Bu protokol farelerden birincil melanosit ve fibroblast kültürleri oluşturmak için hızlı ve basit bir yöntem açıklar. Bu teknik epidermis ve dermisin ayrılmasını gerektirmediği için en az eğitimle hızlı ve tutarlı bir şekilde yapılabilir. Bu yöntem kutanöz melanosit ve fibroblast biyolojisi çalışmak için kullanılabilir.
Bu kültürlerde deneyler kanser, yara iyileşmesi ve pigmentasyon kusurları ile ilgili anlayışlar sağlayabilir. Başlamadan önce, gerekli reaktifler hazırlamak ve su banyosu sıcaklığını kontrol ettiğinizden emin olun. Birden çok örneği işlemeyi planlıyorsanız, Tablo Bir'deki reaktif ölçekleme kılavuzuna bakın.
Bu prosedürü gösteren Brandon Murphy, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Bir laminar akış dolabında, kısaca% 70 etanol içeren steril bir Petri çanak her ötenazi li farenin gövde rulo. Fareyi etanolden çıkarın ve boş bir steril Petri kabına yerleştirin.
Sonra, cerrahi makas sterilize 70% etanol. Boyundan başlayıp kuyruk ta devam ederek gövdenin ventral tarafındaki deride bir kesi yapmak için bu makasları kullanın. Steril forceps kullanarak, farenin gövdesinden uzak deri soyma ve cildin dermal tarafında fazla yağ dokusu kaldırın.
1X antibiyotik antimikotik solüsyon üç mililitre içeren altı iyi çanak içine deri, dermis tarafı aşağı yerleştirin. 2-3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Daha sonra, doku helikopterini açın ve ayarları burada gösterilenlere göre ayarlayın.
Doku helikopter bıçağını takarken ve makineyi çalıştırırken dikkatli olun. Deri, dermis tarafı aşağı, steril bir doku helikopter çanak ve doku helikopter üç kez tamamen deri geçmek aktarın. Bundan sonra, steril bir 15 mililitre konik tüp cilt sindirim tampon üç mililitre içeren homojenize cilt aktarın.
P1000 mikro pipet kullanarak, ortaya çıkan süspansiyonu 10 ila 15 kez yukarı ve aşağı boruile karıştırArak karıştırın. Konik tüpü kaplayın ve numuneyi 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir su banyosunda kuluçkaya yatırın, her üç ila beş dakikada bir tüpü ters çevirin. Daha sonra, derideki hücreleri homojenate pelet için beş dakika oda sıcaklığında 750 kez G bir sallanan kova rotor tüp santrifüj.
Peleti rahatsız etmemeye dikkat edin, cilt sindirim tamponuna yavaş ve tamamen çıkmak için P1000 mikro pipet kullanın. Tüm cilt sindirim tampon kapalı aspire emin olun. Eğer sorun yaşıyorsanız, melanosit medya 2-3 mils ile hücre pelet yıkayın ve santrifüj tekrarlayın ve aşırı deri sindirim tampon kaldırın.
Daha sonra bir mililitre melanosit media'da p1000 pipetile 15-20 kez yukarı ve aşağı boru lar atarak hücre peletini iyice yeniden askıya alın. Ortaya çıkan hücre çözeltisi bir mililitre melanosit medya içeren altı kuyulu bir yemekte kaplamasız bir kuyuya akıllıca düşer. 40 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece bir doku kültürü kuluçka homojen kaplama deri kuluçka.
Bundan sonra, önceden yıkanmış kollajen altı iyi çanak kaplı bir kuyuya kaplamasız çanak kültür supernatant aktarın. G-418'i ortama ekleyin, son konsantrasyon mililitrede 100 nanogramdır. Şimdi yapışık fibroblastlar içeren kaplamasız çanak bir kuyuya fibroblast medya iki mililitre ekleyin.
Her iki kültürü de bir gecede doku kültürü kuvözde %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka 16 ila 24 saat sonra, ayrı ayrı medya ve her kültürden herhangi bir enkaz aspire. Her yıkama için bir mililitre PBS kullanarak her yemeği iki kez yıkayın.
Daha sonra, melanosit kültürüne iki mililitre taze melanosit medya ekleyin ve fibroblast kültürüne iki mililitre taze fibroblast media ekleyin. Bu çalışmada fibroblast ve melanosit kültürleri aynı deri örneğinden aynı anda üretilir. Homojenleştirilmiş deri ilk kaplandığında ortam bulutlu görünür.
Ancak, kuluçka dan sonra büyük hücre konglomeraları ve yapışık hücre fibroblastları çanak görünür hale gelir. Kültürden yapışık olmayan hücreler kollajen kaplı bir tabağa aktarılır ve G-418 ile tedavi edilir. G-418 tarafından öldürülen fibroblastlar önümüzdeki beş gün boyunca melanosit kültür ortamında yüzerken görülür.
Kültürde dört ila beş gün sonra, kaplama lı melanositler melanositik granüllerle dendritik fenotip almaya başlarlar. Bu fenotip geçerken devam eder, keratinositleri kirleten kümeler kaybolur. Ortaya çıkan melanosit ve fibroblast kültürlerinin saflığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanır.
Melanosit belirteci GP100 ekspresyonu melanosit kültürlerine özgüdür, fibroblast belirteci FSP1 ise sadece primer fibroblastlarda bulunur. Kontrol C59 keratinosit hücreleri keratinosit belirteci için pozitif leke tek kültürler, K14. Zenginleştirilmiş melanosit kültürleri oluşturmak için ne kadar sürdüğünü belirlemek için ek analizler yapılır.
GP100 pozitif hücreler kültürde 10 gün sonra dördüncü gün ve zirve görünmeye başlar. Bu prosedür hızla in vitro ve yüksek iş omik tahliller çeşitli melanosit ve fibroblast kültürleri oluşturmak için kullanılabilir.
