Protokolümüz fare dokularında otofaji ve proteazomal aktivite oranının ölçülmesine olanak sağlar ve bu aktiviteler deki sirkadiyen varyasyonları tespit edecek kadar hassastır. Bu teknik hücre ve dokularda protein katabolizmini değerlendirmek için in vivo olarak kullanılabilir ve gerekli malzemeler nispeten düşük teknolojilidir ve herhangi bir moleküler biyoloji laboratuarı için erişilebilirdir. Prosedürü gösteren Mikhail Ryzhikov, laboratuvarımdan bir doktora sonrası.
Her zaman noktasından on beş dakika önce, leupeptin ve bortezomib stok çözeltilerini oda sıcaklığına ısıtın ve steril PBS'de çözülmüş bortezomib'i seyrelterek mililitre çalışma çözeltisi başına 50 miligram verim verin. Proteaz inhibitörü uygulaması için, intraperitoneally her deneysel hayvan içine leupeptin kilogram başına 40 miligram veya bortezomib kilogram başına 1.6 mikrogram enjekte. Negatif kontrol için farelere 0,5 mililitre PBS enjekte edin.
Her fareyi enjekte edilirken alınan tedavi türüne göre gruplanmış kafeslere geri döndürün ve farelerin standart bir tabloda tedavi edildiği veya manipüle edildiği zamanı kaydedin. Enjeksiyondan iki saat sonra, kurban edilen her deney hayvanından alınan sol karaciğer lobunu, buz üzerinde uygun şekilde etiketlenmiş 15 mililitrelik konik tüplerle yedi mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponuna batırın. Tüm numuneler elde edildiğinde, ilk numuneyi ve homojenizasyon tamponunun tüm hacmini 15 mililitre kapasiteli bir homogenizer'e aktarın ve numuneyi gevşek pistonun 10 darbesi ve 15 kontur ile homojenize edin.
Ortaya çıkan ham homojeni orijinal tüpüne geri verin ve bir sonraki numuneyi az önce gösterildiği gibi homojenize edin. Tüm numuneler homojenleştirildiğinde, homojen çekirdekleri ve enkazları santrifüj le çökün ve her nükleer sonrası süpernatantın en üst dört mililitresini yeni 15 mililitrelik tüplere aktarın. Bu ilk süpernatant fraksiyonun protein konsantrasyonunu standart protokollere göre belirleyin ve gerekli olduğu gibi taze homojenizasyon tamponu ile tüm numunelerin konsantrasyonlarını mililitre başına 2,1 miligrama eşitleyin.
Downstream analizi ve kalite iyileştirme için, eksi 80 santigrat depolama için 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine normalleştirilmiş toplam protein fraksiyonları 500 mikrolitre aliquot. Kalan toplam protein fraksiyonlarının her birinin 1,5 mililitresini tek tek mikrosantrifüj tüplere aktarın ve protein örneklerini santrifüj ile peletleyin. Elde edilen ikinci fraksiyon süpernatların bir mililitresini buz üzerinde yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın ve kalan süpernatanları aspire edin.
3K peletleri yıkama başına 1,5 mililitre taze soğuk homojenizasyon tamponu içinde iki kez yıkayın, ardından 3K peleti 200 mikrolitre SDS-PAGE numune tamponunda yeniden askıya alın ve numuneleri 5 dakika boyunca 95 derecede kaynatın. 20, 000 x g ve dört santigrat derece 20 dakika için ikinci kesir supernatants spin ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine ortaya çıkan üçüncü sitoplazmik fraksiyon supernatants aktarın. SDS-PAGE analizi için, sitoplazmik fraksiyonun 150 mikrolitresini 50 mikrolitre 4x SDS-PAGE örnek tamponu ile birleştirin ve sitoplazmik fraksiyon örneklerini 5 dakika boyunca 95 derecede kaynatın.
20K peletlerden kalan süpernatantı aspire edin ve numuneleri yıkama başına 1,5 mililitre taze soğuk homojenizasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Daha sonra 20K peletini 100 mikrolitre SDS-PAGE örnek arabelleği içinde 95 derecede beş dakika kaynatın. Batı leke analizi için, seri olarak 1x örnek tampon da 1-3 standart eğri proteinleri seyreltmek ve bir 26 iyi 4-12% SDS-PAGE midi jel bir kuyuiçine her standart eğri örnek 10 mikrolitre yük, sonra prestained ticari molekül ağırlığı standart yükleyin.
Otophagic akı ölçmek için, uygun kuyulara her 3K pelet numunesinin 12 mikrolitresini yükleyin. Proteasomal akı ölçmek için, uygun kuyulara her sitoplazmik fraksiyonun 12 mikrolitre yükleyin. Tüm kontrol ve deneysel numuneler yüklendiğinde, proteinleri standart protokollere göre poliviniliden florür membranlarına aktarmadan önce protein örneklerini SDS-PAGE ile ayırın.
Makrootophagic akı analiz etmek için, anti-p62 veya anti-LcB antikor ile 3K pelet örnekleri içeren leke membranlar dört santigrat derece. Proteazomal akı analiz etmek için, anti-lizin 48-Spesifik poli ubikitin antikor ile sitoplazmik fraksiyon örnekleri içeren leke membranlar dört santigrat derece. Daha sonra standart ikincil antikorlar ve görüntüleme cihazları kullanarak batı lekelerini görüntüleyin.
Hem standart eğri hem de deneysel numuneler için ilgi bantları üzerinde densitometrik ölçümler yapmak için uygun bir görüntü analizi yazılımı programı açın ve membranın üst tarafına kadar uzanan leke görüntüsünün altındaki protein monomerini kapsayan uzun bir dikdörtgen çizin. Dikdörtgeni kalan örneklere taşımak için kopyalayıp yapıştırın ve dikdörtgeni örnekler arasında tutarlı tutarak yapıştırın. Nicelliği bir elektronik tabloya kaydedin ve en uygun standart eğri denklemini elde etmek için doğrusal veya polinomlu regresyonda seri olarak seyreltilmiş standart örneği kullanarak elektronik tablo içinde densitometrik standart eğri oluşturun.
Bu denklemi kullanarak, deneysel numuneler içindeki ilgi monomerlerinin miktarını tahmin edin. Akı ölçümleri elde etmek için, her inhibitör işlenmiş numunenin ekstrapolate protein miktarını pbs numunelerinin ortalama değerinden aynı zaman noktasından çıkarın. Daha sonra tek yönlü ANOVA kullanarak protein cirosunun zamansal değişiminin istatistiksel önemini değerlendirin.
Herhangi bir zaman noktasında otofajik akı için birincil okuma, löpeptin tedavi edilen löpeptin ile lizozomla zenginleştirilmiş 3K pelet fraksiyonundaki sahte numuneler arasındaki makrootophaji spesifik belirteçlerin miktarıarasındaki farktır. Genellikle, sonuçlar bağımsız denemeler arasında karşılaştırma kolaylaştırır ortalama normalleştirilir. Proteolitik akı ölçme prosedürümüz, zamana bağlı bir süreç olan otofaji ve proteozom substratların birikimine neden olan löpeptin veya bortezomibin yeteneğine bağlıdır.
Bu teknik, biyolojik ritimlerin karaciğer protein katabolizmini nasıl programdığının araştırılmasına olanak sağlamıştır. Biz hücresel temizlik fonksiyonları üzerinde hastalığın etkilerini araştırmak için önünü açacağını umuyoruz.
