The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

NOT: daha önce yayınlanan çalışma 12 kullanılan Bu protokol, fagositoz ve aktin polimerizasyonu miktar gibi birden fazla uygulama için de kullanılabilir. protokol değişikliği çeşitli kendisini ödünç, ve Tablo 1 hücre tipleri ve parçacıklar başarıyla geçmiş çalışmalarda kullanılan. Fagositoz veya aktin polimerizasyonu ölçümü için bu protokolün standart kullanımı Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Diyagram 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Şema 1:. Hücreler, kaplama muamele edilmiş ve yapışmaya bırakılmış sonra Şeması fagositoz aktin polimerizasyonu ve miktar tayini için flüorometrik tahlil yeşil floresan (FITC) ile etiketlenir parçacıklar fagositosis için hücrelere ilave edilir. Reaksiyon trypan veya antibi tarafından durdurulurotik yıkama (olmayan içsel parçacıkları elimine etmek için) ve tespit% 4 paraformaldehit ile gerçekleştirilir. Hücreler, daha sonra kırmızı floresan aktin etiket (rodamin falloidin) ve mavi floresan-etiketi (DAPI) ile boyanır. Fagositoz aktin polimerizasyonu ve endeksler yeşil / mavi (FITC / DAPI) ya da kırmızı / mavi (rodamin / DAPI) floresansın nispi floresan birimlerinin oranı olarak ölçülür. 1. Kaplama ve Tedavisi Hücreler NOT: Başlamadan önce, plaka düzeni aşağıdaki kontrolleri en az 4 teknik tekrarlı tedaviler çalışan düşünün, ve şunlardır: sadece ve parçacık hücreleri sadece (tek başına ya da DAPI rodamin yalnız ile, lekesiz). <ol><li> Kontaminasyondan örnekleri korumak amacıyla, steril hücre kültürü kaputu 1-4 adımda reaktiflerin tamamı ilave yürütmek için. </li><li> (Kuyu başına), 50 ul 1-5 x 10 4 hücre 96 oyuklu bir plaka içerisinde Plaka makrofajlar (sıçangil J 774 hücre çizgisi)<html> ve önceden ısıtılmış medya desteklenmiştir. Bu yöntem için ideal plakaları okuyucu özelliklerine bağlı olarak, şeffaf veya siyah dipleri siyah 96-kuyu plakalar vardır. <ol><li> (Fagositosis için canlı bakteri kullanılmıyorsa) takviye edilmiş bir ortam için, tamamlayıcı çağlayanının bir girişimi engellemek için FBS,% 10 ısı ve% 1 penisilin / streptomisin kullanın. Ile yapışmayan hücreler 1-2 yapışma saat ve yapışkan olmayan hücreler için izin verirse, 500 x g&#39;de 10 dakika için hücreler ile plaka aşağı doğru döndürün. </li></ol></li><li> 100 ul (1 x) bir son hacim için 50 ul 2x konsantrasyonda (takviye edilmiş ortam içinde, daha tercihen PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ya da) istenilen agonistleri / antagonistleri ya da araç kontrolü ekleyin ve bir zaman arzu edilen bir miktarda inkübe edilir. Çok kanallı pipet ve reaktif rezervuarları hızlı işleme kolaylaştıracaktır. </li></ol> Floresan Parçacıkların 2. Opsonizasyon ftp_upload / 52.195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Tablo 1: Test edilen hücre tipleri ve fluorometrik olarak analiz floresan parçacıkların olmadığı, fagositoz ve aktin polimerizasyon Tablo 1 hücre tiplerinin kombinasyonu (hücre hatları ve primer hücreler) göstermektedir grup florometrik yöntemi ile kullanılan bildirildi.. Vahşi tip hücreler tarafından fagositoz ve aktin polimerizasyonu şu an dışında, aynı zamanda, bir GFP (yeşil flüoresan protein) ifade eden transfekte edilmiş hücreler tarafından fagositoz incelenmesi için, bu parçacıkların bir kısmı kullanmışlardır. . Floresan haberci ihtiva eden plasmidler ile transfekte edilmiş hücrelerin floresans da DAPI Tablo Efsaneye ek olarak hücresel marker olarak kullanılabilir: A - aktin polimerizasyonu; P - fagositoz; PT - GFP tarafından fagositoz transfekte hücreleri etiketli; OPDex - dekstran boncuk opsonize; HKOP - Isı opsonize öldürülen. <ol><li> Floresan parçacıkların olmadığı ve etiketler her zaman ışıktan korunduğu, dur sağlamakışıkla ağartma önlemek için, hem de inkübasyon sırasında işleme, yıkama ing <ol><li> Üreticinin teknik özelliklerini kullanarak,: (E. coli K-12 suşu E2861) kuru parçacıklar için, floresan ısı öldürülmüş opsonize (HKOP) bakterileri dışarı tartın. 