatılmış.</li>
</ol>4. karaciğer ayıklama ve karaciğer enzim aktivitesi ölçümü
<ol><li>Tezcan (Kimden adım 3.6) "posalı karaciğer" ve "Karaciğer toplam" örnekleri (adım 3.7) buz üzerinde.</li>
	<li>Buz gibi resuspension arabelleği %1,5 "Toplam karaciğer" Triton X-405 örnekleri (verimli bir son Triton X-405 konsantrasyonu % 1) içeren 300 µL ekleyin. 30 dk soğuk oda (4-8 ° C) bir rulo üzerinde örnekleri döndürün.</li>
	<li>Buz gibi resuspension arabelleği %1 "Posalı karaciğer" Triton X-405 örnekleri ile 750 µL ekleyin ve homojen bir çözüm ulaşılana kadar granül bir pipet ile resuspend.</li>
	<li>Adım 4.2 ve 4.3 18.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekleri undissolved tortu hücresel enkaz için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Soğuk 65 mM imidazole parçalarını mix 4 (pH 7.5)/0.75 mM pyruvate soğuk 65 mM imidazole (pH 7.5) bir parçası ile / 1.8 mM NADH 4 ° C'de en az üç hafta boyunca stabil çalışan bir çözüm elde etmek için</li>
	<li>3 – 30 µL adım 4.4 200 µL ile adım 4.5 çalışma çözüm supernatants, karıştırın.</li>
	<li>Karaciğer enzim aktivitesi Nikotinamid adenin dinükleotit (azaltılmış form) düşüş olarak ölçerek karaciğer miktarını (NADH) absorbans 340 nm bir standart olarak bilinen bir karaciğer konsantrasyon ile karşılaştırıldığında 37 ° C'de. Tepki tamamlama, yani 340 absorbans kadar yaklaştı kadar absorbans ölçümleri gerçekleştirmek nm artık zamanla değişir. Not: Bu karaciğer etkinliği ölçmek için klasik biyokimyasal yöntemdir. Her ne kadar reaksiyon 37 ° C'de geçerli iletişim kuralı gerçekleştirdiği, bu da oda sıcaklığında (20-25 ° C), hangi el ile spectrophotometry yapıyor tavsiye edilir gerçekleştirilebilir. Geçerli iletişim kuralını kullanan otomatikleştirilmiş bir yolla örnekleri çalışan çözüm bir 96-şey plaka ile karışımları ve 340 absorbans ölçer bir robot multianalyzer enstrüman, 37 ° C nm'de her 20 s 3 dk için. Bundan sonra karaciğer, birimleri (U) olarak ifade edilen konsantrasyon enstrüman yazılım hesaplar / L, bilinen karaciğer bir standart ile kalibrasyon ile elde edilen bir standart eğrisine göre zaman içinde absorbans ölçümleri eğimi karşılaştırarak konsantrasyon. Bu yaklaşım tarafından algılamayı doğrusal dizi 30-1500 U/l. Alternatif olarak, çok çeşitli karaciğer ölçmek için piyasada kitleri adlı biri yok. Bazıları başka bir yöntemle UV spectrophotometry daha ve algılama doğrusal diğer aralıklar ile algılama etkinleştirme Renkölçer veya floresan ürünlerin üretimi için enzimatik reaksiyon kaplin temel alır.</li>
</ol>5. karaciğer haciz hesaplanması
<ol><li>Her örnek için dilutions almak ve dikkate örnekleme toplam karaciğer için posalı karaciğer yüzdesini hesaplamak: Posalı karaciğer (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> Not: adımları sırasında 3.1-3.3 yaklaşık 50 µL aktarımı içine ve dışına Elektroporasyon küvet nedeniyle kaybolur. Böylece, toplam 750 µL (yerine 800 µL) sahip olmaktan seyreltilmiş hücre disruptate adım 3.3'in hesaplayın.</li>
	<li>Posalı karaciğer tedavi edilmezse hücrelerden (adım 1.3.2) posalı karaciğer tarafından Baf yüzdesini elde etmek için tedavi zamanla deneysel tedavi hücreleri ve bölmek örnekleri elde yüzdesi örneklerinden elde yüzdesi çıkarma münzevi karaciğer örnekleme döneminden saatte: Münzevi karaciğer (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Özetle, burada açıklanan protokol memeli hücreleri toplu autophagic haciz etkinliğini izlemek için güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem temsil eder. Orijinal yöntemi12,16için karşılaştırıldığında, biz gereksiz adımları bir dizi kaldırıldı, kalan adımları birkaç Basitleştirilmiş ve önemli downscaling tanıttı. Sonuç olarak, protokol maliyet ve zaman-verimliliği ile ilgili olarak, büyük ölçüde artırıldı ve ör...

