Çalışmalarımız Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir. Biz nazik CFP-LC3 ifadesi için plazmid bize sağlamak için Prof Tamotsu Yoshimori teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> (2 sonra% 80 bir confluency için amaç% 30-40 bir confluency için, Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagles Orta (DMEM) gece boyunca kültür hücreleri; HEK-293T hücreleri Tohum düşük geçit sayısı istikrarlı bir şekilde 22 mm yuvarlak lamelleri GFP-DFCP1 ifade gün - canlı hücre görüntüleme gün). </li></ol> 2. Hücre transfeksiyonu <ol><li> İt serum, orta, 3 ul X-tremeGENE 9 DNA Transfeksiyon Reaktif ve pECFP-LC3 plazmid DNA, 0.5 ug azaltılmış 100 ul OptiMEM içeren, her plaka için transfeksiyon kompleksi karışımı hazırlayın. Ve aşağı yukarı pipetleme hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. [Not: defalarca bu Lipofectamine 2000 gibi diğer transfeksiyon reaktifler, toksisite çok şey var bulduk, ve, ek olarak, birçok mikroskopi teknikleri ile müdahale kendi floresan parçacıklar üretmek.] </li><li> Plakalardan ortamı aspire ve taze DMEM önceden ısıtılmış 37 ° C de eklemek </li><li> Tran Ekle24 saat inkübe hücreleri; pipetleme hücrelere karmaşık sfection. </li></ol> 3. Organel Marker (opsiyonel) ile hücre Kuluçka <ol><li> 75 nM&#39;lik bir son konsantrasyonda DMEM Mitotracker / Lysotracker ekleyin ve ışığa maruz kalma ve tekrarlayan dondurma ve eritme döngüsü önlemek için, bütün deney günü boyunca, alüminyum folyo ile kaplı bir Falcon tüpüne, buz üzerinde tutmak. </li><li> Mitotracker / Lysotracker-ihtiva eden ortam 2 ml &#39;lik bir kısım çıkarın ve 37 ° C&#39;de ısıtmak; transfekte hücrelerden aspire orta ve Mitotracker / 30, orta ve inkübe hücreleri içeren Lysotracker ile değiştirin - 60 dak. </li></ol> 4. Canlı Hücre Görüntüleme için Kuluçka Odası hazırlanması (Şekil 1) <ol><li> Temiz metal ve% 75 etanol ve metal O-ring kenarında silikon gres uygulamak ile O-ring plastik. </li><li> Forseps plakadan lamel kaldırmak ve lamel alt taraftan ortamın aşırı kuru kullanarak,Bu gibi, yağ ile çok fazla orta karıştırma önlemek için sızıntı olasılığını artıracaktır. </li><li> Kapalı bir oda oluşturmak için, arasında sıkışmış lamel ile, plastik O-ring bir çıkıntı üzerinde dinlenme ve plastik O-ring üstüne metal O-ring uygun lamel bırakın. </li><li> Plakadan ortamı ile iyi odası; DMEM bikarbonat tampon sistemi yapay CO2 konsantrasyonu gerektirir ve bu noktadan ve üzerine, meydana pH değişiklikleri önlemek için, bir tampon madde içermeyen DMEM ortamı içinde hücrelerinin uzun süreli inkübasyondan kaçınmak % 5-10 arasında ve ortam havasının CO2 konsantrasyonu çok daha düşüktür. </li></ol> 5. Hücre Açlık <ol><li> Mikroskop sahnede kuluçka odasına koyun. </li><li> Tam orta aspire ve açlık orta 2 ml 3 kez yıkayın, hiçbir amino asitler sonunda otofaji yanıt engeller DMEM, kalma emin olmak için; ayarlayınON zamanlayıcı. </li></ol> 6. Mikroskopla inceleme <ol><li> Canlı hücre geniş alan epi-floresan için yapılandırılmış uygun bir görüntüleme sistemi gerekecektir. Bu genellikle bir araştırma dereceli ters bir mikroskop çerçeve, floresan proteini (ler) / ilgi çekici boya (lar), yüksek kaliteli objektif lens, hassas bir CCD / sCMOS için özel yoğun bir geniş spektrumlu ışık kaynağı, ayna ve filtre oluşacaktır kamera ve bir kuluçka odası. (Bütün büyük mikroskop üreticileri canlı hücre görüntüleme için uygun tam bir geniş alan sistemleri sunuyoruz, ancak bu üreticilerin çeşitli bileşenleri