Bu protokol, hücre dışı vezikülleri, EVs'leri teknolojilerin bir kombinasyonu yla yoğunlaştırdığı ve virions'un EVs'den ayrılmasına olanak sağlaması nedeniyle önemlidir. Bu yöntem, birden fazla downstream analizi ve virüssüz EV preps karakterizasyonu için ultracentrifugation mevcut altın standart üzerinde EV kurtarma maksimize eder. Bu protokol EV ve viral enfeksiyonların incelenmesi için idealdir.
Bu yöntem HTLV, Ebola, Zika ve daha fazlası gibi diğer virüs sistemlerine uyarlanabilir. Ben nanopartikül hazırlık ile mücadele için bu yöntemin ilk kez kullanıcı bekliyoruz, bu yüzden dikkatle bizim özellikleri aşağıdaki öneririz. Sisteme bağlı olarak bazı optimizasyonlar gerekebilir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, protokolün genel iş akışını ve nüanslarını göstermek için önemlidir ve bu da ilk kez kullananlar için zamanı ve hataları azaltır. Enfekte veya transfected hücrelerden kültür supernatant hazırlayarak başlayın. Kültür 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit beş gün boyunca geç günlük hücrelerinin yaklaşık 10 mililitre, tüm orta reaktifler hücre dışı veziküller ücretsiz olduğundan emin olun.
Kültür hazır olduğunda, 5 dakika için 3,000 kez G santrifüj ile hücreleri pelet ve pelet atın. Supernatant'ı steril 0,22 mikrometre filtreyle filtreleyin ve filtratı temiz bir tüpte toplayın. Filtrasyona eşit hacimli PEG çökelti reaktifleri ekleyin ve karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
Karışımı bir gecede 4 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, karışımı 1500 kez G'de 30 dakika santrifüj edin, heterojen hücre dışı vezikül veya EV, pelet verin. Supernatant atın ve kalsiyum ve magnezyum olmadan, 1X PBS 150 ila 300 mikrolitre pelet yeniden askıya.
Bir yoğunluk gradyan hazırlarken, buz üzerinde pelet tutun. El yazmasında açıklandığı gibi, altı ila %18 iodixanol arasında değişen 11 yoğunluk fraksiyonu ile iodixanol yoğunluk gradyan ortamını hazırlayın. Girdap ve katman yoğunluğu kesirleri temiz ve kuru sallanan kova ultracentrifuge tüp içine her tüp karıştırın.
Katmanlı degradenin üstüne yeniden askıda ev pelet ekleyin ve ultracentrifuge tüp 10, 000 kez G ve 90 dakika boyunca dört derece santigrat. Ultracentrifuge tüpünden her bir fraksiyonu dikkatle yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NT80, NT82 ve 1X-PBS eşit hacimlerde karıştırarak, EV fraksiyonu zenginleştirme için nano tanecikleri% 30 bulamaç hazırlayın.
Homojenliği sağlamak için nanopartikül karışımını girdap. Her yoğunluk fraksiyonuna bulamaç 30 mikrolitre ekleyin ve tüpleri borulama veya ters çevirerek karıştırın. En kritik adım, yoğunluk gradyan ayrımını takiben EV'leri yoğunleştirmek için nano-makalelerin eklenmesidir.
Bu olmadan, EV kurtarma kötüdür. Yoğunluk fraksiyonları içeren nanopartikülü bir gecede dört santigrat derecede döndürün. Daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca 20,000 kez G'deki yoğunluk kesirlerini santrifüj edin.
Sıvıyı atın ve EV peletini 1X-PBS ile iki kez yıkayın. RNA izolasyonu için pelet hazırlamak için, el yazması yönergelerine göre, filtrelenmiş ve depsy ile tedavi otoklav, deiyonize su 50 mikrolitre yeniden askıya. RNA daha sonra ticari bir kit kullanılarak izole edilebilir.
Jel elektroforez ile analiz için, Laemmli tampon 15 mikrolitre pelet yeniden askıya. Numuneyi 95 dereceye kadar üç dakika ısıtın. Isıtma basamağa iki kez daha tekrarlayın, yavaşça girdap ve ısı döngüleri arasında numuneyi aşağı doğru döndürün.
Numuneyi 20,000 kez G'de 15 saniye santrifüj edin ve süpernatantı doğrudan jelin üzerine yükleyin. En iyi sonuçlar için, jel üzerine yüklenen parçacıkların miktarını sınırlamak ve jel girmesini herhangi bir yüklü nano tanecikleri önlemek için, 100 volt çalıştırın. PEG yağış, geleneksel ultrasantrifüjden çok daha verimli EV geri kazanımı sağlar.
10 mililitre kültür kullanırken, bu yaklaşım ultrasantrifüjden yaklaşık 500 kat daha yüksek verim elde eder. Bu yaklaşım aynı zamanda ekzozomların izolasyon verimliliğinin artmasına neden olur, bu da daha yüksek ekzozom belirteç proteinlerinin seviyeleri ile belirgindir. Batı PLA analizi, CD81'de 3000 kat artış, CD63'te dört kat ve CD9'da 40 kat artış olduğunu göstermektedir.
Ayrıca, bu protokol, EV'leri veriondan izole ederek, HIV1 enfeksiyonunda EV aracılı mekanizmaların aşağı akım çalışmalarına olanak sağlar. Batı PLA analizi EV'lerin üç fraksiyon popülasyonda bulunduğunu göstermektedir. Virüs sadece iki tanesinde bulunurken.
EV'in 10.8 ile 12 arasında ihlali virüs kontaminasyonu içermez. Hatırlanması gereken en önemli şey nano tanecikleri optimum EV zenginleştirme için çok önemli olmasıdır. Onların eklenmesi bir zorunluluktur.
Batı leke, PCR, saf diomech analizi gibi birçok downstream tahlilleri, plaka tabanlı hücresel tahlillerde kütle spektrometresi ile yapılabilir. Bunlar karakterizasyon, mekanistik ve/veya fonksiyonel çalışmalara olanak sağlar. Bu teknik, viral arka planı kirletmeden EV kargosu ve işlevselliğini inceleyen özel çalışmalara olanak sağlar.
Bu patogenez ve potansiyel terapötik gelişimi EV's incelenmesi için bir temel sağlar. Bu tekniğin sınırlamalarını aşmak ve ev hazırlama ve izolasyonu büyük hacimlere uygulamak için teğetsel akış filtrasyonu gibi gelişmiş sistemlerin kullanılmasını öneririz. Kullanılacak en tehlikeli alet, yoğunluk gradyan ayırma sırasında ultracentrifuge'dur.
Dengesizlik ve potansiyel rotor arızası önlemek için tüm santrifüj tüpleri aynı ağırlık emin olun.
