Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği ve Çocuk Kardiyomiyopati Vakfı (SDG2462390204001) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL114669) tarafından desteklenmiştir. CM Miyokardit Vakfı, NJ tarafından verilen doktora sonrası araştırma bursu hibe bir alıcı.

Etik Açıklama: Bütün hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kurallarına uygun olarak yapılmıştır ve Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. EAE 1. İndüksiyon <ol><li> Aşama 1.1: EAE neden olmak için, aşağıdaki modifikasyonlar ile 11 &#39;de tarif edildiği gibi peptid / tam Freund adjuvanı (CFA) emülsiyonu hazırlamak. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 1 mg / ml&#39; lik bir konsantrasyonda PLP 139-151 hazırlanması Aşama 1.4:. hayvan başına PLP 139-151, 100 ug içeren CFA emülsiyonun 200 ul kullanımı 1.4.1 Adım: On hayvan bağışıklık 1 PLP 139-151 ml (1 mg / ml 1x karıştırılarak 2 ml emülsiyon hazırlamak . PBS) ve CFA eşit hacmi 1,5 Adım: Her iki kasık bölgesi (~ 75 ul her biri) ve beş ila altı haftalık eski sternal bölgede (~ 50 ul) içinde deri altından bölünmüş dozlarda emülsiyonun 200 ul enjekte female SJL / J fareler. 1.7 ve 1.8 EAE indüksiyonu için geçerli değildir adımları tekrarlayın. </li></ol> EAE Fareler ve beyni arasında Hasat 2.. Klinik Skorlama <ol><li> Klinik bulguların görünümü için hayvanları izlemek, ve aşağıdaki gibi günlük 9 İmmünizasyondan günlük hastalık şiddetini puan: 0 - Sağlıklı; 1 - kuyruk veya arka bacak güçsüzlüğü, gevşek ama ikisini; 2 - kuyruk ve arka bacak güçsüzlüğü gevşek; 3 - arka bacaklarda kısmi felç; 4 - arka bacaklarda tam felç; 5 - can çekişen ya da 12 ölü. </li><li> Onlar CO 2 kullanarak 3 veya 4 bir nörolojik puan ulaştığınızda fareler Euthanize. Fareler euthanize için değil, 6 psi aşan CO2 tankın düzenleyici çevirerek CO2 ilk ötenazi bölmeyi ön girip hayvanlar tam asfiksi elde etmek için yaklaşık olarak 5 dakika boyunca oda içinde durmasını sağlar. % 70 alkol ötenazi hayvanları bekletin. Hemen sonra, bir emici ped üzerindeki hayvanlar koyun ve steril bir çift ileceps ve makas göğüs boşluğu yoluyla keserek kalpleri maruz. Doğru kulakçıkları delinme ve kalplerin sol ventriküller içine soğuk 1x PBS 10 ml enjekte edilerek serpmek. </li><li> Kavisli bir makas kullanarak dairesel bir şekilde kafatası kırpma tarafından kafatası kazı ve dikkatle, forseps ile kafatası kemikleri çevirin. Diseksiyonu künt ve temiz bir neşter, beyincik ayrı beyni kullanarak beyin hasat. Soğuk 1 x PBS içeren bir tüpe yerleştirin, beyni ve işleme kadar buz üzerinde tüpü terk. </li></ol> 3.. MHC Sınıf II (IA ler) / HUA 139-151 Dextramers ile Serebral Bölümlerin in situ boyama <ol><li> PBS% 4 tamponlu düşük erime noktalı agaroz, 50 ° C de ısıtılarak eritilmesi ve kullanılana kadar bir 40 ° C su banyosu içinde bırakın hazırlayın. </li><li> Bir tek derin taban kalıp histoloji kaset beyni yerleştirin buz üzerinde tutulur ve erimiş (40 ° C) agaroz dökün. Hemen yavaşça beyni basınforseps doku batığın ile. Katılaşma işlemi tamamlanana kadar 15-20 dakika boyunca buz üzerinde kaseti bırakın. </li><li> Soğutulmuş 1x PBS ile vibratome banyo doldurun. 0 ile 2 arasında PBS sıcaklığını korumak için buz küpleri ile vibratome çevresinde banyo boşluğu doldurmak ° C. Vibratome içine temiz bir jilet düzeltmek ve 15 ° bıçak açısını ayarlayın. </li><li> Vibratom doku yerleştirme. Gömülü doku her iki aşırı agaroz Trim ve hafifçe beyin ventral yüzeyi maruz kalmaktadır. <ol><li> Süper yapışkan ile vibratome doku bloğu yayma ve enine kesit için yapıştırıcı üzerinde beyin açıktaki ventral yüzeyi yerleştirerek yapıştırılmış yüzey üzerinde agaroz-gömülü doku aktarın. Doku blok üzerinde bir kere ayarlandığında, doku hareket etmeyin. </li><li> Buz üzerinde agaroz-gömülü doku içeren vibratome blok yerleştirin ve tutkal 15 dakika kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Bu arada, doku Cham yerleştirinBir 24-yuvalı plaka içinde çukur