Mikrodiseksiyon ve daha sonra kardiyak yerleşik mikrofajların izolasyonu için, özellikle sinüs ve AV düğümünden floresan aktive edilmiş hücre ayıklaması ile bir protokol tanımladık. Sinüs ve V düğümünün hassas mikrodiseksiyonu, ardından manyetik ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama kombinasyonu ile, yerleşik makrofajları sinüs ve V düğümünden yüksek saflıkta spesifik olarak izole edebiliyoruz. Kardiyak yerleşik makrofajların kalpteki farklı bölgelerden tanımlanması ve izolasyonu, fenotiplerinin ve bölgeye özgü etkilerinin kardiyak elektrofizyoloji üzerindeki etkilerinin daha fazla incelenmesini sağlar.
Kalbi izole ettikten sonra, mikrodiseksiyon prosedürlerini diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk bir kerelik PBS ile bir diseksiyon kabında gerçekleştirin. Kalbin sol-sağ ve anterior-posteriorunu belirlemek için aort, pulmoner arter, koroner sinüs ve sol veya sağ ventrikül gibi kardiyak anatomik işaretleri kullanın. Oryantasyon belirlendikten sonra, arka büyük damarları ortaya çıkarmak için kalbi çanağın altındaki ön kısımla konumlandırın.
Ventriküllerin çoğunu çıkarmak için ventriküller ve atriyum arasındaki oluk boyunca kesin. Atriyal kısmı saklayın. AG serbest duvarının ve LAA'nın kalan kısmından pimler yerleştirerek kalbi diseksiyon kabına sabitleyin.
Kalan RV serbest duvarını triküspid valf ve superior vena kava boyunca yukarı doğru kesin. RA ve RV'yi çevirin ve RA boşluğu aralık bölgesini ve atriyal septumu açığa çıkarmak için RAA'yı sabitleyin. SAN'ın mikrodiseksiyonu için, SAN örneğini elde etmek üzere aralık bölgesini ayırmak için kalbi crista terminalis'e paralel olarak interatriyal septum boyunca kesin.
Numuneyi buz üzerinde boş bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe koyun. AVN'nin mikrodiseksiyonu için, interatriyal septuma bitişik dokudan kalbin kalan kısımlarını ve interventriküler septumu, interatriyal septumun sağ atriyal tarafına bakacak şekilde sabitleyin. Koch üçgeni için endokardiyal yüzeydeki sağ atriyuma bakın, bu da triküspid kapağın septal broşürünün menteşe çizgisi ve arkadan Todaro tendonu ile ön tarafta sınırlanacaktır.
Koroner sinüsün deliği tabanda gözlenir. SAN ve AVN dokusunu neşterle kıyın. Daha sonra her numuneye 500 mikrolitre taze hazırlanmış sindirim tamponu ekleyin ve tüm kıyılmış dokuları mikrosantrifüj tüpünün duvarından yıkayın.
Numunenin sindirilmesine yardımcı olmak için nazikçe pipet alın ve bir vorteks makinesinde dokuyu homojenize edin. Sindirimden sonra, doku süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek taze bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi durdurmak için hücre süzgecini ek beş mililitre hücre sıralama tamponu ile durulayın.
Süper natantı çıkarın. Hücre peletini 90 mikrolitre hücre sıralama tamponu ile yeniden askıya aldıktan sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde hücre süspansiyonuna 10 milyon toplam hücre başına 10 mikrolitre CD45 mikroboncuk ekleyin. Örnekleri iyice karıştırın.
Hücre süspansiyonunun mikroboncuklar ve antikor karışımı ile inkübe edilmesi sırasında, manyetik sütunu uygun bir manyetik ayırıcıya bağlayarak ve ardından manyetik sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirerek manyetik ayırma setini hazırlayın. Kolonun üstüne eklenen 500 mikrolitre hücre sıralama tamponu ile durulayarak ve tamponun geçmesine izin vererek manyetik kolonlar hazırlayın. Hücre ayırma tamponu geçerken hava kabarcıklarından kaçınarak hücre süspansiyonunu hemen kolona uygulayın.
Kolonu 500 mikrolitre hücre sıralama tamponu ile üç kez yıkayın. Sütuna bir mililitre hücre sıralama arabelleği ekleyin. Kolonu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri içeren akışı elde etmek için sütunla birlikte verilen pistonu sıkıca uygulayarak kolonu hemen yıkayın. Lekesiz numuneyi ve kompanzasyon tüplerini uyguladıktan sonra, hem pozitif hem de negatif pikleri eksenin uygun konumuna hizalamak için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Geçit stratejisini, uygulanabilirlik işaretçisi olarak DAPI kullanarak metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın.
İlgilenilen hücre popülasyonunun grafiklerde düzgün bir şekilde gösterildiğini onaylamak için akış sitometrisi grafiklerini kontrol edin. Sıralanmış hücreleri, sonraki deneylerin ihtiyacına göre orta veya tampon halinde toplayın. Doğru bir diseksiyonu doğrulamak için, SAN ve AVN'nin tanımlanması immünofloresan ve Masson'un trikrom boyaması kullanılarak yapıldı.
SAN ve AVN'deki HCN4 pozitif iletim sistemi hücrelerinin immünofloresan boyanması ve Masson'un SAN ve AVN'nin trikrom boyaması burada gösterilmiştir. Yerleşik kardiyak makrofajların hücre sıralaması için geçit stratejisi, y ekseninin ileri saçılma alanındaki çiftlerin x eksenine karşı dışlanmasıyla mononükleer hücrelerin tanımlanmasına yardımcı oldu. Ölü hücreler DAPI tarafından dışlandı.
Canlı hücreler CD45 pozitif lökositler, daha sonra CD11b pozitif miyeloid hücreler için kapatıldı. Kardiyak makrofajlar hem F4/80 hem de CD64 ekspresyonu ile tanımlandı, daha sonra lenfosit antijeni altı ekspresyonu ile tabakalaştırıldı. Taze sıralanmış hücreler brightfield mikroskopisi altında gözlendi.
Florofor PE kanalı altında gözlendiğinde hücreler CD45 için pozitifti. Florofor APC boyutu yedi kanal altında gözlendiğinde, sıralanmış hücrelerin aynı görünümü CD11b pozitif hücreleri gösterdi. Florofor PE boyutu yedi kanal, F4/80 pozitif fenotipini tanımlamak için kullanıldı.
Üçlü pozitif hücreler kardiyak yerleşimci makrofajlar olarak tanımlandı. Altı güne kadar ortamda kültürlenen izole kardiyak makrofajlar beyaz oklarla belirtilirken, siyah oklar ölü hücreleri gösterir. Sıralanmış makrofajlar, yama kelepçesi deneyleri gibi daha ileri fonksiyonel çalışmalar veya RNA dizilimi veya proteomik çalışmalar gibi ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir.
