Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Zusammensetzung und dynamische Organisation der photosynthetischen Proteinkomplexe in der pflanzlichen Thylakoidmembran zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse funktioneller Wechselwirkungen zwischen nativen Proteinkomplexen ermöglicht und die Plastizität der Proteinkomplexorganisation unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen aufklärt. Richten Sie den Gelgießer mit 0,75-Millimeter-Abstandshaltern um acht Zentimeter mal 10 Zentimeter nach Herstelleranleitung ein.
Legen Sie einen Gradientenmischer auf eine Rührplatte und verbinden Sie ihn mit der Peristaltikpumpe durch Schläuche. Befestigen Sie eine Spritzennadel am anderen Ende des Schlauches und legen Sie die Nadel zwischen Glas und Aluminiumplatte. Legen Sie einen Magnetrührer in die schwere Kammer.
Bereiten Sie 3,5% und 12,5% Acrylamidlösungen in 15-Milliliter-Konifugenröhren vor, wie im Textprotokoll beschrieben, um sie für den Trenngelgradienten zu verwenden. Um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern, halten Sie die Zentrifugenrohre bei der Vorbereitung der Lösungen auf Eis. Fügen Sie 5%APS und TEMED direkt hinzu, bevor Sie die Lösungen an den Gradientenmischer anbringen.
Pipette die 12.5%Lösungen für die schwere Kammer. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Kanal, der die leichte und schwere Kammer verbindet, indem Sie das Ventil öffnen, das die beiden Kammern verbindet, so dass die Lösung in die Lichtkammer eindringen kann. Schließen Sie das Ventil und pipette die Spuren der Lösung zurück in die schwere Kammer.
Schließlich pipette die 3,5%Lösung für die Lichtkammer. Schalten Sie den Magnetrührer ein. Öffnen Sie die Ventile, und schalten Sie die Peristaltikpumpe ein.
Lassen Sie die Gellösungen zwischen Glas und Aluminiumplatte mit einer Durchflussrate von etwa 0,5 Milliliter pro Minute fließen. Die Nadel muss sich jederzeit über der Flüssigkeit begeben. Wenn die schweren und leichten Kammern geleert haben, füllen Sie sie mit reinstem Wasser.
Und lassen Sie Wasser die Geloberfläche sanft überlagern. Die Gelpolymerisation dauert etwa ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die 3%Acrylamid-Lösung für das Stapelgel bei Raumtemperatur vor.
Pipette das Stapelgel auf dem polymerisierten Trenngel und legen Sie einen Probengelkamm zwischen glas- und Aluminiumplatte, um Luftblasen zu vermeiden. Nachdem Das Gel 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur polymerisiert werden kann, entfernen Sie den Kamm vorsichtig unter reinem Reinstwasser. An dieser Stelle kann das Gel bei positiven vier Grad Celsius in feuchten Bedingungen für ein paar Tage gelagert werden.
Isolierte Thylakide mit eiskaltem 25BTH20G Puffer auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen. Bereiten Sie zwei Röhren für jede Thylakoidprobe vor, um sowohl Beta-DM als auch Digitonin-Lösung durchzuführen. Fügen Sie nun ein gleiches Volumen an Waschmittelpuffer hinzu.
Mischen Sie das Waschmittel und thylakoid Probe sanft mit einer Pipette und vermeiden Sie Luftblasen. Solubilisieren Sie die Thylakoide für zwei Minuten auf Eis für die Beta-DM-Lösung. Oder 10 Minuten bei Raumtemperatur mit kontinuierlich sanftem Mischen auf einer Wippe oder einem Shaker zur Digitonin-Löslichkeit.
Nach der Inkubation das unlösliche Material durch Zentrifugation bei 18 000 g für 20 Minuten bei positiven vier Grad Celsius entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5-Milliliter-Röhre und fügen Sie der Probe 1/10 Volumen Coomassie-brillanten blauen Puffer hinzu. Richten Sie das Gel in einem vertikalen Elektrophoresesystem ein.
Füllen Sie die obere Pufferkammer mit einem blauen Kathodenpuffer und gießen Sie den Anodenpuffer in die untere Pufferkammer. Die Thylakoidproben in die Brunnen laden. Starten Sie die Elektrophorese und erhöhen Sie schrittweise die Spannung, wie im Textprotokoll aufgeführt.
Führen Sie das Gel bei positiven vier Grad Celsius entweder mit einem Kühlraum oder mit einem Kühlsystem die Geltemperatur ein. Ändern Sie den blauen Kathodenpuffer in einen klaren Kathodenpuffer, wenn die Probenfront etwa 1/3 des Gels migriert hat. Nach dem elektrophoretischen Lauf scannen Sie das Gel mit einem Fotoscanner zur Bildarchivierung.
Um 2-SDS PAGE durchführen, montieren Sie das vertikale Elektrophoresesystem mit einem Millimeter Abstandshaltern. Bereiten Sie ein Standard-SDS-Gel mit einem 2D-Kamm vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie die Spur aus dem BN-Gel und legen Sie es in einem Fünf-Milliliter-Rohr.
Dann fügen Sie zwei Milliliter Laemmli Puffer und inkubieren Sie den Streifen für 45 Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Platzieren Sie die Spur mit Hilfe eines Abstandsabstands auf dem Gel, um Luftblasen zu vermeiden. Fünf Mikroliter Molekulargewichtsmarker auf einem schmalen Stück Filterpapier anpfeifen und das Papier in den Standardbrunnen legen.
Um den BN-Gelstreifen und das Markerpapier zu versiegeln, gießen Sie eine 0,5%Agarose in Laufpuffer auf den Gelstreifen und lassen Sie ihn erstarren. Elektrophorese nach Standardprotokollen durchführen. Nach dem elektrophoretischen Lauf visualisieren Sie die Proteine mit SUPRO Ruby Fleck oder Silber färbung.
Repräsentative Ergebnisse von Thylakoid-Protein-Komplexmustern von Beta-DM- und digitonin-solubilisierten Proben werden hier gezeigt. Die kleinen Komplexe wandern während des elektrophoretischen Laufs schneller und befinden sich daher im unteren Teil des Gels. Während sich die großen Komplexe im oberen Teil des Gels befinden.
Digitonin bewahrt proteinkomplexe in größeren Baugruppen in der Regel, während Beta DM die labilen Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den Komplexen stört. Die Untereinheitszusammensetzung von Proteinkomplexen von Beta-DM und digitonin-solubilisierten Thylakoiden wird hier vorgestellt. Die Untereinheiten jedes Komplexes werden aus der vertikalen Linie unterhalb des ausgerichteten Komplexes gefunden.
Grundsätzlich stellt jeder Punkt im 2-D-Gel ein individuelles Protein dar. Aber in der Praxis können mehrere Proteine mit derselben Molekularmasse an einem einzigen Punkt vorhanden sein. Die Identifizierung der Flecken basiert auf einer Massenspektrometrieanalyse.
Nach Anwendung dieses Verfahrens kann man mit anderen Methoden wie Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse der aus dem blauen nativen Gel eluierten Proteinkomplexe fortfahren, um strukturelle Einblicke in die Proteinkomplexe zu erhalten. Um unbekannte Proteinuntereinheiten zu identifizieren, können die einzelnen Proteinflecken aus zweidimensionalem SDS PAGE mit Massenspezifikation analysiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid und Digitonin extrem schädlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