başına bir Bers. Soğuk 1x PBS içinde 1 ml doku odaları içeren kuyu doldurun ve buz üzerinde plaka bırakın. <ol><li> Ince naylon süper yapıştırıcı kullanarak 25 ml polipropilen pipet kesme ucuna örgü takarak doku odaları hazırlayın; Pipet çevresinde aşırı örgü kırpma sonra, örgü 1 cm&#39;lik bir uzunluğa pipet kesti. </li></ol></li><li> Doku üst yüzeyinin seviyesine vibratome Alt bıçak; 0.22 mm / sn vibratome hızını ayarlamak ve 200 mikron kalınlığında kesitler yapmak için bir ileri hareketi ile kesit başlar. Zamanda bir 24 oyuklu plakanın kuyu içine yerleştirilen doku bölmelerine bir sulu boya yumuşak bir fırçayla için bir beyin bölümü aktarın. Kesit dokusu bozulmasını önlemek tamamlanana kadar buz üzerinde plaka tutun. Not: ventral yüzeye beyin dorsal üç farklı bölgelerinde (Şekil 2) toplam üç eşli bölümlerde edinmek için aşağıdaki adımları izleyin. Dan bir bölümÜç ayrı bölmelerine yerleştirildi, doku (toplam üç bölüm içinde) her bir çift, spesifik dextramers ile lekeleme için belirlenmiş (IA s / PLP 139-151) ve anti-CD4 edilir. Aynı şekilde, üç ayrı doku odalarına yerleştirilir üç bölümden başka bir dizi kontrol dextramers ile lekeleme için belirlenmiş (IA s / TMEV 70-86) ve anti-CD4. </li><li> Bir bölmeye sahip bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine belirli dextramers ile lekeleme her kuyuda için belirlenmiş bölümler içeren üç bölmeyi doku transfer ki, alofikosiyanin içeren bir kokteylin 300 ul (APC) ile konjüge edilmiş PLP 139-151 dextramers (2.5 ug / ml) ve anti-CD4-fikoeritrin (PE;),% 2 normal keçi serumu çözeltisi (1 x PBS içinde bloke / ml 5 ug) daha ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak. </li><li> Benzer şekilde, her bir bölmeye sahip bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine kontrol dextramers ile lekeleme için belirlenmiş bölümler içeren üç doku bölmeyi aktarmakll ki, APC-konjuge TMEV 70-86 dextramers (2.5 ug / ml) ile bloke etme çözeltisi olarak anti-CD4-PE (5 ug / ml) içeren bir kokteylin 300 ul, daha önce ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak. Not: Massilamany Bakınız ve arkadaşları, 8 dextramers hazırlanması ve dextramers nazik Immudex, Kopenhag, Danimarka firması tarafından sağlanan hazırlamak için dekstran molekülleri için.. </li><li> Kuyu etiketleyin ve alüminyum folyo ile plaka sarın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca yumuşak devir için ayarlanmış bir sallanan platform üzerinde plaka yerleştirilir. </li><li> İnkübasyon süresinden sonra, iyi soğuk 1 x PBS içinde 1 ml ihtiva eden bir taze için doku odaları aktararak, sallanan bir platform üzerinde doku bölümleri yıkama, ve de diğer içine bir içeriğini sürme kaçının. Yıkama başına en az 10 dakika izin veren, üç kez yıkama tekrarlayın. Bu odacığın yanlarına yapışmaya gibi doku kesitleri, kurutuldu kalmadığından emin olun. </li><li> Doku cham aktararak bölümleri Fixhafif bir döndürme ile 2 saat için bir sallanan platform üzerinde süzüldü 4% paraformaldehid, PBS-tampon (pH 7.4) içinde 1 ml içeren 24 oyuklu bir plaka içerisinde yeni bir oyuğuna yle. </li><li> Adım 3.10 tarif edildiği gibi üç kez yıkama tekrarlayın. </li><li> Bir suluboya yumuşak bir fırça kullanarak temiz bir mikroskop lamı üzerinde lekeli ve sabit bölümleri yerleştirin. Bölümüne dokunmadan fazla suyu silin, ve montaj orta kullanarak montaj bölümünü. Mikroskobik bir lamel ile kaplayın ve slaytlar karanlık odada RT O / N kurumaya bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de bir ışık geçirmez slayt saklama kutusunda slaytlar saklayın </li></ol> Hearts EAM ve Koleksiyonu 4. İndüksiyon <ol><li> Referans 11&#39;de anlatıldığı gibi EAM neden. </li><li> CO 2 gazı silindir ile donatılmış temiz odasını kullanarak günlük 21 İmmünizasyondan üzerinde fareler Euthanize, ve% 70 alkol hayvanları ıslatın. Hemen, bir emici ped hayvanlar koyun ve forseps ve bir makas kullanarak kalp maruzgöğüs boşluğu yoluyla keserek s. Doğru kulakçıkları