Name: high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry
Uploaded: 2018-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry at JoVE.com

Tıbbi Araştırma Konseyi UK (U105115237) RRK için finansman çekirdek için teşekkür ediyoruz.

1. hücre ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Hücreleri ya SM ağar kaplamalar Klebsiella aerogenesgibi bakteriler ile birlikte veya HL5 gibi besin Orta tarihinde açıklanan23yetiştirmek. Not: kusurlu macropinocytosis bakteri içinde nakavt mutantlar büyüyen macropinocytosis oranını artırabilir ikincil mutasyonların birikimi önlemek yardımcı olur. En iyi sonuçlar için hisse senedi hücrelerden kaplama sonra geçiş sayısını 4 aşağıda tutun. Mutantlar donmuş hisse senetleri en kısa zamanda yalıtım sonra muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>SM ağar kaplamalar hücrelerdeyse yetiştirmek için K. aerogenes izdiham SM ortamda büyümeye. 200 – 300 μL bakteri bir SM agar plaka üzerine ekleyin ve yayıldı. Bir kısır döngü hücre (başka bir bakteriyel tabaktan aktarırken) almak ve plaka bir kenarında yayıldı. Bir haftaya kadar 22 ° c için kuluçkaya.</li>
	<li>Tetra-metil-rodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran 50 mg/ml suda çözülür, 1 mL aliquots 0,22 mikron filtre kullanarak filtre uygulama ve -20 ° C'de depolayın Aliquots süresiz olarak saklanır. Not: 155 kDa bu yöntemle, rezervasyon yaptırın toplu olarak satın alınabilir, ama daha küçük dextrans macropinocytosis Dictyostelium24yılında sadece etkili tedbir olarak kullanılan tipik boyutudur. Farklı fluorophores gerekiyorsa art arda sıralı mavi veya Alexa-647, gibi farklı quenchable sigara dextrans alternatifleri vardır.</li>
</ol>2. dönüştürmek içine nicel nitel ölçümleri (isteğe bağlı)
<ol><li>
Bir sıvı alımını tahlil süspansiyon hücrelerde kullanarak gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Axenically büyüyen hücreler 300 x g 3 dk de cips, süpernatant atmak ve besin orta 1 x 107 hücre/mL olarak resuspend. TRITC-dextran 0,5 mg/mL için eklemek ve 180 rpm, 22 ° c sallamak</li>
		<li>Örnekleri 0.7 mL buz gibi KK2 , 0, 30, 60, 90, 120 dk. yıkama içine bir kez buz gibi KK2 arabellek23 ' te benchtop santrifüj 1,5 ml, 1 ml içinde aynı tampon resuspend ve buz üzerinde depolamak 0.8 mL seyreltik. Not: hemen veya tüm örneklerini topladıktan sonra yıkama eşdeğer sonuçlar verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cilt hücreleri tarafından içselleştirilmiş sıvı belirleyin.
	<ol>
<li>Floresan bir uyarma dalga boyu 544 nm ve emisyon dalga boyu 574 kullanarak ölçmek için fluorimeter ayarla nm 10 nm kesilmiş. TRITC-dextran seyreltme serisi ayarladıysanız ve floresan için verilen ölçmek için kullanabilirsiniz dextran hacimleri. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.</li>
		<li>Bölüm 2.1 hücre süspansiyon 0.9 mL kullanarak hücreleri tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Kalibrasyon eğrisi24kullanarak hücre başına içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her zaman noktasına ayrı olarak 0.5 mL buz soğuk KK2hücrelerden kalan sulandırmak. 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL polistren akış sitometresi tüpler içine filtre. Her zaman noktası hücrelerden birbirinden farklı ve onların floresans kayıt akış sitometresi ayarlayın (3.4 ve 3.5 bölümlerine bakın).</li>
	<li>Yukarıdaki ayarları kullanarak akış sitometresi kalibrasyon boncuklar floresans ölçmek ve kaydedebilirsiniz. Not: Bu akış sitometresi üzerinde tüm gelecekteki floresans ölçümler için referanstır: tekrar kullanmadan önce boncuk çalıştırın ve öylesine onlar-si olmak aynı floresans ayarlarını yapın. Bu çok dar tanımlı en yüksek verecektir. Bir kapı floresans tepe etrafında koyarak bu kolaylık sağlar.</li>
	<li>Üç kez tekrarlayın ve bölümlerde 2.2 ve 2.3 birbirlerine karşı elde edilen hücre floresans verileri çizmek. En uygun bir çizgi çizmek ve denklemi nitel veri akış sitometresi nicel birimlerine dönüştürmek için kullanın.</li>
</ol>3. ölçme sıvı alımı