Autophagy (Yunanca "kendi kendine yemek" için) hücre içi malzeme katmaninin/lizozomal bozulması için evrimsel korunmuş bir süreçtir. Autophagy Maya ve insanlar için önemli olan autophagy ile ilgili ("ATG") genlerin keşfi üzerine ve gerçekleşme bu autophagy insan sağlığı ve hastalıkları (2016 yılında Nobel Tıp veya Fizyoloji için tarafından kabul önemli bir rol oynar Yoshinori Ohsumi), autophagy hızla hücre biyoloji1,2en yoğun okudu işlemlerden biri haline gelmiştir.
(Bundan sonra "autophagy" anılacaktır) Macroautophagy genişleme karakterize ve katlama hücre içi membran cisternae ("phagophores"), etkili bir şekilde çekilmek en kapalı, çift veya çoklu membrane yapılar ("autophagosomes") sitoplazma geri enwrapped malzemesi. Organellerin ile autophagosomes füzyonu, iç autophagosomal membran ve münzevi kargo bozulmuş ve geri dönüşümlü. Autophagosomes rasgele (non-selektif autophagy) ve seçici (seçici autophagy) görgü sitoplazmik malzeme çekilmek olabilir. Toplu autophagy büyük olasılıkla a karıştırmak-in non-selektif ve seçici autophagy temsil eder.
1960 ve 70 's ("morfolojik dönemi" autophagy araştırma) autophagic haciz ultrastructural analizler esas olarak değerlendirildi. 1980 yılında ve başında 1990 ("biyokimyasal dönemi") başına Seglen ve iş arkadaşları — kim okudu birincil fare tetkikine autophagy — kantitatif autophagic haciz aktivitesi3ölçmek için ilk yöntemleri geliştirilmiştir. Bu deneyleri kullanarak, Seglen tanımlanan ve lizozomal autophagic yolu4,5farklı adımları ile karakterize, keşfetti ve amphisome6 (endosome-autophagosome füzyon ürün) icat ve ilk için protein fosforilasyon autophagy yönetmelik7rolünü açıklar. Ancak, ATGs ("moleküler dönemi") 1990'ın keşfi ve bir memeli ATG8 protein ilk karakterizasyonu sonra Mikrotubul ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3) 20008, ATG proteinler için işaretleyici olarak kullanımı autophagic süreci hızla popülerlik kazandı ve büyük ve daha zahmetli biyokimyasal Yöntemler geride. Aslında, son 18 yıldır, Batı leke ve floresan mikroskopi analizleri LC3 farkla en popüler hale gelmiştir (ve birçok sadece durumda) autophagy memeli hücrelerinde okuyan anlamına gelir. Bu yöntemler tarafından gerçekleştirilebilecek göreceli kolaylığı avantajdır. Bunu bir sepeti bileşeni (LC3) yerine gerçek autophagic kargo okuyor dezavantajdır. Devletler ve/veya LC3 akı karşı haciz yolu ile ve akı kargo arasındaki ilişki son derece belirsiz olduğundan oldukça ciddi bir dezavantaj, budur. Aslında, biz toplu kargo akı koşullar altında yüksek düzeyde muhafaza edilmesi göstermiştir hücreleri9konjuge LC3 varlığı rağmen hiçbir LC3 akı olduğu. Ayrıca, bu toplu autophagy verimli LC3 tükenmesi tarafından etkilenmez ve bu nedenle büyük olasılıkla LC3 bağımsız9gösterdi. Bu bulgu da Parkin bağlı mitophagy (mitokondri seçici autophagy) LC310,11 bağımsız olduğunu belirtmek LC3 knock-out çalışmalar10,11tarafından daha sonra doğrulanmıştır .
Özet olarak, açık bir işte deneyleri için kargo tabanlı autophagic etkinliğini izlemek gerekir. En iyi şekilde bu tür deneyleri geniş uygulanabilir, iyi tanımlanmış ve gerçekleştirmek kolay olmalıdır. Son birkaç yıl içinde biz 1980 's12' başına Seglen tarafından geliştirilmiş ve sitozolik karaciğer aktarmak sedimentable, autophagic çarpıtması içeren hücreye ölçme üzerinde dayanır karaciğer haciz tahlil özel bir ilgi almış kesirler. Karaciğer phagophores sitoplazmik kargo enwrap yükleyen kolayca ortak münzevi bir istikrarlı, çözünür sitozolik protein var. Haciz karaciğer, bu nedenle autophagic haciz genel bir ölçüsüdür. Karaciğer lizozomal autophagic yolu12tarafından özel olarak düşer. Böylece, huzurunda lizozomal bozulması inhibitörleri, Örneğin, bafilomycin A1 (Baf)13, deneysel tedavi etkileri doğrudan autophagic haciz etkinliğinde değişiklikleri yansıtmak. Bozulma inhibitörleri yokluğunda, karaciğer tutma ve yıkımı net etkisi ölçülebilir.
Karaciğer haciz tahlil geniş uygulanabilir, çünkü karaciğer son derece ve ubiquitously tüm hücre tiplerinde ifade edilir ve karaciğer düzeyleri doğru bir enzimatik tahlil14,15tarafından sayısal. Ancak, orijinal protokol12 — birincil fare tetkikine kurulan — oldukça zaman alıcı ve malzeme gibi bir ısmarlama elektrik deşarj kapasitör başlayan yüksek bir miktar gerekli. Step-wise bir şekilde yavaş yavaş kolay ve çok yönlü bir yöntem tahlil dönüştürdü. İlk olarak, özgün iletişim kuralını kullanmak üzere memeli hücre hatları16uyarlanmıştır. İkinci olarak, Yöntem önemli ölçüde downscaled3,9yaşındaydım. Üçüncü, zahmetli yoğunluğu hava yastığı da dahil olmak üzere17adım, protokol birkaç adımda elendi. Bu aynı anda bir daha da bir 10 cm tabak örnek16 başına 12-şey plaka (yaklaşık 15-fold daha az başlangıçyani, örnek başına tek bir kuyu kullanmaya kullanarak özgün başlangıç noktasından Yöntem downscaling etkin malzeme)17. Dördüncü olarak, özel yapım elektrik deşarj kapasitör17yerini alabilir bir ticari Elektroporasyon aparatı tespit edilmiştir.
Burada bizim en güncel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında daha önce yayımlanmış17 yönteminin bazı daha fazla basitleştirme içerir karaciğer haciz testin sunulur. Ayrıca, farklı hücre türleri bir dizi elde edilen tipik sonuçlar kümesi gösterilir ve önemlisi, farmakolojik hem de genetik nakavt ve nakavt yaklaşımları kullanarak yöntemi deneysel doğrulamaları birkaç satırlık sağlanmaktadır. İçin genel bir akış düzeni tüm iletişim kuralı bkz: Şekil 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1567">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:159px;">211-2130 and 211-2120</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">12-well plates&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Falcon</td>
			<td style="width:159px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Accumax&#160; cell detachment solution</td>
			<td style="width:221px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:159px;">A7089</td>
			<td>Keep aliquots at -20 &#176;C for years, and in fridge for a few months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:221px;">Enzo</td>
			<td style="width:159px;">BML-CM110-0100</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">BJ cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-2522</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">422361V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher Scientfic</td>
