Bu yöntem, ultrafiltrasyon santrifüj yaklaşımı kullanarak bronkoalveoler lavaj sıvısının hücre dışı veziküllerden elde edilen verim, geri kazanım verimi ve saflığı ile ilgili soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniği doğrudan ultrasantrifüj ve yoğunluk gradyan arıtma tekniğiyle karşılaştırdık. Bu tekniğin en büyük avantajı basit, verimli ve murine bronkoalveoler lavaj sıvısı gibi küçük hacimli numuneler için uygun olmasıdır.
Daha da önemlisi, ultra santrifüj izolasyon yöntemine göre yüksek saflıkta ve önemli ölçüde daha yüksek ölçeklenebilirlik sağlar. Prosedürü gösteren Bay Norman Garrett III, laboratuvarımiçin araştırma görevlisi olacak. Başlamak için, ötanazi edilmiş bir farenin nefes borusuna 22 gauge anjiyokateter takın.
Bir mililitre buz gibi steril DPBS ile bir insülin şırıngası takın ve her iki akciğere de bir mililitre aşıyapın. Bronkoalveolar lavaj sıvısını veya BAL sıvısını almak için şırınga pistonuna yavaşça geri çekilin. Ve BAL sıvısını buz üzerinde konik bir tüpe dağıtın.
Bundan sonra, BAL sıvısını 25 fareden çekin ve iki eşit kümeye bölün. BAL sıvısını 400 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant toplamak ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat g 15, 000 kez G santrifüj.
Sonra supernatant toplamak ve HEMEN EV izolasyon adımları devam edin. İlk olarak, 0,2 mikrometre steril şırınga filtresi ile süper natant filtre. Bundan sonra, steril DPBS ile santrifüj filtre ünitesini 10 dakika dengeleyin.
Sonra santrifüj ünitesini 15,000 kez G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Filtreyi 15 mililitre BAL sıvısı ile doldurun. Ve 3,000 G'de santrifüj edin, 4 santigrat derecede 30 dakika.
Bundan sonra, tekrar tekrar borular yavaşça steril DPBS 14 mililitre ile retentate yıkayın. DPBS kaldırmak ve retentate konsantre 30 dakika boyunca dört santigrat derece de filtre ünitesi santrifüj. KONSANTRE BAL sıvısı ev's elde toplamak için, filtre ünitesinin altına bir pipetter takın ve yan süpürme hareketi yan kullanarak örnek çekin.
Sonra BAL sıvısı EV's türetilmiş aliquot ve eksi 80 santigrat derece onları saklayın. Alternatif olarak, bir ultracentrifuge tüp önceki edinilen supernatant aktararak başlayın. Ve 10,000 G'de santrifüj edin, 30 dakika 4 santigrat derecede.
Sonra supernatant ve santrifüj toplamak. Supernatant atın ve DPBS 200 mikrolitre EV pelet yeniden askıya. Bundan sonra, % 50 iodixanol çalışma çözeltisi 300 mikrolitre ile EV süspansiyon karıştırın.
Ve 15 mililitrelik ultracentrifuge tüpüne aktarın. Daha sonra bir yüzdürücü yoğunluk gradyanı oluşturmak için metin protokolüne göre arabellek çözümü ekleyin ve üç saat 50 dakika boyunca 100, 000 G'de santrifüj. %15 ve %25 iyodixanol fraksiyonlarını toplayın ve hacmi 15 mililitreye kadar çıkarmak için DPBS'de seyreltin.
Kesirleri yeni bir ultrasantrifüj tüpe ve santrifüje 100,000 G'de 4 santigrat derecede 60 dakika aktarın. Supernatant atın ve steril DPBS 50 mikrolitre EV pelet yeniden askıya. Nano parçacık izleme analizine başlamak için, EV örneğini bir mililitre DPBS cinsinden seyreltin.
Ve örneği insülin şırıngasına yükleyin. Bundan sonra, şırınga pompasına takın ve parçacık numaralarını ve boyutunu ölçün. Kamera düzeyini 14'e, algılama eşiğini ise bire ayarlayın.
Daha sonra, kolorimetrik algılama yoluyla EV örneğindeki protein miktarını ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Her numuneden eşit miktarda EV proteinini bir blotting yükleme tamponu ve DTT ile çözün. Sonra örnekleri 70 derecede 10 dakika ısıtın.
Örnekleri Bis-Tris Plus akrilamid jeline yükleyin ve elektroforezi 35 dakika çalıştırın. Daha sonra proteinleri kuru transfer yöntemi ile nitroselüloz membrana aktarın. Bundan sonra, nazik sallanan ile 60 dakika boyunca yüzde beş yağsız süt ile membran blok.
Membranı bir ev yüzey protein idracına bir antikorla dört derece santigrat derecede inkübe edin ve bir gecede hafif çesitli sallayarak. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca HRP bağlantı antikor ile membran kuluçka ile membran geliştirin. TBST tamponu ile membranı 10 dakika yıkayın.
Son olarak, görüntüleme ye geçmeden önce kemilüminesan HRP antikor reaktifi ile membran geliştirmek. Akış sitometrisine başlamak için, 49 mikrolitre PEB boyama tamponunda EV's elde edilen BAL sıvısını seyreltin. Daha sonra numunelerin her birine üç er antikor ekleyin, numuneleri karanlıkta 60 dakika boyunca sallayarak dört santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce.
Son olarak, membran filtre peb boyama tampon 40 mikrolitre ile örnekleri seyreltmek ve akış sitometri analizi gerçekleştirmek. Bu protokolde, EV's bir UFC ve UC-DGC yöntemleri kullanılarak fare BAL sıvı izole edildi. BAL sıvısı, UFC yöntemi ile izole edilen normal farelerden elde edilen EV's, UC-DGC-EV'e göre daha küçük boyutlarda ve daha düzgün boyut dağılımını göstermiştir.
UFC tekniği de UC-DGC tekniği ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek toplam parçacık sayımları vardı. TOPLAM protein kurtarma UFC-EV miligram ölçülen de UC-DGC-EV daha yüksek, UFC tekniği daha fazla zaman ve çaba verimli olduğunu gösteren oldu. Son olarak, BAL sıvısı ev türetilmiş de daha fazla akış sitometri ile karakterize edildi.
UFC-EV ve UC-DGC-EV hem CD63, CD9 ve CD81 ifade. Bu prosedürü çalışırken, DPBS ile ultrafiltrasyon ünitesi membran rehydrate hatırlamak önemlidir. Membran sulu olduktan sonra, ünite nin kullanılana kadar her zaman ıslak tutulması gerekir.
Filtre ünitesinden hücre dışı vezikül retentat almak zor olabilir. Pipet ucunun, EV'lerin çoğunu filtre ünitesinden kurtarmak için yan yana süpürüldük olduğundan emin olun. Bu teknik, gelişiminden sonra, küçük hayvanlarda hem normal hem de patolojik koşullarda elde edilen bronkoalveoler lavajın biyolojik fonksiyonlarını araştırmak için hücre dışı vezikül izolasyonu alanında araştırmacıların önünü açmıştır.
