Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık Araştırma tarafından (148808 ve 148792) desteklenmiştir, SE bir kalp ve inme Vakfı, personel Ödülleri İstanbul İl Office, Mart Dimes, kalp araştırma ve Peter Munk Ted Rogers Merkezi tarafından desteklenmiştir Kalp Merkezi. XCC bir CIHR Banting bursu tutar. LA bir kalp ve inme/Richard Lewar öğrencilik Ödülü almıştır.

Etik Beyanı: Bu protokol gözden geçirilmiş ve Üniversitesi Sağlık Ağı (Toronto, Kanada), hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ile uyumlu.
1. arabellek hazırlık
<ol><li>HBB arabellek (Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS), % 2 ısı inaktive Sığır serum, %0,2 sığır serum albümin) hazırlayın. Isı 10 mL Sığır serum ve HBSS 500 ml Sığır serum albümin 1 g inaktive ekleyin. Filtre 0.2 µm filtreden sterilize ve 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>FACS arabellek hazırlamak (fosfat tamponlu tuz (PBS), % 2 ısı inaktive Sığır serum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, pH 8.0)). Sığır serum ve 1 mL 0.5 M EDTA PBS 500 ml 10 mL ısı inaktive ekleyin. Filtre 0.2 µm filtreden sterilize ve 4 ° C'de depolayın Not: Çözümler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.</li>
</ol>2. lökosit dolaşan etiketleme
<ol><li>Aseptik steril fosfat tamponlu tuz (PBS) için 200 µL/fare son enjeksiyon hacmi içinde seyreltilmiş antikor 1 µg ile Anti-fare CD45 enjeksiyon hazırlayın. Birim 28,5 G insülin enjektör yük ve ışıktan uzak tutun. Not: iki farklı fluorochrome etiketli anti-CD45 antikorlar intrakardiyak boyama üzerinden intravasküler (damar yolu yönetim lekeli) ayırt etmek için kullanın (sindirim sonra lekeli; bkz. Adım 4).</li>
	<li>
Fareler (8-12 hafta yaşlı) kırmızı ısı lamba 5 min için kuyruğuna açarak önceden ısıtmak. Dikkat: hayvan aşırı değil. Lamba güvenli bir mesafede tutmak (> 30 cm).<ol>
<li>Hayvan sternal konumda uygun bir aygıt kullanarak engelleyin. Ortaya çıkarmak ve sigara dominant el ile kuyruk kuyruk dizin ve orta parmak ile altyapı ve kuyruk başparmak ve parmak yüzük ile orta-distal bölge immobilizing tarafından stabilize. Dikkat: cilt çıkardı gibi çok fazla güç kuyruk ucunda geçerli değildir. İğne eğimi damar içine yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. Gibi damar ponksiyon kolay iğne her zaman ven paralel tutun. Not: kan şırınga girerek oluşabilir ve iyi bir enjeksiyon işaretidir. İğne 90 ° açı bükme damardan yönetim kolaylaştırabilir. Bükme iğneler bir tehlike temsil edebilir gibi ile emanet ofis onaylayın.</li>
		<li>200 µL intravenöz kuyruk damar içine enjekte. Sıvı kolay akışını ve geçici olarak ven temizleyin. Dikkat: direnç karşılandığında sıvı zorlamayın. Bu iğne saklanmalıdır işaretidir.</li>
		<li>Antikor insanca fare ötenazi önce 5 min için dolaşmaya izin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kalp yalıtma ve sindirim
<ol><li>
CO2 kullanarak fare ötenazi veya diğer kurumsal olarak kabul edilen ötanazi yordam tarafından.
	<ol>
<li>CO2 ötenazi, CO2 odasında fareyi getirin ve dakikada (odası 10 L, 2 L/dk dolgu iseYani, ) Odası hacmi %20 için dolgu oranını ayarlamak. Nefes kesildiği tarih vardır kadar 2 dk ve monitör mouse için çalıştırın.</li>
		<li>CO2 kes ve ek bir 1-2 dk. nefes odası açmadan önce kesildiği tarih vardır sağlamak için fare ve fare fare işlemeye devam etmeden önce öldü onaylamak için bir ayak çimdik gerçekleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sprey % 70 etanol ile fare. Karın, cilt kaldırın ve fare kadar göğüs kemiği kalça düzeyinde ventral orta hat başlangıç boyunca keserek incelemek. Karın açar ve diyafram ortaya çıkarmak için karaciğer gider.</li>
	<li>
Diyafram, sonra kaburga akciğer ve kalp delinme önlemek için dikkatli olmak orta çizgi, her iki tarafta kesti.
	<ol>
<li>Peeling ezbere geri kaburga, sonra Sol kulakçık sağ kulakçık tarafından takip kesim ilk maruz. Dikkat: Bu organlarda bulunan kan yıkama etkinliğini azaltabilir gibi herhangi bir arter veya damarlar yaralandı, sağlanması atria, kesme dikkatli kullanın.</li>
		<li>15-20 mL soğuk PBS 21 G iğne ile donatılmış bir 60 mL şırınga kullanarak ve soğuk PBS kalple sıvı. Yavaşça kalp Bankası forseps ile kavramak ve tepe yakınındaki sol ventrikül iğne yerleştirin. Sağ ventrikül yordamı yineleyin. Uygun bir enjeksiyon beyaz akciğerler ve soluk karaciğer ile sonuçlanır. Not: Perfüzyon ötenazi sonra 5 dakika içinde organ hücreleri dolaşan ile ilgi kontamine kan pıhtılaşması önlemek için yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalp Bankası forseps ile tutun ve hafifçe yukarı çekin kalp, sonra kalp ana pulmoner arterler ve damarlar, aort ve perikardiyal çuval keserek ayırmak.