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> Şekil 1: macropinocytosis yüksek üretilen iş ölçüm şematik. (A) Grow Dictyostelium bir SM plaka numaralı seribaşı ile K. aerogenes bakteri (sarı). Zaten Gelişmiş hücre kaçınarak hücrelerden besleme açık (turuncu), (yeşil), KK2 arabellek 25 mL hasat. Ayırmak için girdap tarafından 3 dk aralıklarla 300 x gde cips, sonra 3 kez 50 mL KK2 arabelleği, her zaman süpernatant atarak yıkayın. 1 x 105 hücre/ml HL5 büyüme orta resuspend ve 50 µL örnek bir düz dipli 96-şey plaka başına üç kuyu içine ekleyin. 22 ° c 24 h için (B) seyreltik TRITC-dextran 1 mg/ml HL5 büyüme orta olarak 50 mg/mL stok bir çözümden kuluçkaya. 50 µL (0 dak alımını kontrol wells hariç) her örnek ekleyin ve sonra hangi dextran 0 min alımı denetimine ekleyin 22 ° c için 1 h, kuluçkaya. (C) hemen medya dikkatle boşaltmak, plaka üzerinde aşırı orta kaldırmak ve banyo yıkamak için kuyu doldurma buz gibi KK2 arabellek daldırın bir doku pat. Arabellek dikkatle boşaltmak ve yine kuru pat. 5 mM sodyum azid KK2' hücreleri ayırmak için MC çözünmüş 100 µL ekleyin. Akış Sitometresi içselleştirilmiş floresans ölçümü için almak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>
Bir düz oturaklı 96-iyi doku kültürü tabak (Şekil 1A) ayarlayın. Hücreleri bakteri ve onları daha önce tahlil; 24 h HL5 Orta (içeren 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampisilin ve 50 µg/mL sefaloridin) aktarmak için kullanma Bu upregulated bakteri24tarihinde yetişkin hücrelerinde görülen düşük düzeylerde olmak macropinocytosis sağlar. Alternatif olarak, doğrudan axenic kültür hatalar farklı yoğunlukları seyreltilmiş hücreleri nedeniyle azaltmak için tahlil önce 24 h için kuluçka, hücrelerden oranında seyreltin.<ol>
<li>Hasat hücrelerden besleme ön KK2 50 mL santrifüj tüpü 25 mL içine. Hücreleri vortexing ve 300 x g 3 dk.. için de pelet tarafından ayırmak Süpernatant atmak, Pelet resuspend ve 300 x g KK2her zaman bakteri kaldırın süpernatant atarak, 3 dk 50 ml için de 3 kere yıkayın.</li>
		<li>(Bir hemacytometer veya diğer hücre sayım sistemi kullanarak) hücre yoğunluğu belirlemek ve içine HL5 içeren antibiyotikler 1 x 105 hücre/ml seyreltik. 50 μL her kuyuya pipet üç kuyu her koşul için kullanma. 22 ° c 24 h 0 min alımı denetimi ayarlamak için anımsa için kuluçkaya. Not: Bir alternatif orta, Örneğin SIH, VL6-ebilmek var olmak kullanılmış onun yerine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreler ile TRITC-dextran (Şekil 1B) yükleyin.
	<ol>
<li>1 mg/ml kullanılan orta dextran seyreltik (Bu 2.5-5 mg/mL için çok düşük alımı hücrelerle değerlendirirken artırılabilir). 50 μL (0,5 mg/mL TRITC-dextran son bir konsantrasyon vererek) her şey eklemek ve plaka 22 ° C için 1 h, bu önemli dextran birikimi sağlar ancak dextran ekzositozu henüz başlamamış gibi geri dönün. Not: hata azaltarak daha hızlı yapılması için bu adımı tekrarlayıcı pipet sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreleri akış sitometresi (Şekil 1 c) için hazır olun.
	<ol>
<li>Hemen yıkama önce 0 min alımı denetimlere 50 μL dextran içeren medya ekleyin.</li>
		<li>Orta dikkatle boşaltmak ve bir doku üzerinde kuru pat. Buz gibi KK2plaka batış tarafından yıkayın, sonra dikkatle boşaltmak. Not: bazı suşları bağlılık kusurları ile bu adım sırasında Örneğin her iki Talin homologs nakavt müstakil hale (talA-/ talB -)25. Kötü iliştirin ve gerekirse medya Aspire hücre hatları ile çalışırken dikkatli olun.</li>
		<li>Buz gibi 5 mM sodyum azid KK2' MC (KK2 + 2 mM MgSO4 ve 100 mikron CaCl2) çözünmüş 100 μL ekleyin. Dikkat: Sodyum azid son derece zehirlidir. Toz maskesi ve koruyucu gözlük tozu ile çalışırken kullanın. Her zaman eldiven ve önlük giymek. Isı önlemek ve asit ile birlikte kullanmayın. Not: Hücreleri hızla ayırmak ve ekzositozu EngellediBRÜKSEL24' tür. Mikroskop bunu denetlemek için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış Sitometresi tarafından ölçü sıvı alımı
	<ol>
<li>Eğer mutlak olanlar için göreli değerleri dönüştürmek planlama, boncuk (bkz: 2) akış sitometresi ayarları standart hale getirmek için kullanın. Alternatif olarak, kullanım hücreler olarak bölümde ileri dağılım ve yan dağılım uygun şekilde hücreleri (Şekil 2A), makine bloke değildir, sağlanması yalıtmak için ayarlandığından emin olmak için 2 dextran (Şekil 2B) yüklü ve parametrelerini ayarlamak içselleştirilmiş Floresan (Şekil 2C) ölçmek.</li>
