Bu yöntem lösemi hücrelerinde metabolik yol kurulumu ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı canlı hücrelerde gerçek zamanlı olarak primer lösemi hücrelerinin metabolizmasının ölçümü sağlar olmasıdır. PBS'deki bir lösemi hastasından alınan kemik iliği örneğini bire bir oranında seyrelterek başlayın.
Dikkatlice, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde taze hazırlanmış yoğunluk gradyan orta altı mililitre üzerinde seyreltilmiş kemik iliği örnek katman altı mililitre ve yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırın. Mononükleer hücrelerin arayüz tabakasını, santrifüj yıkamaiçin beş mililitre PBS içeren yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe dikkatlice aktarmak için pasteur pipetkullanın. Sonra, sayım için steril PBS iki mililitre mononükleer hücre pelet resuspend.
Mililitre konsantrasyonu başına yedi hücreiçin üç kez 10 hücreleri seyreltin. Ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2 bir 16 ila 24 saat kuluçka için RPMI orta 20 mililitre içeren iki T75 şişeher bir mililitre hücre ekleyin. Bu arada ekstrasellüler akı analizi için plakaları hazırlamak için, iki, sekiz iyi hücre dışı akı analizörü plakaları her kuyuiçine hücre yapışkan çözeltisi 12,5 mikrolitre ekleyin.
20 dakika sonra, hücre yapıştırıcıaspire ve yıkama başına steril su 200 mikrolitre ile her iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, kuyular kuruyana kadar tabakları kaputta bırakın. Sensör kartuşu yla laboratuvar bankına ters yerleştirin.
Akı analizörünün yardımcı plakasını ve sensör kartuşunu ayırın. Ve yardımcı plakanın her kuyuyu 200 mikrolitre kalibrrant ve kuyuların dışındaki her hendekle 400 mikrolitre kalibrrant ile doldurun. Sensör kartuşunu, şimdi kalibran içeren yardımcı plakaya geri döndürün ve kartuş tersini bir gecede CO2 olmadan nemlendirilmiş 37 santigrat derece kuvöze yerleştirin.
Sonra ekstrasellüler akı analizörü açın ve bir gecede 37 santigrat derece sıcak sağlar. Ertesi sabah, merkezleştasyon için şişedeki hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Ve peletleri saymak için uygun deneysel ortamın bir mililitresinde yeniden askıya alın.
Deneysel orta konsantrasyon400 mikrolitre altı hücreye dört kez 10 hücreleri yeniden askıya. Ve akı analizörü plakasının G ile B kuyularına 50 mikrolitre hücre ekleyin. Ve 180 mikrolitre deneysel ortam a ve h kuyularına arka plan kontrol kuyuları olarak.
Santrifüjden sonra yavaş ve dikkatli bir şekilde 130 mikrolitre deneysel ortamı n için G.'den B kuyularına ekleyin ve mikroskop altında her kuyunun dibine hücrelerin kararlı yapışmasını görsel olarak doğrulayın. Daha sonra akı analiz plakasını 30 dakika boyunca CO2 olmadan nemlendirilmiş 37 santigrat derece kuvöze geri verin. Kuluçka süresinin bitiminden 20 dakika önce, bileşikleri tabloda belirtildiği gibi deneysel protokole göre kartuşun uygun enjektör portlarına yükleyin.
Sonra uygun ekstrasellüler akı analizi programı ayarlayın. Programı başlatın ve istendiğinde kalibrant plakasını analiz plakası ile değiştirin. Glikoliz stres testinde, sadece bazal ortam kullanılır, böylece hücreler besinlerden yoksun bırakılır.
Elde edilen ilk parametre hücrelerde depolanan glikoz miktarını yansıtacak bazal asitleşmedir. İlk enjeksiyondan sonra, hücreler glikozu kullandıkça hücre dışı asitleşme hızı artar ve glikozu laktat için fermente edebilir. İkinci enjeksiyonda oligomisin A ATP synthase inhibe ve böylece hücre dışı asitleşme oranı daha fazla yükseklik neden bir glikoliz esas atp üretmek için hücreleri yönlendirir.
2-Deoksi-D-glukoz enjeksiyonu tamamen glikoli ve ekstrasellüler asitleşme oranı düşer inhibe ederken. Hücre mito stres testinde, glutamin ve glikoz ile desteklenen bir orta böylece hücreleri tüm besin yoksun değildir kullanılır. Bazal solunum parametresi bazal metabolik durumlarını yansıtır.
Oligomisin A ile ilk enjeksiyondan sonra, hücreler mitokondriyal solunumu inhibe eder ve oksijen tüketiminde azalma olarak temsil edilen glikolize geçerler. Ancak FCCP'nin ikinci ve üçüncü enjeksiyonları, ATP üretimini solunumdan ayırıyor, böylece hücreler artık maksimum hızda oksijen tüketirler. Ve oksijen tüketimi en yüksek değerine yükselir.
Rotenon ve antimisin son enjeksiyonu Bir karışım tamamen neredeyse sıfıroksijen tüketimi oranını azaltarak mitokondriyal solunum inhibe. Bu prosedürü denerken, lösemi patlamalarının metabolik parametrelerinin sadece ölçülmesini sağlamak için numunedeki patlama ların yüzdesini değerlendirmek önemlidir. Bu yöntem uygulanırken, yetiştirme koşullarına ve veri normalizasyonuna dikkatli bir optimizasyon uygulanmalıdır.