	<ol>
<li>Kalp kalp başparmak ve işaret parmakları arasında bir temiz havsız kağıt havlu ile nazikçe tutarak temiz ve kulakçık ve ana arterler ve damarlar ve diğer kirletici maddeleri kalıntıları forseps ile çekin. Not: kulakçık tamamı kaldırılır ve bu dokularda kendi yerleşik bağışıklık hücreleri gibi hiçbir diğer dokular, akciğer veya kan damarları, gibi mevcut olun. Akciğer özellikle bu Miyokardiyum içinde daha küçük nüfus maske yapabilirsiniz bir büyük bağışıklık hücre nüfusa sahiptir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalp 50 µL soğuk PBS ile 5 cm plastik çanak yerleştirin.
	<ol>
<li>Görünür hiçbir parça vardır ve pürüzsüz bir tutarlılık vardır kadar eğri diseksiyon makası kullanarak kalp kıyma. Not: kalp doku kaybı en aza indirmek için kesme sırasında yemeğin bulunduğu bir alanda bulundurmaya çalışın.</li>
		<li>2 mL microcentrifuge tüp ile 800 µL soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) içine eğri forseps kullanarak thetrituratedheart doku aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ben, hyaluronidase tip ı-S 60 U/mL ve DNaz 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase ekleyin-ben her örnek için.
	<ol>
<li>45-60 dk 50 RPM sallanan bir shaker olarak 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sindirim, girdap örnekleri kısa bir süre sonra (20 s) ve hemen buz örnekleri 4 ° C'de tutmak için yer
	<ol>
<li>Doku örnekleri homojen ve Pipet Ucu zarar değil kadar 1 mL pipettor kullanarak, örnekleri yukarı ve aşağı pipet. Not: bir kaç kez pipet için tanımlama tekrarlanabilirlik artabilir. Kalpleri en iyi şekilde sindirmek değil eğer Miyokardiyum adet pipet engel. Yavaşça microcentrifuge tüp karşı pipet ucu Bileme daha büyük doku parçaları homojenize yardımcı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
50 mL konik tüp ile 1 mL soğuk HBB yerleştirilen bir 40 µm hücre süzgeç önceden ıslak.
	<ol>
<li>Homojenize örnek için filtre ekleyin ve yavaş yavaş 12-14 mL soğuk HBB dökerek ile yıkayın.</li>
		<li>Filtre uygulanmış örnekleri etiketli 15 mL konik tüp aktarmak ve 4 ° C'de tutmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Santrifüj örnekleri 400 x g 4 ° C'de 5 min için de Süpernatant Aspire edin.
	<ol>
<li>Her örnek için 1 mL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği ekleyerek kırmızı kan hücreleri parçalayıcı. Örnekleri vortexing tarafından resuspend ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Lizis tamamladıktan sonra 5-8 mL, soğuk Hank'in dengeli tuz çözüm (hemoliz durdurmak için HBSS) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri, 400 x gfor 4 ° C'de 5 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Her örnek ve etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp transferi FACS arabelleği 1 mL ekleyin. Not: Protokol burada en fazla 2 saat için 4 ° C'de depolanan örnekleri ile duraklatılmış</li>
</ol>4. akış sitometresi boyama ve analiz
<ol><li>
Santrifüj örnekleri 400 x g 4 ° C'de 5 min için de
	<ol>
<li>Non-spesifik antikor bağlama azaltmak için seyreltik 1: 100 anti-CD16/CD32 ve monosit engelleyici (1:20) (bakınız Tablo reçetesi) muhasebe örnek başına 50 µL FACS için. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Antikor seyreltme (1:250 her antikor için) muhasebe FACS 50 µL örnek başına için hazırlayın. Not: Bir canlılık boya antikor kokteyl ölü hücreleri dışlamak için eklenebilir. Alternatif olarak, küçük boyutlu dışlama akışı analizi tarafından kullanılan (Şekil 1C ve D) olabilir.</li>
		<li>Çamaşır olmadan, 50 µL antikor ana karışımı her örnek ve karışımı ekleyin.</li>
		<li>Örnekleri için karanlıkta 30 dk 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yıkama ve örnekleri, 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek 600 µL FACS eklemek</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve Pelet 300 µL FACS içinde resuspend. Karanlıkta 4 ° C'de örnekleri tutmak. Not: Bazı canlılığı boya, DAPI gibi akış sitometresi çalıştırmadan önce 10 dakika içinde boyama gerektirir.</li>
	<li>Akış Sitometresi tarafından analiz (bkz: Şekil 1 ve 2) sonraki 3 saat içinde. Eğer daha uzun bir süre düşük konsantrasyon paraformaldehyde kullanarak gerekli, kısa vadeli fiksasyon (0.5-%1 PBS) boyama korumak için önerilir. Not: Akış sitometresi akışkanlar tıkanıklığı önlemek için bir 40 µm hücre süzgeç önce başlatmak Akış Sitometresi Analizi yoluyla örnekleri filtre uygulamak için önerilir.</li>
</ol>