		<li>Sistem yüksek üretilen iş örnekleme ekleyin ve plaka ekleyin. (TRITC-dextran kullanmak için sarı-yeşil lazer heyecanlandırmak ve 582 nm kanal veya benzer ölçmek için) Floresan ölçmek için bir protokol hazırlamam ayarla, 65 μL hücre süspansiyon ve Çalıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akış Sitometresi sonuçlarını analiz
	<ol>
<li>İleri dağılım ve yan dağılım (Şekil 2A) kullanarak hücreleri kapıda. Ortalama floresans İstatistikler seçeneğini kullanarak hücre hesaplama. Bir örnek kullanarak bu parametreleri ayarlayın ve tüm örnekleri için geçerlidir. Not: İleri dağılım/yana dağılım profilleri farklı mutantlar veya inhibitörleri kullanıldığında örnekleri arasında değişebilir.</li>
		<li>Her koşul için üç kuyular ortalamasını belirlemek ve 0 dk alımını kontrol çıkarın. Ya 2 bölümünde belirlenen denklemi kullanarak sayısal değerleri dönüştürmek veya denetime normalleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. performans gösteren sıvı alımı zaman-Dershaneler
<ol><li>Hücreleri olarak bölümde 3, üç kuyular için her zaman nokta ve zorlanma/koşulu ile ayarlayın.</li>
	<li>Dextran etiketli orta farklı wells için sırayla ekleyin. Tipik bir zaman ders sıvı alımını ölçer 0, 30, 60, 90 120 ve 180 dk. 60 dk sonra kuyular için 120 dk süresi noktası ekleyerek takip 180 dk zaman noktası kuyuları için orta dextran içeren eklemek vb (Şekil 3A).</li>
	<li>0 dk az 50 μL dextran içeren eklemek orta ve hemen dikkatle boşaltmak ve plaka 3.3 bölümde olduğu gibi yıkayın. 3.5 bölümünde açıklandığı gibi analiz.</li>
</ol>5. doz yanıt eğrileri
<ol><li>Hücreleri bölümünde 3, üç kuyular için her zorlanma ve koşulu ile açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
	<li>Bileşik faiz bileşik Çift istediğiniz maksimum son konsantrasyon , 1 mg/mL dextran içeren orta içine oranında seyreltin. Araç aynı oranda ilk olarak ile dextran ile orta içeren ikinci bir tüp hazırlayın. Girdap karıştırmak için.</li>
	<li>Örnek (Şekil 4A) başına orta içeren 200 μL dextran ilgi bileşik seyreltme serisi oluşturmak. Girdap karıştırmak için. Her örnek 1 h için iyi orta 50 μL ekleyin.</li>
	<li>Yıkama ve bölümde 3.3 itibaren açıklandığı gibi analiz.</li>
</ol>6. fagositoz ve membran alımı
<ol><li>Membran alımını ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi hücreleri hazırlayın. 20 mikron FM 1-43 için 10 mikron son bir konsantrasyon içeren orta 50 μL ekleyin. Yükleme sonra yıkayın ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hücreleri hazırlamak. 585 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek. Not: membran kaçakçılığı sıvı fazlı daha hızlı olduğundan, 10 min 1 h26' dan kullanmak için bir daha uygun zaman noktasıdır. Yalnızca membran dahil zaman bulabilsem alternatif boya yerine kullanılabilir.</li>
	<li>
Fluorescently etiketli boncuk veya bakteri fagositoz ölçmek için kullanın. Gibi onlar ayrılmaz Dictyostelium tarafından ileri gelen ve yan dağılım24floresan Maya kullanılamaz. Hücreleri 3 bölümde açıklandığı gibi ayarlayın ve açıklanan27analiz.<ol>
<li>Fagositoz boncuk ekleyin sarı-yeşil etiketli bölümde 5 x 107 boncuk/mL (1,75 ve 2 mikron) veya 1 x 108 boncuk/mL (1 ile 1,5 mikron) 3.2 son bir konsantrasyon için 1 h için yıkama ve akış sitometresi anlamında hazırlama önce açıklandığı gibi boncuk ölçmek için Bölüm 3.3. 525 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek. Not: Daha yüksek konsantrasyonlarda hücre dekolmanı götürecek.</li>
		<li>Fagositoz bakterilerin ölçmek için Texas-kırmızı etiketli Escherichia coli bioparticles Bölüm 3.2-1 x 108 bakteri/mL 1 h için yıkama ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hazırlama önce açıklandığı gibi ekleyin. 610 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için sarı-yeşil lazer kullanarak ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bloomfield, G., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+abuses+of+macropinocytosis.">Uses and abuses of macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocompatibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).</li><li>Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+typhimurium+encodes+an+activator+of+Rho+GTPases+that+induces+membrane+ruffling+and+nuclear+responses+in+host+cells.">S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells.</a> Cell. 93 (5), 815-826 (1998).