Yüksek verimnedeniyle, bu yöntem daha fazla insan hastalığı çalışma ve yeni kök hücre tedavileri geliştirmek için bir araç olarak indüklenen pluripotent kök hücreleri, ya da IPSCs ilerletebilirsiniz. Bu protokolün en büyük avantajı, yeniden programlanması zor, ilişkili hastalık, yaşlı ve senescent fibroblastlar da dahil olmak üzere birincil insan fibroblastlarından yüksek kaliteli entegrasyon ücretsiz IPSC'ler üretebilme yeteneğidir. Bu yöntemin başarısı fibroblastların optimal RNA transfeksiyon verimliliğine bağlıdır.
Ve bir transfection arabelleği pH ayarlama bunu başarmak için önemli bir prosedürdür. Başlamak için, 500 mililitre ve 100 mililitre oda sıcaklığında önceden ısıtılmış taze azaltılmış serum ortamı şişeleri kullanarak transfeksiyon tamponu hazırlayın. Ortama ait taban pH'ı 500 mililitrelik şişede, pH metrenin cam elektrotunu tampona yerleştirerek ölçün ve pH'ı okumadan önce bir dakika kadar bekleyin.
pH ayarlamak için, 500 mililitrelik şişe içine bir azı lı sodyum hidroksit üç ila dört mililitre ekleyin. Şişeyi kapatın ve iyice karıştırın. Beş dakika bekledikten sonra şişeyi açın ve pH metrenin elektrotunu tampona takın.
pH metre deki okuma stabilize olana kadar bekleyin. PH 8,15 ila 8,17'ye ulaşana kadar bir molar sodyum hidroksitküçük hacimler eklemeye devam edin, işlem sırasında pH metresini birkaç kez kalibre etmeyi unutmayın. Transfeksiyon tamponu sterilize filtre lemek için 0,22 mikrometre vakum filtrasyon sistemi kullanın.
Aliquot en az hava alanı ile beş mililitre tüpler içine sterilize tampon. Yeniden programlanacak fibroblastların %40 ila %60 birleşme de olduğunu doğrulayın. 15 mililitrelik konik bir tüpiçine DPBS dört mililitre aktarın ve rekombinant insan laminin 521 100 mikrolitre ekleyin.
Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. Altı kuyu plaka üç kuyu içine seyreltilmiş rekombinant insan lamin 521 kuyu başına bir mililitre ekleyin. Bu kaplamalı plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
Bu kuluçka sırasında, sıcak altı mililitre fibroblast genişleme orta ve kaplama orta dört mililitre 37 santigrat derece. Mililitre başına 100 nanogram ve mililitre başına 200 nanogram lık son konsantrasyonda B18R'lik son konsantrasyonda temel FGF ile kaplama ortamını tamamlayın. Harcanan ortamı %40 ila %60 oranında olan fibroblastlardan dikkatlice aspire edin.
Hücreleri beş mililitre DPBS ile durula. Trippsin EDTA üç mililitre ekleyin ve yavaşça tripsin EDTA ile hücreleri kapsayacak şekilde plaka kaya. Aşırı sıvıyı aspire edin, yaklaşık 500 mikrolitre tripsin bırakın ve fibroblastları 37 santigrat derecede üç dakika kuluçkaya yatırın.
Kuvözden plakayı çıkardıktan sonra, hücreleri yerinden çıkarmak için plakanın yan tarafına sıkıca ama dikkatlice dokunun. Ayrılmış olup olmadıklarını kontrol etmek için hücreleri mikroskop altında görüntüleyin. Trypsin EDTA nötralize etmek için müstakil hücrelere fibroblast genişleme orta beş mililitre ekleyin.
15 mililitrelik konik tüp içinde hücreleri toplamak ve iyi karıştırın. Hücreleri hemositometre kullanarak sayın, sonra pipet 12, 000 hücre daha önce hazırlanmış önceden ısıtılmış kaplama ortamıdört mililitre içine. Kaplamalı plakayı kuvözden çıkardıktan sonra, kuyulardan seyreltilmiş laminin 521 aspire edin, kuyuların yüzeyinin kurumadığından emin olun.
Yavaşça kaplama orta olan hücreleri yeniden askıya ve her iyi kaplanmış içine hücre süspansiyon bir mililitre ekleyin. Kaplamalı hücreleri %5'e ayarlanmış üç gazlı doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin Ve sonra yavaşça ama iyice hücreleri aşağı, sonra sol sağ hareket arasında dönüşümlü olarak dağıtın ve plakayı döndürmemeye emin olarak hareketleri iki kez daha tekrarlayın. Hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırın.
Bu arada, 15 mililitrelik konik bir tüp e-programlama orta dört mililitre ekleyin ve bir gecede dengelemek için bir gevşetilmiş kapağı ile düşük O iki kuluçka yerleştirin. Transfeksiyondan en az bir saat önce, düşük O iki kuluçka makinesinden dengelendirilen yeniden programlama ortamını çıkarın. Mililitrede 100 nanogramlık son konsantrasyona bFGF'yi ve mililitrede 200 nanogramlık son konsantrasyona B18R'i ekleyin ve iyice karıştırın.
Bir seferde iyi çalışma, harcanan orta kaldırmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Ve bFGF ve B18R ile desteklenen yeniden programlama ortamı, bir mililitre ile değiştirin. Hücreleri ile plaka geri düşük oksijen kuluçka içine taşıyın.
Fibroblast transfeksiyonuna başlamak için, ilk olarak transfeksiyon tamponunun bir aliquot'unu oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca dengeleyin. Modifiye MRNA'lardan tek bir 33 mikrolitre aliquot ve 14 mikrolitre MIRNA mimiklerini negatif 80 santigrat dereceden çıkarın ve çözülene kadar yaklaşık 3-5 dakika oda sıcaklığına ısıtın. Onları kısa bir süre mikrofuge aşağı çevirin.
Transfeksiyon reaktifini yaklaşık 3-5 dakika oda sıcaklığında ısıtın. Reaktifi karıştırmak için tüpü 2-3 kez ters çevirin ve kısa bir süre mikrofuge aşağı döndürün. Oda sıcaklığındaki transfeksiyon tamponunun 279 mikrolitresini rna içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve transfeksiyon reaktifinin 31 mikrolitresini ekleyin.
Pipetleme ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçka ile iyice karıştırın. Modifiye MRNA 33 mikrolitre aliquot oda sıcaklığında transfeksiyon tampon 132 mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için pipet. 14 mikrolitre mirna mimikrine oda sıcaklığında transfeksiyon tamponunun 102,6 mikrolitresini ekleyin ve yavaşça pipetkarıştırın.
Modifiye MRNA transfeksiyon karışımı hazırlamak için, 310 mikrolitre transfeksiyon tampon 165 mikrolitre ekleyin, transfeksiyon reagent karışımı transfeksiyon tampon 165 mikrolitre, modifiye MRNA karışımı. Pipet karıştırmak için. MIRNA mimiklerinin transfeksiyon karışımını hazırlamak için, 310 mikrolitre transfeksiyon tamponunun 116,6 mikrolitresini, transfeksiyon reaktif karışımını 116,6 mikrolitre transfeksiyon tamponuna, MIRNA mimik karışımına ekleyin.
Modifiye MRNA'lar ve MIRNA taklitleri ile transfeksiyon tamponuna karmaşık bir şekilde izin vermek için oda sıcaklığında 15 dakika iyi karıştırın ve kuluçkaya yatırın. Düşük oksijen inkübatör hücreleri ile plaka çıkarın. Her kuyuboyunca akıllıca bırakın, karmaşık, modifiye MRNA içeren transfection karışımı iyi başına 100 mikrolitre ekleyin.
Yavaşça ama iyice bir aşağı ile plaka ajite, sonra transfection kompleksleri dağıtmak için sol sağ hareket. Karmaşık MIRNA mimikleri içeren transfection karışımı nın kuyubaşına 66,7 mikrolitre ekleyin. Yavaşça ama iyice bir aşağı ile plaka ajite, sonra transfection kompleksleri dağıtmak için sol sağ hareket.
Düşük oksijen ile üç gaz kuvöz içine transfected hücreleri ile plaka yerleştirin. Transfeksiyon komplekslerini hafifçe dağıtın ama tabağı aşağı, sonra sol sağa hareket ederek iyice çalkalayın. Ertesi gün orta değiştirmeden önce 16-20 saat boyunca kuvözde transfected hücreleri kuluçkaya yatırın.
15 mililitrelik konik bir tüpe dört mililitre yeniden programlama ortamı ekleyin ve bir gecede dengelemek için gevşek bir kapakla düşük O iki kuluçka makinesine yerleştirin. Ertesi sabah, bFGF ve B18R ile takviye edilmiş taze önceden dengelenmiş ortam içeren transfeksiyonu değiştirin ve protokolde açıklandığı gibi transfeksiyon rejimine devam edin. Yeniden programlama için altı iyi format çanak bir kuyu içine başarılı kaplama sonra, fibroblastlar çok seyrek göründü.
İlk başarılı transfeksiyondan 24 saat sonra fibroblastlar iğ şeklini kaybettiler ve daha yuvarlak bir morfoloji geliştirdiler. İlk üç transfeksiyon boyunca hücre yoğunluğu yavaş yavaş ve sürekli olarak artarak yedi ile sekiz gün arasında meydana gelen proliferasyon patlaması ile artmıştır. 10. gün, hücreler büyük ölçüde konfluent ortaya çıktı.
İlk IPSC kolonileri 11. 15-17. gün geçtikçe, IPSC kolonileri büyük ve belirgin hale geldi ve çevreden açıkça farklı laştı ve tamamen yeniden programlanmış fibroblastlar. Pluripotency marker TRA-1-60 için immünoboyama yüksek yeniden programlama verimliliği doğruladı.
Bu protokolde yeniden programlamanın veriminin azalmasının en yaygın nedeni suboptimal kaplama yoğunluğudur. Kaplama yoğunluğu çok düşükse, büyük asellüler baron yamalar ortaya çıktı ve IPSC kolonileri oluşmadı. Yeniden programlanmış hücrelerin seyreltme geçişinin ardından, IPSC'ler tek koloniler olarak büyüdü ve fibroblastlardan kolayca ayırt edilebilirdi.
Onlar gevşek paketlenmiş ve bireysel hücreler nispeten büyük bir sitoplazmik alana sahipti. Dört ila yedi gün boyunca, IPSC'ler çoğaldı ve tanımlanmış kenarları ile karakteristik sıkıca paketlenmiş koloni oluşturdu. Koloni içindeki hücreler belirgin nükleollü büyük bir nükleer fraksiyon gösterdi.
Hasta fibroblastlarını yeniden programladıktan sonra, ortaya çıkan IPSC'ler, hastalığa neden olan hücreleri açıklamak veya yeni rejeneratif hücre bazlı terapötikler geliştirmek için çeşitli somatik hücrelere ayrıştırılabilir.