kullanarak bir sistem ev inşa da mümkündür ve bu mikro-Müdürü olarak açık kaynak kodlu yazılım kullanarak kontrol <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">: http / / valelab.ucsf.edu / ~ AA / MMwiki /</a> ). Bizce en önemli yönü floresan gazetecilere ifade seviyeleri en aza böylece yüksek hassasiyet bir sistem kullanmaktır. </li><li> Selgörüntüye uygun hücrelere ecting. <ol><li> Daha autophagosome oluşumu olayları çekilecek sağlayacak büyük ve düz hücreleri seçin. Aynı zamanda, daha önce omegasomes daha büyük bir sayı üretmek başlamıştır hücreleri için tercih. </li><li> Videoyu autophagosome oluşumu olayların daha büyük bir oranı yakalamak için, 30 dakika sonra ya da iyi otofaji yanıt içine video yakalama başlatın. </li></ol></li><li> Görüntüleme. <ol><li> Bir yüksek büyütme lens (100x 1.4 NA) kullanın. </li><li> Fotoğraf beyazlatma önlemek için en fazla% 10-20 uyarma ışık yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> 100-500 msn maruz kalma, 2x2 binning ve 100 kazanç için kamera (Hamamatsu ORCA ER, piksel boyutu 6.45 mikron) ayarlayın. </li><li> Görüntü elde etme oranı 1 kare her 10 saniye olarak ayarlayın. </li></ol></li></ol> 7. ImageJ ile Autophagosome Oluşumu Etkinlikler Montajları oluşturma [Bu sadece e birleştirilen videoyu tarayarak bir sistematik olmayan bir şekilde yapılabilirilgi delikleri, ama aşağıda belirtildiği gibi o da sistematize olabilir.] <ol><li> 3 (veya 2) açık görüntü yığınlarının ImageJ / Fiji kanalları ele geçirdi. </li><li> Ilgili kanala, yeşil, kırmızı ve mavi LUT (Arama Tabloları) uygulayın; 3 renk birleştirme ve kaydedin. </li><li> Analiz sekmesinden, Araçlar&gt; ROI yöneticisi seçin ... &gt; Belirtin, sonra yığının ilk görüntü tanımlanan boyutu rastgele bir alan seçin. </li><li> Görüntü sekmesinden, yığının seçilen alanı çoğaltmak için, yinelenen seçin. </li><li> Görüntü sekmesinden, Yığınlar seçin&gt; montaj olun ... içeren geçici bir montaj oluşturmak için tüm kareleri ele geçirdi. Tam autophagosome oluşumu olay için montaj tüm kareleri tarama, olayın ilk ve son kare notlar tutun. </li><li> Analiz sekmesinden, Araçlar&gt; ROI yöneticisi seçin ... diğer 2 renk için yığının ilk görüntü hem de birleştirilmiş renkleri görüntü için aynı alanı seçmek ve yığınlar yinelenen. </li><li> To sekmesinde Dosya, Yeni&gt; Görüntü seçeneğini belirleyin ve yükseklik için belirlenen yatırım getirisi yöneticisi kullanarak başlangıçta seçilen piksel, sayısına göre genişliği için belirlenen 4 kez ROI yöneticisi belirlenen yüksekliği artı 3 renk ve arasında boşluk için 3 piksel Her yığın kare sayısı olarak birleştirilmiş ve set Dilimleri. </li><li> Görüntü sekmesinden seçin Yığınlar&gt; Araçlar&gt; Ekle ..., sonra arasında 1 piksel boşluk bırakarak, üst üste her alt yığın bir takın. </li><li> Görüntü sekmesinden, Yığınlar seçin&gt; montaj olun ... Bir montaj başlayan ve yakalanan autophagosome oluşumu olayın ilk ve son kare ile biten oluşturmak için. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem autophagosome oluşumu sırasında protein lokalizasyonu görselleştirme sağlar. Biz olaylar, disk konfokal ve Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi iplik gelin-tarama konfokal dahil olmak üzere açıklanan görselleştirme çeşitli yöntemler denedim. Biz genel amaçlı standart geniş alan epi-floresan hassasiyet ve çözünürlük arasındaki en iyi dengeyi sağlar bulduk. Bu gürültü, az photo-bleaching/photo-toxicity ve hızlı satın alma için iyi bir...