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).</li><li>Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-phase+uptake+by+macropinocytosis+in+Dictyostelium.">Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium.</a> Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).</li><li>Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+ruffle+formation+and+closure+lead+to+macropinocytosis+in+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor-treated+cells.">Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells.</a> European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).</li><li>Buczynski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+two+Dictyostelium+discoideum+genes,+DdPIK1+and+DdPIK2,+encoding+proteins+related+to+mammalian+phosphatidylinositide+3-kinases,+results+in+defects+in+endocytosis,+lysosome+to+postlysosome+transport,+and+actin+cytoskeleton+organization.">Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization.</a> Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).</li><li>Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+the+completion+of+macropinocytosis+and+phagocytosis+by+macrophages.">A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).</li><li>Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+metabolism+during+membrane+ruffling+and+macropinosome+formation+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells.</a> Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).</li><li>Clark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+uses+ether-linked+inositol+phospholipids+for+intracellular+signalling.">Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling.</a> The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).</li><li>Hoeller, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+functions+for+PI3-kinases+in+macropinocytosis.">Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> Elife. 5, e20085 (2016).</li><li>West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+is+required+for+constitutive+macropinocytosis+by+dendritic+cells+but+does+not+control+its+downregulation.">Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation.</a> Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+fusion+and+microtubule-based+dynamics+in+the+early+endocytic+pathway+of+Dictyostelium.">Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium.</a> Traffic. 3, 791-800 (2002).</li><li>Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12-induced+macropinocytosis+modulates+two+distinct+pathways+to+activate+mTORC1+in+macrophages.">CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).</li><li>Rivero, F., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+microscopic+methods+for+studying+the+endocytic+pathway.">Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway.</a> Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).</li><li>Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+mutants+with+temperature-sensitive+defects+in+endocytosis.">Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).</li><li>Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2015:+Expanding+data+and+annotations+in+a+new+software+environment.">dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment.</a> Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).</li><li>Williams, T. D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+macropinocytosis+during+Dictyostelium+growth+and+development.">The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Tsujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+two+talin+homologues+in+Dictyostelium.">Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium.</a> Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).</li><li>Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulation+of+the+plasma+membrane+in+Dictyostelium.">Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).</li><li>Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+phagocytosis+and+phagosome+maturation.">Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).</li><li>Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Dictyostelium+RasGEF+is+required+for+normal+endocytosis,+cell+motility+and+multicellular+development.">A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development.