<ol><li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+Immunopathology+Research%22%5BJournal%5D)">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814(2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25349429">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24675722 ">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
<li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD103%28%2B%29+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li>
<li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+migration+of+effector+CD8%2B+T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li>
<li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+CD103%2B+dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha%2B+conventional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Miyokardiyal iltihap veya miyokardit, en kalp-damar hastalıkları bir özelliktir. Ancak, Miyokardiyum sigara hastalık durumlarında kendi bağışıklık bileşenlerinde yoksun değildir. Kararlı duruma sırasında birçok bağışıklık hücreleri Miyokardiyum içinde bulunan ve bakım ve koruma önemli rol oynarlar. Bu farklı nüfus hücrelerin karakterizasyonu bu protokol için sunulan bir gibi yöntemleri olmadan mümkün olmazdı.
Miyokardiyum mekanik ve enzimatik sindirim bir arada...

Miyokardiyal stres veya yaralanma, iskemik dahil olmak üzere (iskemi reperfüzyon veya miyokard infarktüsü) farklı formları ve iskemik olmayan (hipertansiyon veya miyokardit), ama aynı zamanda Onarıcı ve koruyucu, inflamatuar hücrelerle istihdamı teşvik patojenik özellikleri. 1891, gibi erken Romberg ilk hücresel infiltratlar tifüs ve Kızıl hastalığı1ile infekte hastaların Miyokardiyum varlığı tarif. Ancak, kardiyak bağışıklık hücreleri detaylı çalışmanın daha gelişmiş immunophenotyping teknikleri geliştirilmesi gerekmektedir. Sonuç olarak, yakın zamanda bağışıklık hücreleri temel bakım rolleri ile farklı bir popülasyon sırasında kararlı duruma Miyokardiyum içinde bulunduğu anlamaya başlamıştır.
Histoloji oldu ve hala, enflamasyon sırasında kalp bağışıklık hücreleri ayırdetmek için en yaygın yöntem. Ancak, Histoloji değerli bir tanı aracı temsil ederken, kullanımı kardiyak bağışıklık hücreleri insan önemli sınırlamaları vardır. Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri toplam hücrelerin çok küçük bir oran temsil ve orantılı olarak çok büyük bir alanda daha fazla veya daha az eşit olarak dağıtılır. Benzer şekilde, kardiyak inflamasyon, viral miyokardit gibi çeşitli formları inflamasyon odak desenleri gösterin. Kalp bağışıklık sisteminin doğru analiz kez yüksek derece histolojik örnekleme, önyargı azaltmak için maliyeti artan gerektiren anlamına gelir. Ayrıca, Histoloji çok sınırlı bir hücre kimliği (Örneğin sayıda parametre) kullanışlı bilgileri sağlar. Akış Sitometresi (yüzey işaretleyicileri, transkripsiyon faktörleri veya salgılanan moleküller gibi) birden çok ifade işaretleri kullanımını gerektiren hücre alt kümeleri artan bir sayı ile immunophenotyping için en güçlü araç olarak kendisini kurmuştur, düşük maliyetli ve yüksek işlem hacmi nedeniyle.
İmmunophenotyping teknikleri çok sayıda hücreleri tek hücre analizi için izin verimli sindirim protokolleri gelişimini yakından bağlıdır. Hücre ekstraksiyon ayrıntılı iletişim kuralları gelişimi kardiyak İmmünoloji çalışmada fırsatları yeni bir pencere açtı. Arada sindirim, akış sitometresi ve transcriptomics yoluyla, makrofajlar ve dendritik hücreleri merkezinde ikamet eden büyük nüfus karakterize2,3olmuştur. Kardiyak bağışıklık hücreleri en bol popülasyon sırasında kararlı duruma vardır CD64+MerTK+ CCR2 veya CD11c2onların ifade üzerinde temel alan makrofajlar, daha da ayrılabilir. CCR2+ ise makrofajlar