Bu yöntem, farklı çevresel değişkenlerin bakterilere karşı biyoyararlanımlarını nasıl etkilediği gibi kadmiyum ve cıvanın biyojeokimyasal döngüsü ile ilgili anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, oksijen varlığıne bakılmaksızın yarı gerçek zamanlı biyoyararlanım verileri ve canlı hücreler sunabilmesidir. Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler detay çok titiz dikkat gerektiren birçok zaman hassas adımlar vardır çünkü mücadele edecek.
Prosedürü gösteren Ben, benim laboratuvardan bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Teşp için hazırlamak için, cıva indüklenir biyosensör ve eksi 80 derece santigrat kriyo stok tan constitutively ifade biyosensör almak. Hücreleri mililitre de 120 mikrogram ampisilin içeren Lysogeny suyu tabaklarına yerleştirin.
Bir gecede 37 santigrat derece bir kuvözde plaka kültürleri büyümek. 4:30 ve 5 p.m. ampicillin ile LB on mililitre bir kültür aşılamak ve 220 rpm sallayarak 37 derece santigrat gecede büyümek.
Sabah saat 09:00 ile .m arasında kültürü ve daha önceden hazırlanmış büyüme ortamını anaerobik odaya getirir. Sonra steril bir balch tüp içine ampisilin mililitre başına taze büyüme orta ve 210 mikrogram sekiz mililitre ekleyin.
Şimdi bir gecede yetiştirilen kültür iki mililitre toplamak ve iki mililitre mikro santrifüj tüp içine transfer. 90 saniye boyunca 10,000 RCF'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatant'ı çıkarın ve iki mililitre taze büyüme ortamında yeniden askıya alın. Sonra taze büyüme orta ve ampisilin sekiz mililitre içeren balch tüp resuspended kültürü ekleyin.
Steril tekniği kullanarak, anaerobik odadan çıkarmadan önce balch tüpüne kauçuk bir durdurucu yerleştirin. Sonra bir kuvöz içine tüp yerleştirin ve 220 rpm sallayarak 37 santigrat derece de anaerobically büyümek. Üç ile beş p.m arasında.
kültür, yeni bir steril balch tüp ve anaerobik odaya büyüme orta ile balch tüp getirmek. Steril balch tüpünde ampisilin ile taze büyüme ortamı 10 mililitre kültür 100 mikrolitre ekleyin. Steril tekniği kullanarak, balch tüpüne dikkatlice kauçuk bir durdurucu yerleştirin.
220 rpm sallayarak 37 santigrat derece gecede büyümeden önce anaerobik odasından tüp çıkarın. Ertesi gün saat 9ile .m arasında, kültürü ve büyüme ortamını anaerobik odaya geri aktarın.
Yine steril bir balch tüp içine büyüme orta ve ampisilin sekiz mililitre ekleyin. Bir gecede yetiştirilen kültürün iki mililitresini iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha önce olduğu gibi santrifüj sonrasında, supernatant kaldırmak ve taze büyüme orta iki mililitre hücreleri yeniden askıya.
Sonra taze büyüme orta ve ampisilin içeren balch tüp resuspended kültür ekleyin. Steril tekniği kullanarak, balch tüpüne dikkatlice kauçuk bir durdurucu yerleştirin. Odadan çıkarın ve 220 rpm sallayarak 37 santigrat derecede anaerobically büyümek.
Kültürü girdap layarak ve ardından 600 nanometre veya OD600 optik yoğunluğunu ölçerek kültürün büyümesini bir spektrofotometre kullanarak izleyin. Beklenen büyüme üç ila dört saat sonra, kültür 6 OD600 ulaşmalıdır. Şimdi anaerobik odasında tüp getirmek ve iki mililitre mikro santrifüj tüpler içine kültür aktarın.
Önce olduğu gibi santrifüjü takiben supernatant çıkarın ve taze pozlama orta iki mililitre her hücre damak resuspend. Büyüme ortamının herhangi bir izini kaldırmak için bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın. Şimdi yedi mililitrePTFE standart şişe içine hücre kültürünün her iki mikro santrifüj tüpleri birleştirmek maruz kalma analizi nde kullanılmak üzere biyosensör stok elde etmek.