</a> Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).</li><li>Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mroh1,+a+lysosomal+regulator+localized+by+WASH-generated+actin.">Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin.</a> Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).</li><li>van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+cells+with+a+depolarized+plasma+membrane+potential.">Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential.</a> Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).</li><li>Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+myosin+I+double+mutants+exhibit+conditional+defects+in+pinocytosis.">Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+uses+macropinocytosis+and+apoptotic+mimicry+to+enter+host+cells.">Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells.</a> Science. 320 (5875), 531-535 (2008).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Sıvı alımını değerlendirmek için diğer yöntemleri iş hızı düşük ise, hücre içinde in situ ve hücreleri ayırmak için sodyum azid kullanımı yıkama macropinocytosis, membran alımı, yüksek üretilen iş ölçümü sağlayan kritik bu yöntemde adımlardır veya fagositoz tarafından Dictyostelium. Hücreleri bir yüzeye bağlı olan ve orta değil gibi onlar Orta çevrelerindeki ilk kapalı atılmış ise sol bağlı ve arabellek daldırma tarafından değiştirildi ve yine kapalı atılmış. Hangi hücresel ATP tüketir ve membran30depolarizes, sodyum azid sonra hücreleri ayırmak için kullanılan ve aynı zamanda hücre canlılığı24etkilemeden ekzositozu önler.
Macropinocytosis Dictyostelium tarafından ölçmek için akış sitometresi kullanarak sıvı alımı çok hassas bir ölçüm çok hızlı bir şekilde belirli zorlanma veya koşul sıvı alımı, neden değiştirdi neden kurmak için verir iken soruşturma kullanarak daha fazla Mikroskopi gerekli24' tür. Bu aynı zamanda daha önce yayımlanmış sonuçlar bazı durumlarda, sıvı alımını bir fark göstermiştir mutant suşları ya (Bu durumda), olduğu gibi bir yüzey üzerinde yetiştirilen tarafından unutulmamalıdır veya süspansiyon (olduğu gibi standart iletişim kuralı)31sallayarak. Bu yöntemi kullanarak nadir de olsa bazen belirgin sıvı alımını kusurları cevapsız, anlamına gelebilir. Ayrıca, ne zaman fagositoz ölçme, sadece düşük konsantrasyonlarda parçacıkların kullanılabilir. Fagositoz suşları ve koşullar24arasında ilgili farklılıklar ölçmek mümkün olmasına rağmen en fazla bu tekniği ile tespit edilebilecek fagositoz kadar gerçek maksimum oranıdır. Fagositoz en yüksek hızı belirlemek için alımını süspansiyon sallayarak bir alternatif iletişim kuralı27tarafından ölçülen gerekir. Bunun için buna göre akış sitometresi ayarlarken düzeltilmesi gerektiğini bu yüzden boncuk fagosite hücreleri yan dağılım, artmıştır.
Akış Sitometresi memeli hücreleri32içinde sıvı alımını ölçmek için kullanılabilir, ancak sıvı yüksek oranda aşama alımı endositik diğer yolları tarafından Dictyostelium görülen bir sorundur. Ayrıca, hücreleri genellikle daha fazla içselleştirilmiş dextran endositik ilerlemesini sağlayan 37 ° C'de tripsin kullanarak ayrılır. Buz gibi sodyum azid makrofajlar bu teknik daha fazla optimizasyon olmaksızın memeli hücreleri için geçerli değildir yapma (Williams, yayınlanmamış gözlem) bir yüzey, ayırmak neden olmaz.
Yüksek işlem hacmi ölçümü macropinocytosis inhibitörleri, genetik mutasyon veya gen nakavt etkileri Dictyostelium hücrelerde için hızlı ve ucuz ekran için kullanılan potansiyeline sahiptir. Mutantlar her zaman onların doğrudan üst'e sadece karşılaştırılmalıdır. Okuyucu Dictyostelium zorlanma için önceden hiçbir tercih varsa, axenic sigara suşları DdB veya NC4 gibi daha "vahşi axenic olanlardan daha tipi" ve axenic suşları33olarak etkili bir şekilde manipüle edilebilir. Aksi takdirde, Ax2 suşları axenic olan suşları ile iken Ax4 birçok suşu Talin A altını gizleme ve olması gereken en az sayıda genom mükerrer34, kaçınılması mümkünse23. Daha önce yayımlanmış suşlarının en Dicty stok Merkezi35sipariş edilebilir.
Bu teknik daha önce farklı koşullar, inhibitörleri ve mutasyonlar macropinocytosis Dictyosteliumtarafından üzerinde etkileri içine mümkün olandan daha fazla araştırma olanakları sağlar.

Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından birkaç biyolojik bağlamlarda1' de, önemli olan antijen örnek bağışıklık yanında da dahil olmak üzere hücreleri2, patojen giriş ana hücreleri içine3, kanser hücre proliferasyonu4 ve prion hastalıkları5/ yayılıyor. Memeli ve Dictyostelium hücreleri, aktin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (lipid kesin yapısını iki11arasında farklı olsa da), aktif Her ne kadar orada kalır macropinocytic yama nasıl hakkında cevaplanmamış birçok soru Ras12,13ve aktif Rac14,15 macropinocytosis tarafından verimli sıvı alımı için önemlidir. , organize ve sonunda içselleştirilmiş kurdu. Macropinocytosis daha kapsamlı bir anlayış vermek daha fazla protein macropinocytosis ve çeşitli biyolojik bağlamlarda nasıl önemliler sonraki belirlenmesi için önemli keşfetmek ve gelişmesine olanak sağlayabilecek koşullar bir dizi için hedeflenmiş tedaviler.
Dictyostelium macropinocytosis okuyan bir ideal modeli sistemidir. Standart laboratuar suşları bünye macropinocytosis yüksek düzeyde o sıvı alımı üzerinde macropinocytosis6nedeniyle % 90'ı demektir. Bu sadece memeli hücreleri macropinocytosis nedeniyle sıvı alımı oranı çok daha düşük nerede farklı olarak sıvı alımını belirlenerek ölçülecek macropinocytosis sağlar. Macropinocytosis çok iyi tanımlanmış ve bu sistemde kolayca görüntülenmeyecektir12 benzer şekilde sunan soruşturma için farklı avantajlar çekirdek macropinosome korunmuş bileşenlerinin diğer sistemleri üzerinde olabilir yerde birden çok düzenleyici sinyaller 16 , 17.
Macropinocytosis ölçmek için memeli hücreleri tarafından kullanılan standart teknik dextran pozitif veziküller18tarafından işgal bir hücre alanı belirlemek için mikroskobu ardından kısa bir süre için dextran ile darbe sonra hücreleri tamir içerir. Bu teknik ancak Dictyostelium19' bildirdi ve sadece tek uçak hücrenin içselleştirilmiş birim anlamı dikkate alır hücre, girdikten sonra daralma macropinosomes olasılığı için hesaba katmaz belli değil. Belirli bir süre içinde içselleştirilmiş macropinosomes sayılması alternatif bir tekniği, aynı downsides20vardır. Dictyostelium kullanarak bu sorunları önler; Ancak, Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçmek için varolan teknikleri nispeten hücreleri ve dextran21emek yoğun, büyük bir kullanarak miktarı vardır. Hücreleri yüksek yoğunluklu floresan dextran ve çeşitli noktalarda zaman-bir fluorimeter kullanarak içselleştirilmiş floresans tespiti için kaldırıldı örnekleri sarsıldı. Her ne kadar bu düşük işlem hacmi kalır bu şekilde hazırlanan hücreleri tek hücre, tercihan--dan nüfus düzeyi, çözünürlük22, kazanmak için akış sitometresi tarafından çözümlenebilir.
Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu. Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Bu yöntem yukarıdaki yöntemleri sınırlamalarının üstesinden gelir ve daha az kaynak kullanarak ve işçilik dahil azaltarak eşzamanlı suşları/koşullar çok sayıda sıvı alımını karşılaştırılması izin vermek için tasarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>LSR_II flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td></tr><tr><td>TRITC-dextran (155 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287</td><td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td></tr><tr><td>HL5 medium</td><td>Formedium</td><td>HLGCFG</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td></tr><tr><td>Dihydrostreptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1517</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Formdium</td><td>AMP50</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin monosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>VWR</td><td>103694M</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate hydrate</td><td>VWR</td><td>25169.295</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>VWR</td><td>1.02382.0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phopshate</td><td>VWR</td><td>1.04877.1000</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>1.05104.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>LS 50 B</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Thermofisher</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>09719-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>17687-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>09847-5</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; bioparticles</td><td>Thermofisher</td><td>E2863</td><td></td></tr><tr><td>Flow-set fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607007</td><td>Calibration Beads</td></tr><tr><td>SM agar</td><td>Formedium</td><td>SMACFG</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Elkay Laboratory Products</td><td>E25-PS22-50S</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom polystyrene tubes</td><td>Corning</td><td>352058</td><td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Repeating pipette</td><td>Eppendorf</td><td>M4-SK</td><td></td></tr><tr><td>5 mL repeating pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>30089650</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>70920</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından bazı kanser hücreleri, antijen örnekleme, konak hücre işgali ve nörodejeneratif hastalıkların yayılması yayılması için önemlidir. Amip Dictyostelium discoideum yaygın olarak kullanılan laboratuar suşları hangi yüzde 90'ını macropinocytosis nedeniyle bitti besin ortamda büyüdü son derece yüksek sıvı alımını oranlarına sahip. Buna ek olarak, birçok memeli macropinocytosis bilinen çekirdek bileşenlerinin da macropinocytosis çalışmak için bir mükemmel model sistem yapım mevcuttur. Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu.
Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Yöntem aynı zamanda membran alımı ve fagositoz floresan boncuk veya bakteri ölçmek için adapte edilebilir.
Bu yöntem yüksek üretilen iş, emek ve kaynak verimli şekilde Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçümü izin vermek için tasarlanmıştır. Birden fazla suşları (Örneğin bir genin nakavt mutantlar) ve koşullar aynı anda karşılaştırma sağlar(hücreleri farklı medya veya inhibitörü farklı konsantrasyonları ile tedavi) paralel ve zaman-Dershaneler kolaylaştırır.