delinme ve kalplerin sol ventriküller içine soğuk 1x PBS 10 ml enjekte edilerek serpmek. Soğuk 1x PBS içeren tüplerde kalpleri ve yeri toplayın. </li></ol> 5.. MHC Sınıf II (IA k) / Myhc 334-352 Dextramers ile Kalp Bölümlerin in situ boyama <ol><li> Hazırlama 4% düşük ısıda eriyen agaroz, 50 ° C&#39;de ısıtılarak eritilir ve 40 dakika içinde bırakın PBS tamponlu &#160; Kullanıma kadar C su banyosu °. </li><li> Buz üzerinde tutulan bir tek derin taban kalıp histoloji kaset olarak, kalbin yerleştirin ve aşama 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi dokular tamamen gömülü olduğu kadar erimiş agaroz 40 ° C dökün. </li><li> Adımı 3.3 izleyin. </li><li> Gömülü doku her iki aşırı agaroz Trim ve hafif kalbin tabanı ortaya. Süper yapıştırıcı ile vibratome doku blok smear ve açıkta kalan yüzeyini koyarak yapıştırılmış yüzey üzerinde agaroz gömülü doku transferitutkal üzerinde kalp. Doku blok üzerinde bir kere ayarlandığında, doku hareket etmeyin. <ol><li> Buz üzerinde agaroz-gömülü doku içeren vibratome blok yerleştirin ve tutkal 15 dakika kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Adımları 3.5 ve 3.6 izleyin. </li><li> , 24 oyuklu plakanın kuyu içine yerleştirilen doku bölmelerine bir sulu boya yumuşak bir fırçayla kalp bölümleri aktarın. Kesit doku bozulmasını önlemek için tamamlanana kadar buz üzerinde plaka tutun. Not:, kalbin tabanına apeks sekiz eşleştirilmiş kesitler (Şekil 2) toplam edinmek için aşağıdaki adımları izleyin. Odasının başına 3 bölüme kadar tahsis, doku odalarına tüm bölümleri yerleştirin. (Toplam sekiz bölümlerde) her çifti gelen bir bölüm özel dextramers (IA k / Myhc 334-352) ve anti-CD4 ile boyanma belirlenmiştir. Aynı şekilde, sekiz bölümden başka bir set kontrol dextramers (IA k / RNaz 43-56) ve anti-CD4 ile boyanma belirlenmiştir. </li><li> Transferiin oyuk başına bir odası olan bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine belirli dextramers ile lekeleme için belirlenmiş bölümler ihtiva eden üç doku haznelerinin, 300 APC-konjuge Myhc 334-352 dextramers (2.5 ug / ml) içeren bir kokteylin ul ve Bloke etme çözeltisi olarak anti-CD4-PE (5 ug / ml), daha önce ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak. <ol><li> Aynı şekilde, oyuk başına bir odası olan bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine kontrol dextramers ile lekeleme için belirlenmiş bölümler içeren üç doku bölmeyi transferi ettiği, 43-56 dextramers (2.5 ug APC-konjuge RNaz içeren bir kokteylin 300 ul Bloke etme çözeltisi / ml) ve anti-CD4-PE (5 ug / ml), daha önce ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak. </li></ol></li><li> Kuyu etiketleyin ve alüminyum folyo ile plaka sarın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca yumuşak devir için ayarlanmış bir sallanan platform üzerinde plaka yerleştirilir. </li><li> Adımları, 3,10-3,11 izleyin </li><li> Tekrar yıkama thrAdım 3.10 tarif edildiği gibi buz. </li><li> Bir suluboya yumuşak bir fırça kullanarak temiz bir mikroskop lamı üzerinde lekeli ve sabit bölümleri (en fazla üç bölüm / slayt) yerleştirin. Bölümleri dokunmadan fazla suyu silin, ve montaj orta kullanarak bölümleri monte edin. Mikroskobik bir lamel ile kaplayın ve slaytlar karanlık odada RT O / N kurumaya bırakın. </li><li> 4 bir ışık geçirmez slayt saklama kutusunda slaytlar saklayın ° C. </li></ol> 6.. Dextramer + Analizi (Beyin ve Kalp Bölümleri ikisi için ortak) Lazer tarama konfokal mikroskop (LSCM) tarafından (dext +) CD4 + T Hücreleri <ol><li> Rutin tarama ve görüntü edinimi için Nikon A1-Eclipse 90i konfokal mikroskop sistemi kullanın. Başlatmak açık Tıklayın, NIS Elements AR yazılımı (sürüm 4.13). <ol><li> &quot;TRITC&quot; ve panelinden &quot;Cy5&#39;in&quot; kanal seçin. TRITC ve Cy5 kanalları sırasıyla uyarma / emisyon dalga boyları, 561,5 nm / 553-618 nm ve varsayılan olarak görünür nm 640,7 nm / 663-738. </li><li> Sırasıyla, TRITC (CD4-PE) ve Cy5 (dextramer-APC) kanalları için pseudocolors &quot;yeşil&quot; ve &quot;kırmızı&quot; atayın. </li><li> Mikroskopik sahnede incelenecek slayt yerleştirin ve 100X büyütme altında manuel olarak odaklayın. 