MUB40, laktoferrin'e bağlanan ve şimdiye kadar test edilen insan ve tüm memeli doku örneklerinde spesifik bir tespite olanak tanıyan yeni bir nötrofil belirtecidir. Nötrofilleri MUB40 ile etiketlemek kolay, hızlı ve özeldir. Şimdi bizim laboratuvarda yaygın olarak kullanılan ve bu tekniğin etkisi inflamatuar hastalıkların tanısı doğru uzanır.
Başlamak için, metin protokolüne göre bir, iki ve üç numaralı çözümleri hazırlayın ve bunları bir gecede anoksik bir kabine yerleştirin. Daha sonra, 650 g'de toplanan kan tüplerini 20 dakika santrifüj edin ve hücreleri plazma fraksiyonundan ayırın. Ayrılmış kanı bozmadan tüpleri anoksik kabine aktarın ve plazma fraksiyonlarını 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Bundan sonra anoksik dolaptan plazma tüpünü çıkarın ve 20 dakika boyunca 2900 g santrifüj. Peletli trombositleri bozmamaya özen gösteriyor, tüpü anoksik kabine aktarın ve trombosit zayıf plazmasını 50 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Kan toplama tüpleri kullanarak, konik 50 mililitrelik tüp kırmızı kan hücreleri birleştirmek.
Daha sonra, toplam hacmi 44 mililitre ulaşana kadar% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve% 6 dekstran altı mililitre ekleyin. Kan ve dekstran karışımını hafifçe karıştırmak için tüpü 10 ila 20 kez ters çevirin ve tüpün en az 30 dakika tortu letmesine izin verin. Tüp tortuları iken, plazma 5.8 mililitre percoll çözeltisi 4.2 mililitre ekleyerek bir Percoll gradyan hazırlamak ve karıştırmak için tüp ters.
Daha sonra, dextran üst kısmını içeren nötrofil toplamak, pipet kırmızı kan hücreleri için değil dikkat. Vida kapağını sıkın, dekstran tüpünü anoksik dolaptan çıkarın ve tüpü 300 g'da 10 dakika santrifüj edin. Peletli hücreleri rahatsız etmemeye özen gösteriyor, tüpü anoksik kabine geri yerleştirin.
Daha sonra, pipetleme ile sıvı çıkarın. Bir mililitre plazmadaki peleti yavaşça askıya alın. Yavaş yavaş Percoll çözeltisinin üstlerine resuspended hücreleri ekleyin.
Percoll çözelti tüpünü anoksik dolaptan dikkatlice çıkarın ve 800 g'da 20 dakika boyunca nötrofillerden ayırmak için santrifüj edin. Daha sonra, metin protokolüne göre 14 mililitre yıkama tampon çözeltisi hazırlayın. Sonra, anoksik kabine Percoll tüp yerleştirin.
Percoll ve PBMCs kaldırmak ve yıkama tampon çözeltisi bir mililitre içinde pelet içeren nötrofil yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Sonra, yeniden askıya alınan hücrelere 200 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Hücreleri ve boncukları en az 15 dakika karıştırıp kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, iki mililitre yıkama tamponu ile iki kez ayırma sütunu yıkayın. Sütunun altında yeni, 15 mililitrelik konik bir tüp tutarken, yavaş yavaş kolon aracılığıyla nötrofil kırmızı kan hücresi karışımı pipet. Sütundan akan bulutlu olmalı ve kırmızı rengini kaybetmeli, nötrofillerin kalan kırmızı kan hücrelerinden tamamen ayrıştığını doğrular.
Sütunun üst kısmında yıkama tampon iki mililitre ekleyin ve aynı tüp içinde akış toplamak. Bu yıkamanın sonunda, akış açık olmalıdır. Nötrofillerin eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için toplama tüpünü yavaşça karıştırın.
Daha sonra hücre sayma akışı ndan 10 mikrolitre toplandı. Bundan sonra, anoksik dolaptan nötrofil tüp çıkarın ve 20 dakika boyunca 300 g tüp santrifüj. Tortulanmış nötrofilleri anoksik kabine geri yerleştirin ve pipetleme yoluyla yıkama tamponu çıkarın.
Sonra, plazmadaki peleti askıya alın. BIR mikrolitre RI-MUB40-Cy5'i bir mililitre RPMI-1640 ortamına, fenol kırmızısı olmadan ekleyin ve pipetleme yoluyla karıştırın. Daha sonra, karıştırmak için FMLP çözeltisi ve pipet bir mikrolitre ekleyin.
Karışımı cam alt mikroskopi kabına aktarın. Sonra çanak saflaştırılmış hücrelerin uygun bir hacim ekleyin. Son olarak, ters floresan mikroskobun içine çanak yerleştirin ve görüntü edinimi başlar.
Bu protokolde, MUB40 FMLP ile simülasyon üzerine nötrofil salgısını saptamak için canlı hücreler üzerinde kullanılmıştır. Laktoferrin de dahil olmak üzere granül içeriğinin serbest bırakılması dinamikleri, zaman içinde görselleştirilmiş olabilir, burada macenta. MUB40 ayrıca sabit nötrofillerde de kullanılabilir.
Burada, zamanlanmış bir seride fagosiyefle floresan boncuklar. Nötrofil granül içeriği burada mavi olarak etiketlenmiştir. Nötrofiller erken zaman noktalarında hücre boyaması çok az gösterdi ve yavaş yavaş, RI-MUB40 etiketleme zaman içinde arttı, plazma membran ve boncuk yüzeyinde hem de.
MUB40, metin şekillerinde gösterildiği gibi nötrofillerin özellikle saptanması için sabit inflamatuar dokularda da kullanılabilir. Burada laboratuarımızda rutin olarak uygulanan nötrofil arınma prosedürünü anlatıyoruz. Başka bir yöntem uygundur, MUB40-Cy5 etiketleme hala çalışacaktır.
Nötrofil özellikle arınma sonrası MUB40 ile etiketlenebilir, ya da doğrudan hasta veya hayvan modellerinden iltihaplı doku. Kullanımı genişletmek için çeşitli MUB40 türevleri tasarlanmıştır. Gelişiminden sonra, bu teknik inflamasyon alanında araştırmacı için yol açtı, inflamatuar hastalıklarda nötrofilik işe ve aktivasyon keşfetmek için.