Bir kez gerçekleştirilen teknik ve hücreleri dextran ile dolu ve analiz (Şekil 1) için akış sitometresi engellenmiş değil emin olmak ve Şekil 2Agösterildiği hücreler gibi bakmak için ileri dağılım/yana dağılım profili ayarlayın. Makine engellenmişse, daha böyle gösterildiği 2B şekil -ecek bakmak ve devam etmeden önce engellenmemiş olması gerekir. Parametrelerini göster denetim axenic hücreleri var uzun zaman noktalarda yüksek içselleştirilmiş dextran floresans ve daha kısa olanları, düşük içselleştirilmiş floresans sağlamak (Şekil 2C).
Mutantlar arasında farklılıklar ararken, bir üç fenotipleri olacağını muhtemeldir. Mutantlar normal sıvı alımı olabilir, kısmi bir kusur olabilir veya sıvı alımını tamamen kaldırılmış olabilir. Şekil 2B bir gerilme ile normal sıvı alımı, gösterir bu durumda Standart laboratuvar gerginliği Ax2, bir mutant bir ~ %50 ile azaltmak sıvı alımı (Ax2 rasG-14) ve bir ile sıvı alımı (Ax3 gefB-28) kaldırılmış. Ortalama medyan sıvı alımı (Bölüm 3.5) elde etmek ve ( Şekil 3Bolduğu gibi) içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak veya bir denetime verileri karşılaştırmak için kullanabilirsiniz ( Şekil 4B olduğu gibi ve 4 C).
Şekil 3A, olduğu gibi bir sıvı alımını zamanlı kurs gerçekleştirirken içselleştirilmiş floresans 60-90 dk için sonra exocytosed dextran başlar, artması gerektiğini ve bir plato (Şekil 3B) ulaşılır. 60 dk macropinocytosis farklı mutantlar/koşullarda bu nedenle ulaşılması için iyi bir sinyal verir ve sinyal yok ekzositozu nedeniyle kayıp olduğunda standart saati noktası olarak kullanarak. Mutantlar nerede ekzositozu ciddi engel bir plato29ulaşmak için daha uzun sürebilir.
Ne zaman tedavi Dictyostelium ( 4A rakamolarak ayarlanır), macropinocytosis karşı etkilidir inhibitörleri ile 1s içinde içselleştirilmiş dextran hücreleri aşağı hemen hemen hiçbir şey, çoğu durumda daha yüksek inhibitörü konsantrasyonlarda gidecek (Şekil 4B). Bazı inhibitörleri % 100 etkili olmayabilir, ancak, Örneğin nocodazole sadece akut eklendiğinde macropinocytosis tarafından sıvı alımını % 50'engeller (Şekil 4 c). İnhibitörleri etkili değilse, hücreler dextran denetim olarak benzer bir miktar içselleştirmesi ve floresan bir düşüş değil görülecektir. Bu teknik çok sayıda farklı inhibitörleri ve sıvı alımını üzerindeki etkileri için macropinocytosis tarafından çok hızlı bir şekilde taranması için inhibitör konsantrasyonlarının inhibitörü tedavisi en iyi duruma getirme harcanan zamanı azaltır sağlar.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> Şekil 2: Akış Sitometresi ve temsilcisi veri kümesi kadar. (A) hücreleri kolayca ayırt edilebilir böylece ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) profilleri hücre ayarlanmalıdır. Ax2 hücreleri görünmelidir nasıl bir örnek gösterilir. (B) akış sitometresi engellenmişse, bu örnekte olduğu gibi çok düşük dağılım hücreleri var. Lazer fluorophores düzgün heyecanlandırmak değil ve devam etmeden önce makine unblocked olmalıdır. Herhangi bir veri iken makine engellendi elde atılmalıdır. (C) böylece 0 min alımı örnek hücreleri için inkübe bağlandığınızda artırır düşük floresan, floresans Williams & Kay 201824alınan bu örnekte gösterildiği gibi floresan ortamda uzun ayarlanması gerekir. (D) örnekler ile normal macropinocytosis (Ax2, yeşil), 1 h için TRITC dextran ile inkübe hücre macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, turuncu) azaltılmış ve macropinocytosis (Ax3 gefB -kaldırıldı HM177628, mavi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> Şekil 3: 96-şey levha sıvı alımı zaman-Dershaneler gerçekleştirme. (A) Dextran var olmak mülhak her el örnekleri için sırayla, aynı bitiş saati ile. Sonra yıkayın kuyuları, ayırmak ve akış sitometresi tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Örnek kez dextran eklemek için burada gösterilir. (B) sıvı alımı zaman-ders Ax2 hücre 96-şey levha gerçekleştirilen. Williams & Kay 201824alınan, hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> Şekil 4: sıvı alımı doz yanıt eğrileri. (A) ilgi 1 mg/mL TRITC-dextran, Çift Kişilik istenen son maksimum konsantrasyon içeren bu durumda PI3K inhibitörü LY294002, HL5 için bileşik ekleyin. HL5 büyüme orta + 1 mg/mL dextran araç yalnız koşul başına 200 µL orta seyreltme dizi oluşturmak için çeşitli oranlarda içeren ile karıştırın. Kuyu 1 h için normal olarak yıkama ve içselleştirilmiş floresans ölçme önce ekleyin. (B) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için aLY294002 içeren orta ile inkübe. Williams & Kay 201824uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. (C) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için nocodazole ile inkübe. Williams & Kay 201824uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry at JoVE.com

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

high-throughput-measurement-dictyostelium-discoideum-macropinocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K Görüntüleme.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.

Video: High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Biyoloji

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.

Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Sinaptik Materyallerin Mikroglial Yutulması için Akış Sitometrisi Tabanlı Testler

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Yazar Spotlight: Psikonöroimmünolojide Teknolojik Yenilikler Yoluyla Anlayışı Geliştirme

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Nörobilim

Quantitative Assessment of Macropinocytosis in mTORC1-Hyperactive Cells using Flow Cytometry

Macropinocytosis is a highly conserved, actin-dependent endocytic process that allows the uptake of extracellular material, including proteins and lipids. In proliferating cells, macropinocytosis can deliver extracellular nutrients to the lysosome, processed into critical macromolecule building blocks. Recent studies have highlighted the dependence of multiple cancers on macropinocytosis, including breast, colorectal and pancreatic cancer. Ras mutations are thought to be the driver events behind macropinocytosis initiation, leading to the activation of cellular anabolic processes via the mTORC1 signaling pathway. Interestingly, mTORC1 can also be activated by macropinocytosis independently of Ras. Therefore, macropinocytosis represents a metabolic vulnerability that can be leveraged to target macropinocytic tumors by limiting their access to nutrients therapeutically.
In Tuberous Sclerosis Complex (TSC) and Lymphangioleiomyomatosis (LAM), mTORC1-hyperactivation leads to enhanced macropinocytosis and metabolic reprogramming. Here, we describe a flow cytometry-based protocol to assess macropinocytosis in mammalian cells quantitatively. TSC2-deficient MEFs are employed, which exhibit aberrant activation of mTORC1 and have been shown to have increased macropinocytosis compared to TSC2-expressing cells. Cells treated with pharmacologic inhibitors of macropinocytosis are incubated with fluorescently labeled, lysine-fixable, 70 kDa dextran, or fluorescently labeled bovine serum albumin (BSA) assayed by flow cytometry. To date, robust image-based techniques have been developed to quantitatively assess macropinocytosis in tumor cells in vitro and in vivo. This analysis provides a quantitative assessment of macropinocytosis in multiple experimental conditions and complements existing image-based techniques.

<meta charset="utf8"></head><body>mTORC1-Hiperaktif Hücrelerde Makropinositozun Flow Sitometri Kullanılarak Kantitatif Değerlendirilmesi

This protocol provides experimental tools to evaluate macropinocytic uptake of nutrients (carbohydrate and protein) by mTORC1-hyperactive cells. Detailed steps to quantify the uptake of fluorescently labeled dextran and bovine serum albumin (BSA) are described.

mTORC1-Hiperaktif Hücrelerde Makropinositozun Flow Sitometri Kullanılarak Kantitatif Değerlendirilmesi

Macropinocytosis is a highly conserved, actin-dependent endocytic process that allows the uptake of extracellular material, including proteins and lipids. ...

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

mTORC1-Hiperaktif Hücrelerde Makropinositozun Flow Sitometri Kullanılarak Kantitatif Değerlendirilmesi

mTORC1-Hiperaktif Hücrelerde Makropinositozun Flow Sitometri Kullanılarak Kantitatif Değerlendirilmesi