10 Herhalde kitle hesapları yapmak için özen: 1-20: 1 bakteri: hücre oranı (ya da en azından 10: 1 oranı - yaygın fagositoz miktarının kullanılır) 13,14. Parçacıkların sayısı üreticisi tarafından sağlanan veya 1 mg / ml stok çözeltisi seri dilüsyonları couting ile tespit edilebilir. </li><li> 50 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve en yüksek ayarda 1 dakika vorteksleyin. Doğru vorteks (burada ve protokol boyunca) parçacıklar opsonitasyonunu etkinliğini etkileyebilecek bir araya eğilimi gibi olun. </li><li> Süspansiyon içinde olan zerrelerin gibi floresan etiketli dekstran boncuk (Dex boncuklar) için, 1 dakika vorteksleyin, stok çözeltisi, birim d boncuk konsantrasyonuna süspansiyon ya da bağlı olarak 50 ul alır1 boncuk: boncuk etermine montaj 10 kolaylaştırmak için hücre oranı. </li></ol></li><li> Parçacıklara opsonizasyon reaktif eşit hacimde eklenir ve güçlü bir şekilde bir dakika girdap. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir reaktif opsonizasyon sahip partiküller inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj parçacıkları ve fazla opsonizasyon reaktifi ihtiva eden üstte yüzen çıkarın. 100 ul PBS ilave edilmesiyle parçacıklar yıkanır, girdap 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca pelet ve santrifüjatın tekrar süspansiyon. <ol><li> Uygun opsonizasyonunu ve bağlanmamış antikor kaldırılmasını sağlamak için bu adımları iki kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> (Bir 96-delikli plaka için yeterli) ortam 5 ml bunları yeniden süspanse edilmesi suretiyle opsonize parçacıkların çalışma çözeltisi hazırlayın ve hücrelere ilave edilene kadar ışıktan uzakta depolamak. </li></ol> 3. Fagositoz <ol><li> Steril reaktif rezervuar içindeki parçacıkların çalışma çözeltisi yerleştirin. Buradan, 50 ekleyin56 (50 ng / ml&#39;lik bir son konsantrasyon için) aşama 1 &#39;de hazırlanan hücrelere opsonize parçacıkların L ve fagositoz standart hücre kültür koşullarında oluşmasına izin verir. Bu yöntem (Şema 2) kullanılarak değerlendirilebilir fagositoz iki yöntem aşağıda görüntülenmiştir. </li></ol><img alt="Diyagram 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Şema 2:. Onlar yavaş yavaş iyi altındaki hücreleri ulaşmak gibi sürekli karşı senkronize fagositoz karşılaştırılması Sürekli fagositoz zamanla parçacıkların sürekli içselleşmesini gösterir. Bir tezat senkronizasyon adımı (santrifüj) hücre ile partikül temas artırılması ve hücreler tarafından derhal içselleştirilmesi lider, dibine çöker parçacıkları zorlar. Senkronize fagositoz daha hızlı bir bölümünü içselleştiren hızlı bir süreçtirparçacık temas: artmış hücre nedeniyle icles. <ol><li><ol><li> Bakteri kuyunun dibine ulaşmak ve elde etmek için yavaş yavaş dibe batar ve hücreler ile temas, izin daha uzun zaman dilimlerini kullanmak gibi hücreler sürekli opsonize bakterileri fagosite izin Sürekli fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için hücrelerle dokunun. Bir zamanlaması, deney yapılması halinde, farklı zaman aralıklarında bakteri ekleyebilir ve işleme hızını artırmak için, aynı zamanda reaksiyonların tüm plaka durdurun. </li><li> Parçacık artırır senkronize fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için: santrifüj yoluyla hücre teması, her zaman noktalarında senkronizasyonunu kolaylaştırmak için hücreleri ve parçacıklar (500 xg&#39;de 5 dakika) kısa sürede parçacıklar ilave olarak içeren tüm plaka aşağı spin ve Hücre etkileşimi: parçacık hızlandırmak için. <ol><li> Sağ merkezkaç tamamlanmasından sonra başlayan süresi kursu ölçünfugation adım. Zamana yayılmış bir deneyi yürütülmesi durumunda aşağıda tarif edildiği gibi, farklı zaman aralıklarında bağımsız olarak her zaman noktasını durdurun. </li></ol></li></ol></li></ol> NOT: senkronize fagositoz yöntemi biraz daha zahmetli bir öncekinden olduğunu, ancak daha kısa sürede daha yüksek fagositik indeksi sağlar. 