110 &quot;HV&quot; Set ve &quot;0&quot; ofset. &quot;Odak&quot; tıklayın ve lazerler optimize etmek için &quot;gerilim&quot; ayarlayın. </li><li> &quot;Odak&quot; üzerine tıklayın; yukarıdan aşağıya bölümü tarama ve görüntü elde etmek için &#39;Z&#39; seviyesini ayarlamak. &quot;CH serisi&quot; tıklayın ve görüntü sırayla kazanır. Dext tespit + CD4 + T hücreleri, kırmızı (dextramers) ve yeşil (CD4) kanallarının her ikisi de elde edilen sinyallerin eş-lokalizasyonu dayalı olarak sarı noktalı hücreleri görünen. </li></ol></li><li> Dext + CD4 + T hücrelerinin kolay nicel sayımı için Olympus BX60 FV500-konfokal mikroskop kullanın. Öncelikletıklatın açık Fluoview yazılımı (versiyon 4.3). <ol><li> Açılır menüden boyalar &quot;Cy3&quot; ve &quot;Cy5&quot; seçin ve ilgili lazerler yüklemek için &quot;geçerli&quot; tıklayın. Not: Cy3 için uyarma / emisyon dalga boyları (543 nm / &quot;yeşil&quot; yalancı, CD4-PE) ve Cy5 (633 nm / &quot;kırmızı&quot; yalancı, dextramer-APC) kanalları. </li><li> Mikroskopik slayt üzerinde incelenecek slayt yerleştirin, ve düşük büyütme (4X veya 10X) altında elle odaklanır. Cy3 lazer açıkken &quot;Odak&quot; tıklayın ve inflamatuar odak odak. </li><li> 100X büyütme hedefi değiştirin. Açılır menüden için &quot;512/512&quot; dosya boyutunu ayarlayın. &quot;Odak&quot; tıklayın ve &quot;PMT&quot;, &quot;kazanç&quot; için değerleri ayarlayın ve Cy3&#39;e ve Cy5 için ayrı ayrı lazerler optimize parametreler &quot;Offset&quot;. </li><li> &quot;Z sahne&quot; tıklayın ve lazerler hem de iken daha sonra &quot;Odak&quot; tıklayın. Set&quot;yukarı&quot; ve &quot;aşağı&quot; okları tıklayarak &quot;Z sahne&quot; kalınlığı. 2 um &quot;Z&quot; aralığını ayarlayın. </li><li> &quot;Dur&quot; tıklayın ve &quot;Seq123&quot; seçin. Sonra, &quot;XYZ&quot; tıklayın ve inflamatuar odak içinde seçilen alan için &quot;Z&quot; serisi görüntüleri elde başlar. AVI dosyaları olarak &quot;Z seri görüntüler&quot; kaydedin. , Görüntü dosyaları kaydetmek &quot;Z seri görüntü&quot; dan görüntü seçin ve ardından &quot;tiff&quot; formatında kaydetmek için. </li></ol></li><li> Üç bölümden bir set IA s / HUA 139-151 dextramers/anti-CD4 ve IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 gerçekleştirmek için üç bölümden diğer seti ile boyandı serebrumda üç eşli bölümleri inceleyin nicel analizi. <ol><li> Benzer şekilde, hangi, sekiz bölümden bir set IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 ve başka se ile boyandı, kalp için sekiz eşleştirilmiş bölümleri analizRNaz 43-56 dextramers/anti-CD4 ile sekiz bölümden t. </li></ol></li><li> Serebrumda bölüm başına 10 ila 15 inflamatuar odaklar incelemek ve her odak, 15 ila 25 seri görüntüler sırayla bir dizi kazanır. <ol><li> Kalbin tüm sekiz kesimden ve her odak 20 enflamatuvar odakların toplam incelemek sıralı 10-15 seri görüntü kazanır. Aynı odak içinde &#39;Z&#39; serisinin tekrarı önlenir, böylece bir &#39;yatay-dikey up-yatay-dikey&#39; aşağı hareketinde slaytlar tarayarak &#39;Z&#39; seri görüntü alabilir. </li><li> &#39;Z&#39; seri görüntüler yakalandığında, slayt numaralarını, bölümlerin adı ve alınan &#39;Z&#39; seri görüntülerin sayısını belirleyerek dosyaları isim. <ol><li> CD4 + T hücrelerinin toplam sayısı ile ilgili olarak dext + CD4 + T hücreleri saymak &#39;ImageJ&#39; yazılımı kullanın. ImageJ &#39;de&#39; sayaç türü &#39;seçmek, kontrol ve# 8216; tümünü göstermek &#39;ve her hücrenin merkezini tıklayarak saymaya başlar ve farklı sayım devam&#39; yan okları kullanarak Z &#39;seri görüntüler. Tüm CD4 T hücrelerini sayma sonra, sayacın başka türünü seçin ve + T hücreleri CD4 + Dext sayılır. Iki farklı sayaçları ile sayılan hücrelerin toplam sayısını almak için sonuçlar sekmesini tıklatın. </li><li> Toplam sayısını elde etmek için, her üç beyin bölümleri ya da her sekiz kalp bir kesitini temsil eden tüm &#39;Z&#39; seri görüntülerde hücrelerin sayısını ekleyin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MHC+class+II+tetramers+to+investigate+CD4++T+cell+responses:+problems+and+solutions.">Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions.</a> Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).</li><li>Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+difficulties+and+future+promise+of+MHC+multimers+in+autoimmune+exploration.">Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration.</a> Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).</li><li>Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+class+II+tetramers+for+identification+of+CD4++T+cells.">Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells.</a> J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).</li><li>Landais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+design+of+MHC+class+II+tetramers+to+accommodate+fundamental+principles+of+antigen+presentation.">New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation.</a> J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).</li><li>Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II+tetramers.">MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).</li><li>Vollers, S. S., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+major+histocompatibility+complex+tetramer+staining:+progress,+problems,+and+prospects.">Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects.</a> Immunology. 123, 305-313 (2008).</li><li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricks+with+tetramers:+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide-MHC.">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li><li>Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers.">Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).</li><li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextramers:+new+generation+of+fluorescent+MHC+class+I/peptide+multimers+for+visualization+of+antigen-specific+CD8++T+cells.">Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells.</a> J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).</li><li>Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific,+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ.">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS One. 9 (1), (2014).</li><li>Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Assessment+of+Cardiac+Abnormalities+in+Experimental+Autoimmune+Myocarditis+by+Magnetic+Resonance+Microscopy+Imaging+in+the+Mouse.">Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse.</a> J Vis Exp. (88), e51654 (2014).</li><li>Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epitope+from+Acanthamoeba+castellanii+that+cross-react+with+proteolipid+protein+139-151-reactive+T+cells+induces+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL+mice.">An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice.</a> J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).</li><li>Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis-inducing+epitope+of+myosin+binds+constitutively+and+stably+to+I-Ak+on+antigen-presenting+cells+in+the+heart.">Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart.</a> J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).</li><li>Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alpha-myosin+heavy+chains+differ+in+their+induction+of+myocarditis.+Identification+of+pathogenic+epitopes.">Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes.</a> J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).</li><li>Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+detection+of+antigen-specific+CD4++T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state.">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li><li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edildi.