Otofaji 1-3 autophagosome oluşumunun son sonuç için proteinin çok sayıda koordine gerektiren oldukça dinamik bir işlemidir. Mikroskopi muhtemelen en sık otofaji 4 eğitim için uygulanan bir tekniktir. En Otofaji protein lokalizasyonu yaygın hem de endojen proteinlerin immüno-boyama yöntemi ve floresans ile etiketlenmiş eksojen proteinin ifadesi ile, sabit hücrelerinde incelenmiştir. Buna ek olarak, Elektron Mikroskobu (EM), tek başına ve immün-altın etiketleme, ile birlikte bu yapıların 5,6 ince ayrıntıları nitelendirdi. Zaman - bu tekniklerin alanı 3 boyutlu olarak autophagosome oluşumu anlayışımızı kurduk olmasına rağmen, onlar 4. boyut hakkında bilgi yeterli miktarda sağlamak için başarısız oldu. Bu Possi kadar yakın bir autophagosome oluşumu takip verir gibi canlı hücre görüntüleme Bu bariyer üstesindengerçek zamanlı 7 ble. Bu teknik ilk Yoshimori ve arkadaşları 8 tarafından otofaji incelemek için kullanılmıştır, ve giderek bundan sonra kullanılmıştır. Time-lapse mikroskopi canlı hücrelerde POI ve bir süre boyunca lokalizasyonu yakalar. Iyi karakterize otofaji ve / veya organel işaretleyici bu bilgileri karşılaştırarak, canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu büyük mekansal ve zamansal bağlamda POI koyabilirsiniz. Canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu tüm adımları boyunca POI lokalizasyonu tekrarlayan yakalama dayanır, sabit hücre görüntüleme tek bir yakalama dayalı iken. Sabit hücre görüntüleme sadece lifecy farklı aşamalarında aynı anda yakalanan birçok autophagosomes yılında ortalama lokalizasyonu dayalı POI rolünü, varsayabiliriz ise bu nedenle, canlı hücre görüntüleme, autophagosome oluşumunun belirli adımlar da POI katkısı kanıtlayabilirimcle. Canlı hücre görüntüleme yüksek analitik güç bir yöntem olmasına rağmen, bu göz önüne alınması gereken bazı doğal sınırlamalar vardır. Her şeyden önce, canlı hücre görüntüleme bir ya da daha fazla dış kaynaklı floresanla işaretlenmiş proteinlerin ekspresyonu gerektirir. Floresan etiketleri boyutu büyük olma eğilimindedir ve bazen sterik nedenlerden dolayı bir protein davranışını değiştirebilir. Bu membran 2 boyutları sınırlı alanda çalışması için gereken bu durumu, membran proteinleri için vurgulanır. Önemli olan, bir Autophagosomes membranöz yapılardır ve buna göre oluşumu membran-ilişkili proteinlerin çok sayıda gerektirir. Başka bir problem seti POI ifade seviyeleri bağlanır. Prensip olarak, bir eksojen protein endojen protein karşılaştırılabilir seviyelerde ifade edilmelidir. Bu alt hücresel yerleşimi önemli düzenleyiciler doymuş olmayacak sağlar, ve inciE analiz biyolojik ilgili olacaktır. Onlar endojen seviyelerinin üzerinde ifade edilir, onlar otofaji yanıt 9 inhibe eğilimi olarak Ayrıca, otofaji proteinlerin aşırı, kaçınılmalıdır. Tersine, POI ifadesi düzeyleri yana fotoğraf beyazlatma olmadan zaman iyi bir süre için yerelleştirme aşağıdaki sağlayacak kadar yüksek olmalıdır, bir uzlaşma gerekmektedir. Memelilerde hücrelerin bir eksojen proteinin en iyi ifade seviyeleri elde ince ayar bir sürü gerektirir, ancak stabil POI farklı düzeylerde ifade hücre hatları kurulması ve tarama ile mümkündür. Standart floresan mikroskobu ile elde edilebilir uzaysal çözünürlüğü başka bir sınırlayıcı faktördür. Çözünürlük nedenlerle bir dizi için sınırlı olabilir, ama en iyi, yanal çözünürlük 250 nm civarında olacak. Bu, daha küçük bir mesafe ile ayrılmış herhangi bir nesne (veya tek olarak bağlı görüneceği anlamına gelirnesne) ve 250 nm daha küçük nesneleri olduklarından daha büyük resimde temsil edilecek. Bu nedenle görüntülerin her zaman bu düşünce ile yorumlanmalıdır ve bu EM gibi tamamlayıcı teknikler ince ultra-yapısal detay çözmek için gerekli