Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о составе и динамической организации фотосинтетических белковых комплексов в растительной тилакоидной мембране. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить анализ функциональных взаимодействий между отечественными белковыми комплексами и проясняет пластичность организации белкового комплекса в различных условиях окружающей среды. Настройка гель-кастера на 8-сантиметровые на 10-сантиметровые пластины в соответствии с инструкциями производителя с использованием 0,75-миллиметровых промецев.
Поместите градиентный миксер на тарелку для перемешивания и соедините его с перистальным насосом путем трубки. Прикрепите шприц-иглу к другому концу трубки и поместите иглу между стеклянной и алюминиевой пластиной. Поместите магнитный мешалка в тяжелую камеру.
Подготовка 3,5% и 12,5%acrylamide решений в 15-миллилитровых конических центрифуг труб, как подробно описано в текстовом протоколе для использования для разделения гель градиента. Для предотвращения несвоевременной полимеризации держите центрифуговые трубки на льду при подготовке растворов. Добавить 5%APS и TEMED прямо перед pippetting решения градиента смесителя.
Пипетт 12,5%решения для тяжелой камеры. Удалите пузырьки воздуха из канала, соединяющего свет и тяжелую камеру, открыв клапан, соединяющий две камеры, позволяя раствору войти в световую камеру. Закройте клапан и пипетки следы раствора обратно в тяжелую камеру.
Наконец, пипетка 3,5% раствор для световой камеры. Включите магнитный мешалка. Откройте клапаны и включите перистальтический насос.
Разрешить гель решения течь между стеклом и алюминиевой пластины со скоростью потока примерно 0,5 миллилитров в минуту. Игла должна быть выше жидкости во все времена. Когда тяжелые и легкие камеры опустели заполнить их с ультрачистой водой.
И дайте воде аккуратно наложить гель поверхности. Полимеризация геля занимает около одного-двух часов при комнатной температуре. Приготовьте раствор 3%acrylamide для укладки геля при комнатной температуре.
Pipette укладки гель на вершине полимеризованного геля разделения и место образца гель гребень между стеклом и алюминиевой пластины избегая пузырьков воздуха. После того, как гель будет полимеризуться в течение 30-60 минут при комнатной температуре, аккуратно удалите гребень под ультрачистой водой. На данный момент гель может храниться при положительных четырех градусах по Цельсию во влажных условиях в течение нескольких дней.
Разбавить изолированные тилакоиды с ледяным буфером 25BTH20G до окончательной концентрации хлорофилла в один миллиграмм на миллилитр. Подготовь две трубки для каждого образца тилакоида для выполнения как бета-DM, так и оцифровки дигитонина. Теперь добавьте равный объем буфера моющих средств.
Смешайте моющее средство и тилакоид образец осторожно с пипеткой и избежать принятия пузырьков воздуха. Solubilize thylakoids в течение двух минут на льду для бета-DM solubilization. Или 10 минут при комнатной температуре с непрерывным нежным смешиванием на рокере или шейкере для оцифровки солонина.
После инкубации, удалить стелькубилизированный материал центрифугации при 18000 г в течение 20 минут при положительном четыре градуса по Цельсию. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и добавьте в образец 1/10 тома блестящего синего буфера Coomassie. Настройка геля в вертикальной системе электрофореза.
Заполните верхнюю буферную камеру синим катодным буфером и вылейте анодный буфер в нижнюю буферную камеру. Загрузите образцы тилакоидов в скважины. Запустите электрофорез и постепенно увеличивайте напряжение, как у перечислено в текстовом протоколе.
Вы запустите гель при положительных четырех градусах по Цельсию либо с помощью холодного помещения, либо с поправкой на температуру геля с помощью системы охлаждения. Измените синий катодный буфер на четкий катодный буфер, когда передняя часть выборки мигрировала около 1/3 геля. После электрофоретической пробежки сканируйте гель с помощью фотосканер для архивирования изображений.
Для выполнения 2-SDS PAGE соберите вертикальную электрофорезную систему с использованием одномиллиметровых промецев. Подготовь стандартный гель SDS с 2-D гребнем, как описано в текстовом протоколе. Вырежьте полосу от геля BN и поместите его в пятими миллилитровую трубку.
Затем добавьте два миллилитров буфера Laemmli и инкубировать полосу в течение 45 минут с нежной тряской при комнатной температуре. Поместите полосу с помощью спейсера поверх геля, избегая пузырьков воздуха. Pipette пять микролитров молекулярного маркера веса на узком куске фильтровальной бумаги и поместите бумагу в стандартный колодец.
Чтобы запечатать полосу геля BN и маркерную бумагу, залить 0,5%agarose в бегущем буфере поверх полосы геля и дать ему затвердеть. Выполняем электрофорез в соответствии со стандартными протоколами. После электрофоретической перспективе визуализировать белки с SUPRO Ruby пятно или окрашивание серебра.
Здесь показаны репрезентативные результаты тилакоидных белковых сложных моделей бета-ДМ и дигитонин-solubilized образцов. Небольшие комплексы мигрируют быстрее во время электрофоретической пробежки и поэтому находятся в нижней части геля. В то время как большие комплексы находятся в верхней части геля.
Дигитонин обычно сохраняет белковые комплексы в больших сборках, в то время как бета-ДМ мешает половых белково-белковых взаимодействий между комплексами. Здесь представлены подразрядный состав белковых комплексов бета-ДМ и дигитонин-solubilized тилакоидов. Подразделения каждого комплекса находятся от вертикальной линии ниже выровненного комплекса.
В принципе, каждое пятно в 2-D геле представляет собой индивидуальный белок. Но на практике в одном месте может присутствовать несколько белков одинаковой молекулярной массы. Идентификация пятен основана на анализе масс-спектрометрии.
После применения этой процедуры можно продолжить с другими методами, как электронная микроскопия и анализ отдельных частиц белковых комплексов eluted из синего родного геля, с тем чтобы получить структурное понимание белковых комплексов. Для выявления неизвестных белковых субъединых отдельных белковых пятен из двумерных SDS PAGE можно проанализировать с помощью масс-спецификации. Не забывайте, что работа с акриламидом и дигитонином может быть чрезвычайно вредной и такие меры предосторожности, как ношение защитных перчаток, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