MHC sınıf I tetramerleri farklı olarak, rutin uygulamalar için MHC sınıf II tetramerleri kullanımı özellikle aktivasyon bağımlılık 6,15-17 kısmen nedeniyle düşük-yakınlık oto-reaktif CD4 T hücrelerinin, bir ön-madde frekansları numaralandırmak için, zor olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, bu sorun, PLP&#39;ye 139-151, MOG 35-55 ve Myhc 334 gibi Otoantijenler, bir dizi için antijen-spesifik CD4 T hücreleri algılamak için bize izin &quot;, dextramers&quot; denilen tetramerler ne...

Majör histokompatibilite kompleksinin kullanımı antijene özgü CD4 T hücrelerinin saptanması için (MHC) sınıf II tetramerler bir sorun 1-7 olmuştur. MHC sınıf II tetramerler algılama hassasiyetini artırmak için, araştırma ekibi belirlenen nesil tetramers, &quot;dextramers&quot; 8 yarattı. Dextramers örneğin birkaç peptide gergin, biyotinile edilmiş monomerler, bir MHC molekülüne dekstran 9 bağlı olabilir birden fazla streptavidin-fluorofor kısımları konjüge edildiği dekstran omurgalar içerir. Böylece, birkaç MHC-peptid komplekslerini içeren MHC dextramers büyük agrega çok T hücre reseptörleri (TCRler) ile etkileşime girebilir. Bu grup, son zamanlarda çeşitli self-antijenlerine dextramers üretilir ve dextramers algılama hassasiyeti tetramerleri, yaklaşık 8 den fazla beş kat olduğu gösterilmiştir. Deney Sistemleri deneysel otoimmün ensefalomiyelit içerir (EAE) proteolipid protein (PLP) SJL farelerinde 139-151 ile indüklenen; EAE miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) C57BL / 6 farelerinde 35-55 ile indüklenen; ve deneysel otoimmün miyokardit (EAM), kardiyak miyosin ağır zincir-α (Myhc) A / J farelerinde 334-352 ile neden oldu. Bu çalışma, PLP 139-151 kullanımını gösterir - ve Myhc 334-352 böylece florofor antikorlar kullanılarak gelen sinyalleri yükseltmek için ihtiyacı ortadan kaldırarak, direkt bir boyama protokolü geliştirerek özgüllük ile in situ olarak antijene spesifik CD4 T hücrelerini tespit etmek için bir dextramers Yaygın bir yaklaşım tetramerleri kullanımı ile kullanılabilir. Buna ek olarak, doku değerlendirilmesi kapsamlı bir yöntem de güvenilir bir şekilde yerinde 10 antijene spesifik CD4 T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için tasarlanmış edilmiştir. In situ olarak antijen-spesifik T hücrelerinin aktivasyonunun tespiti seyirci neden olduğu belirli antijenik uyarıcılarla neden olduğu olaylar çizimi izin verir. Benzer şekilde, in situ tekniği de providhedef organ içinde antijen-spesifik T hücresi sızıntılar kinetiğini takip etmek için fırsatlar es.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