Deneye başlamadan önce anaerobik odada oksijen olmadığından emin olmak için anaerobik monitörü kontrol edin. Plaka düzenini 96 kuyu şablonuna göre tasarlayın. Üç teknik kopyaları deneyler çalıştırmak için bu en iyi şişeleri kurmak için dört tarafından sekiz ızgara ile temsil edilir 32 farklı tedaviler için izin verecektir.
Dört ünü, tsay plakası düzenine göre sekizer ızgaraya göre ayarlayın. Sonra tepsiye yedi mililitre PTFE standart şişeyerleştirin. Şişeler sadece şişenin dışını manipüle ederek ele alınmalıdır.
Her bir tedaviye karşılık gelen her şişeye pozlama orta hacmiekleyin. Her şişe için plaka düzenine göre test edilecek kimyasal değişkenin karşılık gelen hacmi ekleyin. Şimdi her şişeye nitrat ekleyin, böylece konsantrasyon 200 mikromolar.
Kurucu biyosensör tedavisi boşlukları için bu adımı hariç tinler. Şişelere cıva eklemek için, önce dört ila sekiz mikromolar stok almak ve iyi sallamak. Çözeltiyi ve pozlama ortamını yedi mililitrelik PTFE şişesinde 100 ila 250 nanomolar konsantrasyonuna seyreltin ve çalışan bir cıva çözeltisi yapın.
Bu çalışma çözeltisinden, plaka düzenine göre gerekli şişelere cıva ekleyin. Cıva veya kadmiyum ekledikten sonra elle yörüngesel bir hareketle plaka sallamak. Deney, civa veya kadmiyumun çözeltide spekülasyon yapmak için gereken süreye bağlı olarak artık duraklatılmış olabilir.
Deney devam ettiğinde, homojenliği sağlamak için yavaşça pipet biyosensör stoku ileri geri. Daha sonra her şişeye 100 mikrolitre biyosensör stoğu ekleyin ve plakayı daha önce olduğu gibi elle sallayın. Plaka okuyucuyu 37 dereceye ısıtın ve her iki nokta 5-5 dakikada bir okuyarak on saat boyunca kinetik bir koşu ayarlayın.
Okumalar arasında bir orbital sallayarak. 440 nanometre lik floresan uyarma ve 500 nanometre lik bir emisyon ile floresan ölçümleri almak için koşuyu ayarlayın. Şimdi pipet her PTFE şişeden 200 mikrolitre dört tarafından sekiz ızgara 96 kuyu plaka karşılık gelen kuyular içine.
Pipet her 200 mikrolitre aktarmadan önce beş kez ileri geri. Pipet ucunu atmak yerine pipet ucunu PTFE şişesinde bırakarak pipet leme ilerlemesini takip edin. 96 kuyu plakasını plaka okuyucusunun tepsisine yerleştirin.
Sonra 96 kuyu plaka kapağı yerleştirin ve tgörünüşe başlayın. Burada zaman bir fonksiyonu olarak düzeltilmiş floresan verileri gösteren temsili sonuçlar vardır. Floresan indüklenir biyosensör cıva artan konsantrasyonları ile gösterilir.
Tüm değerler cıva kontrolü için boştur. Floresan zirveleri cıva veya kadmiyum konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak floresan sinyali göstermek için ölçülebilir. Hem indüklenebilir hem de kurucu biyosensörler için, indüklenebilir sensörlerin ortasındaki cıva veya kadmiyum konsantrasyonu değişkenleri test etmek için kullanılmalıdır.
Burada çinko ile sonuçsuz bir sonuç örnekleridir. Ve biyosensör için cıva biyoyararlanımı üzerinde magnezyum ve manganez ile kesin bir sonuç. Çinko ile sonuç, çünkü kurucu floresan toksisite gösteren indükilebilir floresan ile çürür.
Bu prosedürü çalışırken bu biyosensör kalibre etmek için kullanılacak gibi ya kadmiyum veya cıva konsantrasyonları girmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, belirli cıva veya kadmiyum türlerinin biyoyararlanımlarını nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için sulu sistemlerin termodinamik modellemesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir. Kadmiyum, cıva ve sülfürik asit gibi güçlü asitlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman ın takılması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
Bu teknik, geliştirilmesinden sonra çevresel mikrobiyoloji alanında araştırmacıların yarı zamanlı anaerobik cıva veya kadmiyum biyoyararlanımı ve genetik olarak çekilebilir mikropları keşfetmelerinin önünü açmıştır.