4. Durdurma Fagositoz <ol><li> Yapışkan hücreler için, süpernatant kaldırmak ve PBS ile seyreltildi tripan mavisi 50 ul: olmayan içsel bakteri floresan söndürmek için, (2: 1 seyreltme). </li><li> Yapışmayan hücreler için, plaka aşağı spin ve süpernatant kaldırmak. Seyreltilmiş tripan mavisi 50 ul ekleyin. Hücre kaybını en aza indirmek ve yeterli yıkama sağlamak için, her bir yıkama arasında en plaka (500 x g&#39;de 5-10 dakika) santrifüj emin olun. </li><li> Tripan inkübasyon sonrasında, (de açık döner PBS kaldırılana kadar) herhangi bir kalıntı numuneler Tripan kaldırmak için PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Trypan fakat canlı bir bakteri ya da OPDex boncuk, floresan etiketli olmayan içsel ısı öldürülmüş bakteriyel parçacıkların floresan 15,16 söndürmek için gösterilmiştir. Canlı bakteri için, penisilin, streptomisin, veya gentamisin yerine olmayan içsel partiküllerden floresan karıştırıcı etkilerini önlemek için tripan yıkama gibi antibiyotikler ile bir yıkama içerir. </li><li> PBS ile yıkayın, sonra% 4 paraformaldehid, 100 ul hücreleri saptamak, ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir (her bir yıkama için oyuk başına 100 ul). Bu adımda, bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de hücreler, kaydetme ve boyama ve miktar, doğrudan devam edin. NOT: Tüm sonraki adımlar bu nokta önsöz hücre kültürü kaputu dışında yapılabilir oluştururlar. </li><li> Tüm sıvı çıkarın ve PBS içinde yeniden 5 ng / ml DAPI 50 ul ekle. Boyama için 5 dakika izin verin ve daha sonra iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama adımından sonra, her bir kuyunun ve kayıt fagositozu PBS 50 ul ekleyin. </li&gt; </ol> 5. Aktin Boyama Not: fagositoz ek olarak, florometrik yöntem lamellipodia, pseudopodiae inhibisyonu sırasında azalır aktin, yoğunluğunu ölçmek ve membran bir inhibitör (Şekil 1A) ile muamele sonucu olarak kabarması ile aktin polimerizasyonu miktarının sağlayacaktır. Bu fagositoz ek olarak aktin polimerizasyonu ölçümü ilgilenen varsa isteğe bağlı bir adımdır. Aktin polimerizasyon fagositoz için floresan parçacıklar kullanılarak, nihai hedefi ise isteğe bağlıdır. <ol><li> Paraformaldehit sabitleme (adım 4.3) takiben, her bir yıkama için oyuk başına 100 ul PBS ile iki kez plakayı yıkayın. Nüfuziyet kabiliyeti PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında -5 dakika inkübe edilir. </li><li> (Yukarıdaki gibi) PBS ile% 0.1 Triton X-100, 2 kez yıkayın ve Labe spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 20 dakika boyunca,% 1 sığır serum albümini (BSA) ile blokel. </li><li> Engelleme ardından, BSA çözüm kaldırmak ve hemen rodamin Phalloidin ekleyin. , Rodamin leke çalışma çözeltisi hazırlamak (bir plaka için yeterli) PBS, 5 ml (üretici tarafından sağlanan) metanoik çözeltisi 100 ul kullanın. Çalışma çözeltisinden oyuk başına 50 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. NOT: adımda çamaşır adımları ve DAPI boyama takiben 4.4 hücreleri ölçümü için hazır olacak. </li></ol> 6. sayısallaştırılması <ol><li> Λ = 460 nm λ = 355 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak λ = 518 nm, mavi floresan de λ = 488 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak floresan plak okuyucu kayıt yeşil floresan ile fagositozu ölçmek için. </li><li> Λ = 355 nm ve λ = 460 nm (yukarıdaki gibi), ve kırmızı grip ile bir floresan plaka okuyucu kayıt mavi floresan kullanılarak aktin polimerizasyonu ölçmek içinλ = 584 nm ve emisyon filtresi λ = 620 nm uyarma filtresi üzerinden orescence. NOT: Orbital veya merkezi algılama kayıt için kabul edilebilir. Bazı hücre tiplerinin vaka yörünge kayıt avantaj olabilir hangi merkeze daha kuyudan, kenarına daha toplamak. Özellikle, yörünge etrafında üç nokta, ortalama aynı zamanda daha hassas sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. </li><li> Aktin ölçümü (Grafik 1) vs parçacık etiket veya fagositik bağlı, (DAPI itibaren) mavi floresan okuma yeşil veya kırmızı floresan toplam RFU bölün. Yüksek olması nedeniyle plaka için plaka varyans, en iyi gözlenen eğilimleri göstermek ve daha güvenilir istatistiksel analiz kolaylaştırmak için, (örneğin = 0 kontrolü t göreceli olarak) göreceli indeksleri kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology. , (2012).