			<td style="width:159px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Cover glass for the Burker counting chamber</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">139-658586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Criterion Tris-HCl Gel, 4&#8211;20%, 26-well, 15 &#181;l, 13.3 x 8.7 cm (W x L)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">3450034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">DTT</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Earle&#39;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">24010-043</td>
			<td>conatains 0.1% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">EDTA</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Electroporation cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:221px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:159px;">1652088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Exponential decay wave electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:159px;">&#160;EMC 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">F7524</td>
			<td style="width:703px;">10% final concentration in RPMI 1640 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1573</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Imidazole</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">56750</td>
			<td>Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td style="width:221px;">NuAire</td>
			<td style="width:159px;">NU-5510E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">LNCaP cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-1740</td>
			<td>use at passage &#60;30</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">3-Methyl Adenine (3MA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">M9281</td>
			<td>Stock 100 mM in RPMI in -20 &#176;C.&#160; Heat stock to 65 &#176;C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:221px;">Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td style="width:159px;">368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function</td>
			<td style="width:221px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>Eppendorf 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MRT67307 hydrochloride (ULKi)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">SML0702</td>
			<td>Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MaxMat Multianalyzer instrument</td>
			<td style="width:221px;">Erba Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">PL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">MCF7 cells</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">NADH</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.24644.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Nycodenz</td>
			<td style="width:221px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:159px;">1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips 3 (0.5-20 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2223</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2207&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipette tips (100-1000&#181;l)</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">732-2355&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer ART Barrier tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pipettes</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:159px;">4701070</td>
			<td>Finnpipette F2 GLP Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P6407-10X5MG</td>
			<td>Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 &#176;C for at least 1 year.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Pyruvate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>1066190050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPE-1 cells (hTERT RPE-1)</td>
			<td style="width:221px;">ATCC</td>
			<td style="width:159px;">CRL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">21875-037</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">SAR-405</td>
			<td style="width:221px;">ApexBio&#160;</td>
			<td style="width:159px;">A8883</td>
			<td style="width:703px;">Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">4390843</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s35504</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18995</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s15964</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s18705</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22362</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s24333</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td>
			<td style="width:221px;">ThermoFisher/Ambion</td>
			<td style="width:159px;">s22387</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 &#8226; 2H2O)&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:159px;">1.06580.1000</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 &#8226; 2H2O )&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Prolabo</td>
			<td style="width:159px;">28014.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Sucrose</td>
			<td style="width:221px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">443816T</td>
			<td>10% final concentration in water; filter through 0.45 &#181;m filter and keep in fridge for months</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">T9033</td>
			<td>Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Triton X-405&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">X405</td>
			<td style="width:703px;">1% final</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td style="width:221px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:159px;">T10282</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)</td>
			<td style="width:221px;">Gibco</td>
			<td style="width:159px;">25200-056</td>
			<td style="width:703px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:487px;">Tween-20</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">P2287</td>
			<td>0.01% final</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lactate dehydrogenase sequestration assay &#8212; a simple and reliable method to determine bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells

