Bu yöntem bize yerel doku mikroçevresini temsil eden vezikülkaynağı sağlayarak, in vivo hücre dışı veziküllerin rolü ile ilgili önemli soruları ele almamıza yardımcı olabilir. Doku ortamında ki ekstrasellüler veziküllerin çalışmaları, ekstrasellüler veziküllerin fizyolojik rollerini ve bunların in vivo patofizyolojik süreçlerdeki değişimlerini daha iyi anlamamızı sağlayabilir. Portal ven kanülasyonunun görsel bir gösterimi, damarın küçük boyutu manipüle etmeyi zorlaştırması nedeniyle yararlıdır.
Doktor Kaori Ishiguro ile prosedürü gösteren Irene Yan, benim laboratuvar bir araştırma teknoloji uzmanı olacaktır. İşleme başlamadan önce, anestezili farenin uzuvlarını sabitle ve kanatlı kan toplamanın 23 gauge iğnesini şırınga pompası boruparçasının serbest ucuna bağlayın. Farenin karın derisini %70 etanol ve alkol yastığı ile temizleyin ve fareyi göğüs ön kısmından pelvik kemiğe kadar açmak için makas kullanın, iç organlara zarar vermemeye özen gösterdi.
Portal ven ve inferior vena kava maruz bırakmak ve portal ven altında bir iplik yerleştirmek için kavisli forceps kullanmak için yavaşça karın boşluğunun sağ tarafına bağırsakları taşımak için bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Kanülasyondan sonra cinching'e hazırlanmak için dikişe gevşek bir düğüm bağlayın ve kanülü 40 santigrat derece HBSS ile doldurun, ta ki çözelti kanül iğne ucuna ulaşana kadar. Kanülleri bağın 5 ila 10 milimetre altındaportal damara yerleştirin ve kanüle sütüyle sabitleyin.
Dakikada bir ila iki mililitre akış hızında infüzyon başlatın. Eğer kanül doğru yerleştirilirse, karaciğer beyazletmeye başlar. Inferior vena kava kesin ve karaciğer içinde aşırı sıvı drenaj sağlar.
Önümüzdeki beş dakika boyunca karaciğerde tam 50 mililitre HBSS nüfuz edilene kadar akış hızını yavaş yavaş dakikada sekiz mililitreye yükseltin. HBSS bitmeden hemen önce, taze hazırlanmış 40 santigrat derece kollajenaz dört çözeltiyi perfusate kabına değiştirin ve karaciğerin şişmesine ve doku sindirimine ve ayrışmasına yardımcı olmak için beş saniye aralıklarla inferior vena kava'ya geçici basınç uygulamak için forseps kullanın. Sindirim ilerledikçe, karaciğer şişecek ve beyaz olacak.
Bir pamuk uçlu aplikatör ile nazik sondalama sonra depresif kalır, pompa durdurmak ve kanül kaldırın. Karaciğerden safra kesesi çıkarın, safra kesesi dokusu gözyaşı değil dikkatli olmak, ve pbs steril bir 10 santimetre kültür çanak içine karaciğer hasat için temiz makas ve forceps kullanın. Nazik yıkama sonra, taze kollajenaz dört çözüm içeren yeni bir 10 santimetre kültür çanak içine karaciğer transferi ve hafifçe karaciğer dokusundan hücreleri ayırmak için sallayarak karaciğer gözyaşı iki temiz forseps kullanın.
Tüm organ parçalandığında, karaciğerin sindirilmemiş parçaları silkelenene kadar doku bulamaç triturate için üç mililitrelik şırınga kullanın. 50 mililitrelik konik tüp içine 70 mikron naylon örgü süzgeç ile ortaya çıkan hücre çözeltisi dökün, kalan hücreleri toplamak için HBSS ile çanak yıkama. Tek hücreli süspansiyon ile yıkama havuzu ve santrifüj ile hepatositkaldırın.
Sonra yeni bir 50 mililitrelik tüp için supernatant aktarın. Diğer hücreleri çıkarmak için, yeni bir 50 mililitrekonik tüp içine transfer önce supernatant santrifüj. Başka bir santrifüj ile ölü hücreleri çıkarın ve herhangi bir hücre enkaz ve agregaları kaldırmak için yuvarlak dipli tüp içine supernatant aktarın.
Şimdi bir polikarbonat ultra santrifüj tüp içine supernatant aktarın ve ikinci ve son ultra santrifüj için PBS yaklaşık 20 mililitre pelet resuspend. Sonra veziküller hemen analiz edilmezse eksi 80 santigrat depolama için PBS bir mililitre ekstrasellüler nanovezikül pelet resuspend. Tek bir fare karaciğerinden, bu yöntem nanopartikül izleme analizi ile belirlenen mililitre başına 3,46 kez 10 ortalama ile 1,74 ila dört kez 10 arasında değişen bir doku ekstrasellüler vezikül konsantrasyonu verir.
İzole karaciğer dokusunun ortalama boyutu hücre dışı veziküller 157.7 nanometre mod boyutu ile 144.5 nanometre ve ekstrasellüler 100 ile 600 nanometre arasında değişen nanopartikül izleme analizi. Bu yaklaşım kullanılarak izole edilen hücre dışı veziküller downstream uygulamaları için uygundur ve daha fazla karakterizasyon elektromikroskopi veya yüzey belirteçleri veya içeriğinin analizi ile morfolojik değerlendirmeler içerebilir.