Bu raporda, MHC sınıf II ile doğrudan dextramers lekelemesi ile antijen spesifik, oto-reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti tarif edilmektedir. Taze kesilmiş beyin kesitleri EAE farelerden türetilen ve (kontrol) dextramers ve anti-CD4 (özel) veya TMEV 70-86 PLP 139-151 içeren kokteyller ile boyandı. Şekil 1 &#39;de üst paneller Çift pozitif hücreler, sarı çıktı PLP 139-151 dextramers (kırmızı) ve CD4 antikoru (yeşil) ile costained beyin bölümlerinin LSCM analizini g?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers at JoVE.com

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K Görüntüleme.  University of Nebraska, Lincoln.  MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır. 

Video: In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A well-studied function of major histocompatibility complex class I (MHCI) is the presentation of cell-derived peptides to the adaptive immune system, particularly in response to infection. More recently it has been shown that the expression of MHCI molecules on neurons can modulate activity-dependent changes in the synaptic connectivity during normal development and neurologic disorders. The importance of these functions to the brain health supports the need for a sensitive assay that readily detects MHCI expression on neurons. Here we describe a method for primary culture of murine hippocampal neurons and then assessment of MHCI expression by flow cytometric analysis. Murine hippocampus is microdissected from prenatal mouse pups at the embryonic day 18. Tissue is dissociated into a single cell suspension using enzymatic and mechanical techniques, then cultured in a serum-free media that limits growth of non-neuronal cells. After 7 days in vitro, MHCI expression is stimulated by treating cultured cells pharmacologically with beta interferon. MHCI molecules are labeled in situ with a fluorescently tagged antibody, then cells are non-enzymatically dissociated into a single cell suspension. To confirm the neuronal identity, cells are fixed with paraformaldehyde, permeabilized, and labeled with a fluorescently tagged antibody that recognizes neuronal nuclear antigen NeuN. MHCI expression is then quantified on neurons by flow cytometric analysis. Neuronal cultures can easily be manipulated by either genetic modifications or pharmacologic interventions to test specific hypotheses. With slight modifications, these methods can be used to culture other neuronal populations or to assess expression of other proteins of interest.

This protocol describes a method for culturing primary hippocampal neurons from embryonic mouse brain. The expression of major histocompatibility complex class I on the extracellular surface of cultured neurons is then assessed by flow cytometric analysis.

Birincil Murine Hipokampal Nöronlarda Majör Histocompatibility Complex Class I'in Akış Sitometrisi ile İfadesinin Değerlendirilmesi

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &amp;#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cell line&#160;and three-dimensional (3D) cultures of human airway epithelium. The method allows highly specific and sensitive visualization of viral RNA by relying on HCR initiated by probe localization. Split-initiator probes help amplify the signal by fluorescently labeled amplifiers, resulting in negligible background fluorescence in confocal microscopy. Labeling amplifiers with different fluorescent dyes facilitates the simultaneous recognition of various targets. This, in turn, allows the mapping of the infection in tissues to better understand viral pathogenesis and replication at the single-cell level. Coupling this method with immunofluorescence may facilitate better understanding of host-virus interactions, including alternation of the host epigenome and immune response pathways. Owing to sensitive and specific HCR technology, this protocol can also be used as a diagnostic tool. It is also important to remember that the technique may be modified easily to enable detection of any RNA, including non-coding RNAs and RNA viruses that may emerge in the future.

Here, we describe a simple method that combines RNA fluorescence in situ&#160;hybridization (RNA-FISH) with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. This protocol may increase understanding of the molecular characteristics of SARS-CoV-2 RNA-host interactions at a single-cell level.

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" of a T cell needs to be assessed by function, and higher function is associated with more powerful immune protection. T cells that can simultaneously produce two or more cytokines or chemokines at the single-cell level are called polyfunctional T cells (TPFs), which mediate immune responses through a variety of molecular mechanisms to express degranulation markers (CD107a) and secrete interferon (IFN)-&#947;, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, interleukin (IL)-2, or macrophage inflammatory protein (MIP)-1&#945;. There is increasing evidence that TPFs are closely related to the maintenance of long-term immune memory and protection and that their increased proportion is an important marker of protective immunity and is important in the effective control of viral infection and reactivation. This evaluation applies not only to specific immune responses but also to the assessment of cross-reactive immune responses. Here, taking the Japanese encephalitis virus (JEV) as an example, the detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs produced by peripheral blood mononuclear cells of children vaccinated against Japanese encephalitis were tested to provide a reference for similar studies.

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

The present protocol combines ex vivo stimulation and flow cytometry to analyze polyfunctional T cell (TPF)&#160;profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) within Japanese encephalitis virus (JEV)-vaccinated children. The detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs were tested to provide a reference for similar studies.

Japon Ensefalit Aşısı ile Aşılanan Çocuklarda Çok Fonksiyonlu T Hücrelerinin Akım Sitometri Tekniği ile Saptanması

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...