Toplu autophagy sitoplazma büyük bölümlerini haciz autophagosomes olarak adlandırdığı çift/multi-membrane yapılar ile karakterizedir. Bu işlem izlemek için basit bir protokol burada açıklanmıştır. Ayrıca, tipik sonuçları ve deneysel doğrulama yönteminin çeşitli kültürlü memeli hücreleri autophagy indükleyici koşullarda temin edilmektedir. Toplu autophagy sırasında sitozol ve böylece aynı zamanda diğer autophagic kargo yanında çözünen sitozolik protein autophagosomes çekilmek. Karaciğer bir istikrarlı ve son derece seçici olarak sigara autophagosomes gizlediği bol, çözünür sitozolik enzim var. Karaciğer haciz miktarını bu nedenle toplu autophagic haciz miktarını yansıtır. Verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde karaciğer haciz hücreleri belirlemek için çalışan sayımız sitozolik karaciğer, ölçüm enzimatik sedimentable faaliyete ardından etkili sedimentable ayıran bir electrodisruption tabanlı ayırma iletişim kuralı Bütün hücre örnekleri karşı kesirler. Autophagic haciz sedimentable karaciğer içinde bu işlem görmüş hücreleri tedavi edilmezse hücrelerdeki oranı çıkarılarak belirlenir. Karaciğer haciz tahlil bu ya haciz probları veya yarı kantitatif proteaz ektopik ifade dahil diğer yöntemleri karşı endojen kargo autophagic haciz nicel bir ölçü verir avantajdır koruma analizleri autophagy işaretleri veya reseptörleri.

İletişim kuralını kullanarak açıklanan burada, birkaç farklı memeli hücre satır, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, dahil olmak üzere toplu autophagic haciz etkinliğinde MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ ve LNCaP hücreleri ölçülür. Haciz (tam, besin açısından zengin ortamda) Bazal koşullar altında değerlendirilen veya hücrelerin içinde akut serum ve amino asitler (bir bona fide autophag...

Watch this Scientific Journal Video about The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay â€” A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells at 

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

the-lactate-dehydrogenase-sequestration-assay-simple-reliable-method

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Görüntüleme.  University of Oslo. Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Video: The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biyoloji

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...