yetişkin kemik iliği hematopoiesis kaynaklanan çoğu CCR2 MHC-II yüksek veya düşük düzeyde ifade edebilir,- makrofajlar, esas olarak Doğum öncesi kökenlidir. Makrofajlar onarım4 ve enkaz5 kaldırılması sırasında yaralanma veya elektrik bağlantısı6 sabit durumda destekleyen gibi temel fonksiyonları yerine getirir. Enflamasyon sırasında çeşitleri Ly6CMerhaba MHC-IIlo CD64int monosit önemli bir akını oluşur, hangi daha sonra Ly6CMerhaba CCR2 ayırt+ makrofajlar2,7 . Önemli ölçüde daha küçük ancak önemli Vaha'da hücrelerinin sağlıklı bireyler Miyokardiyum içinde ikamet eden dendritik hücreler8,9/ oluşur. Kardiyak geleneksel DCs (KGK) iki ana alt kümeleri son zamanlarda nitelendirmiştir: cDC1 (CD103+ DCs) ve cDC2 (CD11b+ DCs). DCs enfeksiyon8 karşı savunmak için önemli rol oynarlar ama aynı zamanda kendini yaralama sırasında özellikle9miyokard infarktüsü enflamasyon sırasında yükseltebilirsiniz.
Burada, fare Miyokardiyum üzerinden kardiyak immün hücrelerin izolasyonu için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi analiz veya daha fazla akış sitometresi sıralama veya manyetik boncuk zenginleştirme tarafından saf bir tek hücre süspansiyon elde etmek için enzimatik ve mekanik sindirim bir hücre-Süzgeç filtrasyon ile birleştirir. Extravascular miyokard hücrelerinin doğru ölçümler kardiyak perfüzyon kardiyak microvasculature kan olası kirletici kaldırmak için gerektirir. Buna ek olarak, biz daha fazla intravasküler kirleticiler, Galkina ve ark. Protokolü10tabanlı miyokardiyal hücreler ayırt etmek için kullanılan bağışıklık hücrelerinin damar içi etiketleme, isteğe bağlı bir adım mevcut. Son olarak, biz büyük makrofaj ve cDC altgrupları tanımlamak için bir temel Akış Sitometresi Analizi mevcut.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter , 0.2 &amp;micro;m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc insulin syringe</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60 mL syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>from Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hyaluronidase type I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>from bovine pancreas</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>1:40 dilution</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>True-Stain Monocyte Blocker</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Mouse: Batf3-/-</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Bağışıklık sistemini sağlıklı bir kalp, temel bir bileşenidir. Miyokardiyum olduğunu farklı bağışıklık hücre alt kümeleri fonksiyonel bölünebilme kararlı duruma sırasında ve çeşitleri enflamasyon sırasında ile zengin bir nüfusa ev. Yakın zamana kadar kalbinde bağışıklık hücreleri çalışma mikroskobu kullanımını gerekli veya yeterli duyarlılığı sırasında şiddetli inflamasyon sağlanan ama güvenle aciz kalmışlardır kötü gelişmiş sindirim protokollerini tanımlamak küçük — ama anahtar — nüfus hücreleri kararlı duruma sırasında. Burada, bir basit yöntem birleştirerek enzimatik (collagenase, hyaluronidase ve DNaz) ve küçük ayırt etmek için antikorlar fluorescently etiketli intravasküler yönetimi tarafından öncesinde fare kalplerin mekanik sindirim tartışmak ama kaçınılmaz damar içi hücre kirletici. Bu yöntem tarafından incelendi akış sitometresi tanıma, fenotipleme ve miktar veya floresan aktif hücre sıralama veya manyetik boncuk ayrılması için daha fazla saf izole hücrelerin bir süspansiyon oluşturur Transkripsiyon analiz veya vitro çalışmalar. Biz anahtar makrofaj ve dendritik hücre popülasyonlarının kalp ayırt etmek için bir adım adım akış sitometrik analizin bir örnek içerir. Bir orta ölçekli deney (10 kupa) yordamı tamamlandıktan 2 – 3 saat gerektirir.

