Bu yöntem, bitki thylakoid membranındaki fotosentetik protein komplekslerinin bileşimi ve dinamik organizasyonu ile ilgili anahtar soruların cevaplandırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, yerli protein kompleksleri arasındaki fonksiyonel etkileşimlerin analizine olanak sağlaması ve değişen çevre koşullarında protein kompleksi organizasyonunun plastisitesini aydınlatan olmasıdır. 0,75 milimetrelik spacers kullanarak üreticinin talimatlarına göre 10 santimetre plakalar ile jel caster sekiz santimetre ayarlayın.
Bir karıştırma plakası üzerine bir degrade karıştırıcı yerleştirin ve boru ile peristaltik pompa ile bağlayın. Borunun diğer ucuna bir şırınga iğnesi takın ve iğneyi cam ile alüminyum plaka arasına yerleştirin. Ağır hazneye manyetik bir karıştırıcı yerleştirin.
Ayırma jeli gradyanı için kullanmak üzere metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerde %3,5 ve %12,5 akrilamid çözeltileri hazırlayın. Zamansız polimerizasyonu önlemek için çözeltileri hazırlarken santrifüj tüplerini buzda tutun. Degrade mikseriçin çözümler pipepetting hemen önce% 5 APS ve TEMED ekleyin.
Pipet ağır hazneye %12,5 çözüm sağlar. Çözeltinin ışık odasına girmesine izin veren iki odayı birbirine bağlayan vanayı açarak, Hafif ve ağır odayı birbirine bağlayan kanaldaki hava kabarcıklarını çıkarın. Vanayı ve pipeti çözeltinin izlerini ağır hazneye kapatın.
Son olarak, pipet ışık odasına% 3.5 çözüm. Manyetik karıştırıcıyı aç. Vanaları açın ve peristaltik pompayı açın.
Jel çözeltilerinin cam ve alüminyum plaka arasında dakikada yaklaşık 0,5 mililitre akış hızında akmasına izin verin. İğne her zaman sıvının üzerinde olmalıdır. Ağır ve hafif odalar boşaltıldığında onları ultra saf suyla doldurun.
Ve su yavaşça jel yüzeyi kaplamak için izin verin. Jel polimerizasyonu oda sıcaklığında yaklaşık bir ila iki saat sürer. Oda sıcaklığında istifleme jeliçin% 3 akrilamid çözeltisi hazırlayın.
Pipet polimerize ayırma jel üstüne istifleme jel ve hava kabarcıkları kaçınarak cam ve alüminyum plaka arasında bir örnek jel tarak yerleştirin. Jelin oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika polimerleşmesine izin vererek, taramayı ultra saf su altında hafifçe çıkarın. Bu noktada jel birkaç gün nemli koşullarda pozitif dört derece santigrat saklanabilir.
Mililitre başına bir miligram son klorofil konsantrasyonu için buz gibi 25BTH20G tampon ile seyreltilmiş izole thylakoids. Her thylakoid örnek için iki tüp hazırlayın hem beta-DM hem de digitonin solubilizasyonunu gerçekleştirin. Şimdi deterjan tampon eşit hacimli ekleyin.
Deterjan ve thylakoid örneğini bir pipetle hafifçe karıştırın ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçının. Beta-DM solubilizasyon için buz üzerinde iki dakika için thylakoids solubilize. Veya oda sıcaklığında 10 dakika bir rocker veya shaker üzerinde sürekli nazik karıştırma ile digitonin solubilizasyon için.
Kuluçkadan sonra, 18, 000 g pozitif dört derece santigrat 20 dakika santrifüj ile insolubilized malzeme çıkarın. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve numuneye 1/10 hacimli Coomassie parlak mavi tampon ekleyin. Jeli dikey bir elektroforez sistemine ayarlayın.
Üst tampon odasını mavi katot arabelleğiyle doldurun ve alt arabellek odasına anod arabelleği dökün. Thylakoid örneklerini kuyulara yükleyin. Elektroforezi başlatın ve metin protokolünde listelenen voltajı kademeli olarak artırın.
Jeli soğuk bir oda kullanarak veya jel sıcaklığını soğutma sistemiyle ayarlayarak pozitif dört derecede çalıştırın. Örnek ön jel yaklaşık 1/3 göç ettiğinde açık bir katot tampon mavi katot arabelleği değiştirin. Elektroforetik çalışmadan sonra görüntü arşivleme için bir fotoğraf tarayıcı ile jel tarayın.
2-SDS PAGE gerçekleştirmek için bir milimetrelik spacers kullanarak dikey elektroforez sistemi monte. Metin protokolünde açıklandığı gibi 2-B tarak ile standart bir SDS jel hazırlayın. BN jel şerit kes ve beş mililitrelik bir tüp yerleştirin.
Sonra Laemmli tampon iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında hafif sallayarak 45 dakika boyunca şerit kuluçka. Hava kabarcıkları kaçınarak jel üstüne bir spacer yardımı ile şerit yerleştirin. Pipet filtre kağıt dar bir parça üzerinde moleküler ağırlık marker beş mikrolitre ve standart kuyukağıt yerleştirin.
BN jel şerit mühür ve marker kağıt jel şerit üstüne çalışan tampon% 0.5 agarose dökün ve katılaşmak için izin. Standart protokollere göre elektroforez gerçekleştirin. Elektroforetik çalışmadan sonra proteinleri SUPRO Yakut lekesi veya gümüş lekesi ile görselleştirin.
Beta-DM'nin thylakoid protein kompleks desenleri ve digitonin-çözünürörneklerinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Küçük kompleksler elektroforetik çalışma sırasında daha hızlı göç ve jel alt kısmında bu nedenle. Büyük kompleksleri jel üst kısmında ise.
Beta DM kompleksleri arasındaki labile protein-protein etkileşimleri ile müdahale ederken Digitonin genellikle büyük derlemelerde protein kompleksleri korur. Beta-DM ve digitonin-solubilize thylakoidlerin protein komplekslerinin alt birim bileşimi burada sunulmuştur. Her kompleksin alt birimleri hizalanmış kompleksin altındaki dikey çizgiden bulunur.
Prensip olarak, 2-B jel her nokta bireysel bir protein temsil eder. Ama pratikte, aynı moleküler kütleye ait birkaç protein tek bir noktada bulunabilir. Lekelerin tanımlanması kütle spektrometresi analizine dayanır.
Bu prosedürü uyguladıktan sonra, protein kompleksleri hakkında yapısal kavrayışlar elde etmek için mavi yerli jelden gelen protein komplekslerinin elektron mikroskobu ve tek parçacık analizi gibi diğer yöntemlerle devam edilebilir. Bilinmeyen protein alt birimlerini belirlemek için iki boyutlu SDS PAGE'deki tek tek protein noktaları kütle spektrometresi ile analiz edilebilir. Akrilamid ve digitonin ile çalışmanın son derece zararlı olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken koruyucu eldiven takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