</li><li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components.">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice.">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633 (2013).</li><li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes.">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621 (2012).</li><li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development,+stress+response,+and+virulence.">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li><li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor.">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li><li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation.">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li><li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory,+GM-CSF-derived+macrophages.">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898 (2013).</li><li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function.">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li><li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRP/anti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation.">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).</li><li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection.">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li><li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology.">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Florometrik tekniğin başlıca kısıtlamaları deney varyans yanı sıra geniş bir yıkama ve yapışkan olmayan hücrelerin kullanımı ile ortaya çıkan hücre kaybı vardır. Varyans nedeniyle hazır çözeltinin hazırlanması sırasında tartım ve pipetleme gibi floresan parçacıkların varyasyon büyük ölçüde görülmektedir deney için deney parçacıkların aynı sayıda muhafaza tam bir yol değildir. (-; Parçacıklar hemen eklenen ve kaldırılan t = 0 kontrol) deneyler ...

Floresan sinyal miktarının belirlenmesi yaygın, akım sitometri konfokal mikroskopi ve ELISA multiplex için analiz FRET, PCR kadar bilimsel yöntemlerle çok sayıda kullanılmıştır. Floresan görüntüleme ve miktar geniş bir uygulama vardır ve çeşitli hücresel süreçlerin kantitatif analiz için harika bir araç olabilir. Floresan belirteçleri ve sinyal kullanımı son on yılda devrim olmuştur, ve floresan plaka okuyucu çıkması hücresel süreçleri sırasında yayılan floresan yüksek verim miktarının kolaylaştırmıştır. Florimetrik analiz fagositoz miktarının büyük bir araç olarak hizmet verebilir. Fagositoz, 1800 1 Metchnikoff tarafından fagositoz keşfinden bu yana çalışılmıştır. Yıllar geçtikçe, çeşitli yöntemler bakteriyel, viral, fungal ve parazitik patojenler 2-5 istila karşı doğal bağışıklık savunma için gerekli bu önemli süreci incelemek için kullanılmıştır. Sırayla miktar kullanılan mikroskopi ve Stereolojik tekniklerin Önceki yöntemler daha sonra içselleştirilmiş parçacıklar (manuel veya yazılım kullanımı ile) 6-8 sayılarak ölçüldü phagocytosing hücreleri, görselleştirmek için. Kantitatif analiz için yalnız mikroskopi kullanılarak bazı dezavantajları bakterilerin manuel sayım emek yoğun ve gözlemci önyargı daha eğilimli olduğunu vardır. Fagositoz belirlenmesinde kullanılan diğer bir yöntem, bakteriyel kültür tabakalarına (fagositoz sonra) hücre lizatları bakterilerin kaplama mikrobiyolojik bir tekniktir, ancak bu yöntem bakteri mekanizmaları ve kısmen içsel bakterilerin varlığı hesaba başarısız olabilir. Bu yöntem mikroskopi göre daha emek yoğun ve analiz için birkaç gün sürer. Akış sitometri fagositoz ölçmek için hızlı, en etkili yolu olarak görünmektedir ve birçok grup 9-11 tarafından