Bugüne kadar iyi bir yöntem yoktur cardiomyocytes gibi diğer kardiyak hücre bileşenlerinden bağışıklık hücreleri izole etmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, kardiyak tek hücre süspansiyon tarafından Akış Sitometresi Analizi bir tek hücre ve küçük boyutlu dışlama gating (Şekil 1A) ardından bağışıklık hücre popülasyonlarının tanımlamak için CD45 ile önceden geçişi gerektirir. Alternatif olarak, ölü h...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Yalıtım ve kalp Extravascular bağışıklık hücreleri tanımlaması

Bu iletişim kuralı izole, tanımlamak ve kararlı duruma veya enflamasyon sırasında fareler Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri ölçmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyor. Protokol enzimatik ve mekanik sindirim daha fazla akış sitometresi tarafından analiz edilecek bir tek hücre süspansiyon nesil için birleştirir.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.9K Görüntüleme.  University Health Network (UHN). Bu iletişim kuralı izole, tanımlamak ve kararlı duruma veya enflamasyon sırasında fareler Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri ölçmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyor. Protokol enzimatik ve mekanik sindirim daha fazla akış sitometresi tarafından analiz edilecek bir tek hücre süspansiyon nesil için birleştirir.

Video: Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. However, the literature reports contrasting data on the prevalence of myocardial B-cells. B-cells have been reported to be both among the most prevalent immune cells in the rodent heart or to be present, but at a markedly lower prevalence than myeloid cells, or to be quite rare. Similarly, several groups have described that the number of myocardial B-cells increases after acute ischemic myocardial injury, but one group reported no changes in the number of B-cells of the injured myocardium. Implementation of a shared, reproducible method to assess the prevalence of myocardial B-cells is critical to harmonize observations from different research groups and thus promote the advancement of the study of B-cell myocardial interactions. Based on our experience, the seemingly contrasting observations reported in the literature likely stem from the fact that murine myocardial B-cells are mostly intravascular and connected to the microvascular endothelium. Therefore, the number of B-cells recovered from a murine heart is exquisitely sensitive to the perfusion conditions used to clean the organ and to the method of digestion used. Here we report an optimized protocol that accounts for these two critical variables in a specific way. This protocol empowers reproducible, flow cytometry-based analysis of the number of murine myocardial B-cells and allows researchers to distinguish extravascular vs. intravascular myocardial B-cells.

Here we report a protocol for the quantification and differentiation of myocardial B-lymphocytes based on their location in the intravascular or endothelial space using flow cytometry.

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Tıp

Murin Pulmoner Venlerin Miyokard Mimarisinin Ortaya Çıkarılması

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

Yazar Spotlight: Türler Arası Atriyal Fibrilasyon Araştırmaları için Translasyonel Bir Model Geliştirme 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

Yalıtım ve kalp Extravascular bağışıklık hücreleri tanımlaması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması

Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması