בשל יעילותה הגבוהה, שיטה זו יכולה לקדם עוד יותר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים, או IPSCs ככלי לחקר מחלות אנושיות ופיתוח טיפולים חדשניים בתאי גזע. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא היכולת ליצור IPSCs ללא אינטגרציה באיכות גבוהה מ fibroblasts אנושיים ראשוניים כולל קשה לתכנת מחדש, מחלות הקשורות, בגילאים, ו fibroblasts senescent. ההצלחה של שיטה זו תלויה יעילות אופטימלית RNA transfection של fibroblasts.
והתאמת ה- pH של מאגר transfection הוא הליך מפתח כדי להשיג זאת. כדי להתחיל, להכין חיץ transfection באמצעות 500 מיליליטר ו 100 מיליליטר טמפרטורת החדר מראש מחומם בקבוקים של מדיום סרום מופחת טרי. למדוד את ה- pH הבסיסי של המדיום בבקבוק 500 מיליליטר על ידי החדרת אלקטרודה הזכוכית של מד pH לתוך המאגר, ולחכות עד דקה אחת לפני קריאת ה- pH.
כדי להתאים את ה- pH, להוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של נתרן הידרוקסיד טוחן אחד לתוך בקבוק 500 מיליליטר. סוגרים את הבקבוק ומערבבים היטב. לאחר המתנה של חמש דקות, פתח את הבקבוק והכנס את האלקטרודה של מד ה- pH לתוך המאגר.
המתן עד שהקריאה במד ה-pH תתייצב. המשך להוסיף כמויות קטנות של נתרן הידרוקסיד טוחן אחד עד שה- pH מגיע ל- 8.15 עד 8.17, הקפד לכייל את מד ה- pH מספר פעמים במהלך התהליך. השתמש במערכת סינון ואקום מיקרומטר 0.22 כדי לסנן את חיקור מאגר ההמרה.
עלה על החיץ הסטרילי לחמישה צינורות מיליליטר עם מרחב אווירי מינימלי. ודא שהפיברובלסטים שיש לתכנת מחדש הם ב- 40%-60%confluency. העבר ארבעה מיליליטר של DPBS לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר, ולהוסיף 100 microliters של למינין אנושי רקומביננטי 521.
מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה. מוסיפים מיליליטר אחד לגם של למינין אנושי רקומביננטי מדולל 521 לשלוש בארות של צלחת שש בארות. דגירה זו צלחת מצופה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
במהלך הדגירה הזו, חום שישה מיליליטר של התרחבות פיברובלסט בינונית וארבעה מיליליטר של ציפוי בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. להשלים את המדיום ציפוי עם FGF בסיסי בריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר ו B18R בריכוז הסופי של 200 ננוגרם למיליליטר. בזהירות שאפו את המדיום המבוזבז מ-fibroblasts בשיעור של 40%-60%.
לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של DPBS. הוסף שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA בעדינות לטלטל את הצלחת כדי לכסות את התאים עם טריפסין EDTA. שאפו נוזלים עודפים, השאירו כ-500 מיקרוליטרים של טריפסין, והם דגירה את הפיברובלסטים במשך שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר הסרת הצלחת מהאינקובטור, הקישו בחוזקה אך בזהירות על צד הצלחת כדי לנתק את התאים. הצג את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לבדוק אם הם נותקו. הוסף חמישה מיליליטר של מדיום התפשטות fibroblast לתאים מנותקים כדי לנטרל את EDTA טריפסין.
לאסוף את התאים בצינור חרוט 15 מיליליטר ומערבבים אותם היטב. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ואז פיפטה 12, 000 תאים לארבעה מיליליטר של מדיום ציפוי מחומם מראש שהוכן מראש. לאחר הסרת הצלחת הצפויה מהאינקובטור, שאפו למינין 521 מדולל מהבירות, ודאו שמשטח האגם לא יתייבש.
בעדינות resuspend התאים כי הם במדיום ציפוי ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיית תא לתוך כל מצופה היטב. מניחים את התאים מצופים לתוך אינקובטור תרבות רקמת שלושה גז עם חמצן נמוך או חמצן להגדיר 5%ואז בעדינות אך ביסודיות לפזר את התאים על ידי לסירוגין בין למעלה למטה, ואז תנועה ימנית שמאלה, ולחזור על התנועות פעמיים נוספות, הקפד לא לסובב את הצלחת. דגירה התאים בן לילה.
בינתיים, להוסיף ארבעה מיליליטר של תכנות מחדש בינוני לצינור חרוט 15 מיליליטר, ולמקום אותו באינקובטור O 2 נמוך עם כובע משוחרר כדי לצייד בן לילה. לפחות שעה אחת לפני ההשתנות, הסר את מדיום התכנות מחדש הצייד מאינקובטור O 2 נמוך. מוסיפים bFGF לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר, ו- B18R לריכוז סופי של 200 ננוגרם למיליליטר, ומערבבים היטב.
עובד אחד טוב בכל פעם, להשתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי להסיר את המדיום בילה. ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום תכנות מחדש, בתוספת bFGF ו B18R. להזיז את הצלחת עם תאים בחזרה לתוך אינקובטור חמצן נמוך.
כדי להתחיל transfection fibroblast, תחילה לצייד aliquot של מאגר transfection במשך כשעה בטמפרטורת החדר. הסר 33 microliter aliquot יחיד של MRNAs שונה 14 aliquot microliter של MIRNA מחקה מ שלילי 80 מעלות צלזיוס, לחמם אותם לטמפרטורת החדר במשך כשלוש עד חמש דקות עד מופשר. סובב אותם לזמן קצר במיקרופוגה.
מחממים את רגנט ההנפה לטמפרטורת החדר למשך כשלוש עד חמש דקות. הפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב את הריאה ולסובב אותו לזמן קצר במיקרופוגה. העבירו 279 מיקרוליטרים של מאגר ההמרה בטמפרטורת החדר לצינור מיקרוצנטריפוגה חינם של RNAs, והוסיפו 31 מיקרוליטרים של רגנט ההמרה.
מערבבים היטב על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. הוסיפו 132 מיקרוליטרים של מאגר ההמרה בטמפרטורת החדר ל-33 המיקרוליטרים של MRNA שעברו שינוי, וערבבו בעדינות את ה-pipette. הוסיפו 102.6 מיקרוליטרים של מאגר ההמרה בטמפרטורת החדר ל-14 המיקרוליטרים של מירנה מחקים ומערבבים בעדינות.
כדי להכין את תערובת ההמרה של MRNA שונה, להוסיף 165 microliters של מאגר 310 microliters transfection, תערובת reagent transfection ל 165 microliters של מאגר transfection, תערובת MRNA שונה. פיפטה לערבב. כדי להכין את תערובת ההמרה של חיקויי MIRNA, הוסיפו 116.6 מיקרוליטרים של מאגר התמרה של 310 מיקרוליטר, תערובת ריג'נטים טרנספיקציה למאגר התמרה של 116.6 מיקרוליטר, תערובת חיקוי MIRNA.
מערבבים היטב ודורגים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למאגר ההטרמפקט להתרכב עם חיקויי MRNAs ומירנה שהשתנו. הסר את הצלחת עם תאים מאינקובטור החמצן הנמוך. זרוק חכם על פני כל באר, להוסיף 100 microliters לכל גם של תערובת transfection המכיל מורכב, MRNAs שונה.
בעדינות אך ביסודיות להתסיס את הצלחת עם למעלה למטה, ואז שמאלה תנועה ימינה כדי לפזר את קומפלקסים transfection. הוסיפו 66.7 מיקרוליטרים ל-200 מתערובת ההמרה המכילה את ה-MIRNA המורכבת שמחקה ירידה חכמה על פני כל באר. בעדינות אך ביסודיות להתסיס את הצלחת עם למעלה למטה, ואז שמאלה תנועה ימינה כדי לפזר את קומפלקסים transfection.
מניחים את הצלחת עם התאים המרובים לתוך אינקובטור תלת-גז עם חמצן נמוך. מפזרים את קומפלקסים transfection על ידי בעדינות אך ביסודיות להתסיס את הצלחת עם למעלה למטה, ואז שמאלה תנועה ימינה. הדגירה את התאים המרובים באינקובטור במשך 16 עד 20 שעות לפני שינוי בינוני למחרת.
מוסיפים ארבעה מיליליטר של תכנות מחדש בינוני לצינור חרוט 15 מיליליטר, ומ מניחים אותו באינקובטור O 2 הנמוך עם כובע משוחרר כדי לצייד בן לילה. למחרת בבוקר, להחליף את transfection המכיל מדיום עם בינוני רענן שצויד מראש בתוספת bFGF ו B18R ולהמשיך עם משטר transfection כמתואר בפרוטוקול. לאחר ציפוי מוצלח לתוך באר של מנה בפורמט שש היטב לתכנות מחדש, fibroblasts נראה דליל מאוד.
24 שעות לאחר ההתהפכות המוצלחת הראשונה, הפיברובלסטים איבדו את צורת הציר שלהם ואימצו מורפולוגיה מעוגלה יותר. במהלך שלושת ההתמרות הראשונות, צפיפות התאים גדלה בהדרגה ובעקביות עם פרץ לכאורה של התפשטות המתרחש בין ימים שבע לשמונה. ביום 10, התאים נראו בעיקר נוחים.
המושבות הראשונות של שב"ס הופיעו כבר ביום ה-11. בימים 15 עד 17, מושבות IPSC הפכו גדולות וברורות וברורות מהפיברובלסטים שמסביב ותכנתו מחדש לחלוטין. כשל חיסוני עבור סמן pluripotency TRA-1-60 אישר יעילות תכנות גבוהה.
צפיפות ציפוי תת-אופטימלית היא הסיבה הנפוצה ביותר ליעילות מופחתת של תכנות מחדש בפרוטוקול זה. אם צפיפות הציפוי הייתה נמוכה מדי, הופיעו טלאי ברון גדולים ומושבות IPSC לא נוצרו. לאחר מעבר דילול של תאים מתוכנתים מחדש, IPSCs גדלו כמושבות בודדות היו להבחין בקלות fibroblasts.
הם היו ארוזים באופן רופף ולתאים בודדים היה אזור ציטופלסמי גדול יחסית. במהלך ארבעה עד שבעה ימים, IPSCs התפשטו ויצרו מושבה צפופה אופיינית עם קצוות מוגדרים. תאים בודדים בתוך המושבה הראו שבר גרעיני גדול עם גרעין בולט.
לאחר תכנות מחדש של fibroblasts החולה, IPSCs וכתוצאה מכך ניתן להבדיל לתוך מגוון רחב של תאים סומטיים על מנת להבהר מחלות גרימת מנגנונים או לפתח טיפולים מבוססי תאים רגנרטיביים חדשניים.