kullanılmıştır, ancak yüksek maliyet yaygın in ile ilgiliDaha önce de belirtildiği deneylere göre analiz için gerekli gösterge en pahalı bir yöntem sağlar. flüorometrik yöntem engelleyici maliyeti olarak değil floresan kullanarak ekipman tarafsız ölçümü sunar beri parçacık içselleştirilmesi analizi için flow sitometri için iyi bir alternatiftir. Fluorometri diğer katma faydaları, yüksek verimlilik ve etiketli içselleştirilmiş parçacıklar tarafından yayılan floresan ölçülmesi için yüksek verimlilik yetenekleri vardır. Fluorometri Faydaları fagositoz dışındaki süreçlerin ölçümü için çıkarım olabilir. Örneğin, florometrik analiz aktin polimerizasyonunda hücre içi ya da zar bağlı reseptör, hücre geçirgenliği / canlılığı, transfeksiyon etkinliği değişiklikler ve modülasyon ifadesi değişikliklere yol açan herhangi bir işlem çalışma uygulanabilir. Florometrik tekniğin bir dezavantajı kullanılan etiketlerin bağlı olarak, yüksek olabilir, yaniDeney genellikle kat değişikliği veya kontrolden oranında artış göreli miktar üzerinden veri, göstererek çözülebilir değişkenliği deneme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

flüorometrik analiz amacı fagositozunu ve diğer hücresel süreçleri analiz verimli, düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi olarak hizmet etmektir. Bu teknik, hücre çeşitli özelliklerini incelemek için, yapışkan ve yapışkan olmayan, her iki hücre tipinde, çeşitli kullanılabilir. Fagositozu okuyan zaman flüorometrik tekniği gibi makrofajlar ve kimin floresan tripan mavisi varlığında sönmüş olabilir floresan etiketli opsonize edilmiş parçacıklar gibi fagositik hücre tiplerini kullanır. 96 oyuklu plakalar, floresan parçacıkların (yeşil veya kırmızı) yapışkan makrofaj kaplama izlenerek tatbik edilmektedir ve hücreler, zaman çeşitli miktarlarda fagosite izin verilir. Floresan parçacıkların içselleştirme sonra hücreler içsel olmayan, ya da sadece hücre yüzeyine yapışan bakterilerden floresan sinyalin yok olmasına olanak tripan mavisi ile yıkanır. Tripan yıkamayı takiben, hücreler, sabit, PBS ile yıkanır, birnd hücrelerin çekirdekleri etiketlemek için hizmet veren DAPI (nükleer mavi floresan etiket) ile boyandı. Levha çekirdek (mavi) okunması ya da bir parçacık içinde basit bir florometrik miktar olarak (kırmızı / yeşil) floresans yeşil nispi floresan birimlerinin oranı inceleyebilir: mavi ve hücre başına içsel floresan bakteri miktarının göstergesi olan bir fagositik endeksinin belirlenmesi. yıkama için 96 çukurlu bir yöntem ve çok kanallı pipet kullanılarak tahlil süresi, veri toplama sonuna fagositoz sonundan, 45 dakikadan daha azdır. Akış sitometrisi, benzer bir şekilde kullanılabilir, ancak fluorometri avantajı, yüksek verim, numune en az bir manipülasyon ve hücre başına floresan yoğunluğu hızlı ölçümü ile değerlendirme olarak hızlı bir yöntemdir edilebilir. Benzer stratejiler, esasen yapışkan hücreler, canlı etiketli bakteriler, aktin polimerizasyonu, ve floresan kullanılarak herhangi bir işlem uygulanabilir. Bu nedenle, fluorometri düşük maliyetli, yüksek throughp için umut verici bir yöntemdirhücresel süreçlerin çalışmada ut yetenekleri.

Bu protokol kullanılarak fagositozunu ve sonraki aktin polimerizasyonu miktarının iki önemli yolu, sürekli veya senkronize fagositoz gözlemlemektir. Mikroskopik analiz (Şekil 1B) florimetre kayıt ne karşılaştırılabilir floresan görüntüleri göstermektedir (ayrıca Diagram 1). Şekil 1B aktin kırmızı floresan, FITC yeşil floresan 268 HKOP E. etiketleri vardır coli, nükleer DAPI leke ve üç 269 birleştirilmiş görünt...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization at JoVE.com

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

high-throughput-fluorometric-technique-for-assessment-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.5K Görüntüleme.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Video: High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.