olacaktır. Sonuç olarak, canlı hücre görüntüleme doğal olarak, uzun bir zaman süresi için potansiyel olarak, hafif bir hücre açığa gerektirir. Bu bir hücre, fotoğraf-toksisite olarak bilinen bir olgu fizyolojik tepkileri değiştirebilir. Biz başarıyla autophagosomes ER teller 10,11 ile yakın ilişki içinde olan PI3P zengin halka benzeri yapılar olarak adlandırılan omegasomes, köken, ilk kez açıklamak için PI3P-bağlayıcı protein DFCP1 canlı hücre görüntüleme kullandık. Biz açıkça LC3 pozitif yapıları omegasomes ile yakın ilişki içinde oluşmaya başlar göstermiştir. Biz burada bir hücre hattı istihdam stabil canlı hücre için GFP-DFCP1 ifade öneririzilgi protein görüntüleme, autophagosome oluşumunda rolü karakterizasyonu için sağlam bir mekansal ve zamansal çerçeve kurar.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Otofaji besinlerin, özellikle amino asit yokluğunda eksikliği tarafından tetiklenen bir hücresel tepkidir. Otofaji sitoplazma, uzun ömürlü proteinler ve hatta protein agregatlarının, kusurlu organeller ve virüs ya da bakteri tecrit Autophagosomes adlandırılan çift cidarlı yapıların formasyonu ile tanımlanır. Autophagosomes sonunda üretilen besin sitoplazmaya geri geridönüştürülerek ile, içerik toplu bozulmasına yol açan lizozomlar ile sigorta. Bu nedenle, otofaji hücre dengesini için çok önemlidir ve otofaji bozulmasına hastalık, özellikle nörodejenerasyon, yaşlanma ve kansere yol açabilir. Autophagosome oluşumu hücreleri çekirdek otofaji makine adı verilen proteinlerin belirli bir grup, tahsis hangi için, bir çok ayrıntılı bir süreçtir. Çekirdek Otofaji makine işlevsel olarak, çeşitli hücresel işlemleri ile ilgili ek proteinler ile tamamlanır membranında örneğin birmitokondriyal ve lizozomal biyoloji e ticareti,. Autophagosomes oluşumu ve bozulması için bu proteinlerin Koordinasyon otofaji son derece dinamik ve sofistike yanıt oluşturmaktadır. Canlı hücre görüntüleme bir tek autophagosome oluşumu olayın seviyesine her otofaji ile ilgili proteinin moleküler katkısı aşağı izlemenizi sağlar ve gerçek zamanlı olarak, bu nedenle bu teknik, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük sunuyor. Burada bizim analiz için bir mekansal ve zamansal bağlamda kurmak için, istikrarlı bir şekilde GFP-DFCP1 ifade eden bir hücre hattı kullanın. Autophagosomes oluşumuna yol açan haberci yapılardır DFCP1 işaretleri omegasomes. Ilgi (POI) bir protein, kırmızı ya da mavi floresan etiketi ya ile işaretlenebilir. Mitokondri ve lizozomlar ER gibi farklı organeller,,, tüm autophagosome oluşumu farklı adımlar katılan ve belirli bir izci boya kullanılarak işaretlenebilir. AUTOP zaman atlamalı mikroskopiBu deneysel yukarı hagy, bilgi dördüncü boyutu örneğin, süresi hakkında ayıklanmasını sağlar. Dolayısıyla biz uzay ve zamanda otofaji için POI katkısı takip edebilirsiniz.

Protokol açıklanan olarak, dengeli bir şekilde Otofaji indükleyici koşullar altında, GFP ile işaretlenmiş olan DFCP1 ifade eden bir hücre hattı CFP-etiketli LC3 lokalizasyonu takip zaman atlamalı mikroskobu kullanılmıştır. Bu deneyin sonucu 2 serisi veya GFP-DFCP1 ve CFP-LC3 karşılık gelen görüntüler, yeşil bir ve mavi kanaldan biri olan yığınlarının yakalama olduğunu. Daha ileri olarak, protokol bölümünde açıklanan tek autophagosome oluşumu olaylar, karşılık gelen montajı oluşturm...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

live-cell-imaging-of-early-autophagy-events-omegasomes-and-beyond

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K Görüntüleme.  The Babraham Institute. Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Video: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biyoloji

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...