높은 효율로 인해, 이 방법은 인간 질병을 연구하고 새로운 줄기 세포 치료를 개발하기위한 도구로 유도 된 만능 줄기 세포 또는 IPSC를 더 발전 시킬 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 재프로그래밍하기 어려운 질병, 관련 질병, 노인 및 노화 섬유아세포를 포함하여 1 차적인 인간 섬유아세포로부터 고품질 통합 무료 IPSC를 생성하는 기능입니다. 이 방법의 성공은 섬유 아세포의 최적의 RNA 형질 효율에 달려 있습니다.
그리고 형질 전환 버퍼의 pH를 조정하는 것은 이를 달성하기 위한 핵심 절차이다. 시작하려면 500 밀리리터와 100 밀리리터 실온을 사용하여 신선한 감소 혈청 매체의 병을 사용하여 트랜스페션 버퍼를 준비하십시오. pH 미터의 유리 전극을 완충제에 삽입하여 500 밀리리터 병에서 배지의 기본 pH를 측정하고 pH를 읽기 전에 최대 1분 정도 기다립니다.
pH를 조정하려면 수산화 나트륨 1개 중 3~4밀리리터를 500밀리리터 병에 넣습니다. 병을 닫고 잘 섞습니다. 5분 간 기다린 후 병을 열고 pH 미터의 전극을 버퍼에 삽입합니다.
pH 미터의 판독값이 안정될 때까지 기다립니다. pH가 8.15에서 8.17에 도달할 때까지 소량의 수산화 나트륨을 계속 추가하여 공정 중에 pH 미터를 여러 번 보정합니다. 0.22 마이크로미터 진공 여과 시스템을 사용하여 전환 버퍼를 필터링합니다.
최소한의 공기 공간을 가진 5개의 밀리리터 튜브에 멸균 된 버퍼를 알리쿼트합니다. 다시 프로그래밍할 섬유아세포가 40%에서 60%의 인플루엔자에 있는지 확인합니다. DPBS의 4밀리리터를 15밀리리터 원뿔튜브로 옮기고, 재조합 인간 라미닌 521의 마이크로리터 100을 추가합니다.
위아래로 파이프를 통해 완전히 섞으세요. 희석 된 재조합 인간 라미닌 521의 우물 당 1 밀리리터를 6 개의 우물의 세 개의 우물에 넣습니다. 이 코팅 된 접시를 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하십시오.
이 잠복기 동안, 섬유 아세포 팽창 매체의 따뜻한 6 밀리리터와 37섭씨에 중간 도금 매체의 4 밀리리터. 밀리리터당 200 나노그램의 최종 농도에서 밀리리터당 100 나노그램과 B18R의 최종 농도에서 기본 FGF로 도금 매체를 보완하십시오. 조심스럽게 40 %에서 60 %의 합류에있는 섬유 아세포에서 소비 된 매체를 흡인.
DPBS의 5 밀리리터로 세포를 헹구는 다. 트립신 EDTA의 3 밀리 리터를 추가하고 부드럽게 트립신 EDTA로 세포를 커버하기 위해 접시를 흔들어. 과잉 액체를 흡인시키고, 트립신의 약 500 마이크로리터를 남기고, 섭씨 37도에서 3분 동안 섬유아세포에 배양한다.
인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후, 단단히 그러나 조심스럽게 접시의 측면을 눌러 세포를 빼낸다. 현미경의 밑에 세포를 보기 위하여 그(것)들이 분리되었는지 확인합니다. 트립신 EDTA를 중화시키기 위해 분리 된 세포에 섬유 아세포 팽창 매체의 5 밀리리터를 추가합니다.
15 밀리리터 원모 관에서 세포를 수집하고 잘 섞는다. 혈종계를 사용하여 세포를 계산한 다음 파이펫 12, 000 세포를 이전에 준비된 사전 데운 도금 매체의 4밀리리터로 계산합니다. 인큐베이터에서 코팅 된 플레이트를 제거 한 후 우물에서 라미닌 521을 흡인하여 우물 표면이 건조하지 않도록합니다.
도금 매체에 있는 세포를 부드럽게 재일시 중단하고 잘 코팅된 각 에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 추가합니다. 도금 된 세포를 낮은 산소 또는 산소가 5 %로 설정된 삼가스 조직 배양 인큐베이터에 넣고 위로, 왼쪽 오른쪽 운동 사이를 번갈아 가며 세포를 부드럽게 분산시키고 두 번 더 움직임을 반복하여 플레이트를 소용돌이지 않도록합니다. 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
한편, 15 밀리리터 원모형 튜브에 리프로그래밍 매체 4밀리리터를 추가하고, 하룻밤 동안 평형화하기 위해 풀린 캡을 가진 낮은 O 2 인큐베이터에 넣습니다. 형질 전환 하기 전에 적어도 한 시간 전에, 낮은 O 2 인큐베이터에서 평형 리프로그래밍 매체를 제거. 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도에 bFGF를 추가하고, B18R을 밀리리터당 200 나노그램의 최종 농도에 추가하고 잘 섞는다.
한 번에 잘 작동하면 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 소비된 매체를 제거합니다. 그리고 bFGF와 B18R로 보충 된 재프로그래밍 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 세포를 가진 접시를 낮은 산소 인큐베이터로 다시 이동합니다.
섬유아세포 전형을 시작하려면 먼저 실온에서 약 1시간 동안 경질 완충제의 알리쿼트를 상위화한다. 수정된 MRNA의 33마이크로리터 알리쿼트와 MIRNA의 14마이크로리터 알리쿼트(aliquots)를 음수 섭씨 80도에서 제거하고 해동될 때까지 약 3~5분 동안 실온으로 데워집니다. 마이크로퍼지에서 잠시 아래로 회전합니다.
약 3~5분 동안 실온으로 트랜스페트 시약을 데우기. 튜브를 2~3회 반전하여 시약을 혼합하고 미세 분리기에서 간단히 아래로 회전시하십시오. 실온 트랜스퍼션 버퍼 279마이크로리터를 RNA 무료 마이크로센트심분리기 튜브로 옮기고, 31마이크로리터의 트랜스페션 시약을 추가한다.
파이펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분간 배양합니다. 실온 트랜스퍼션 버퍼 132마이크로리터를 수정된 MRNA의 33마이크로리터 알리쿼트에 넣고 부드럽게 파이펫을 섞습니다. 실온 트랜스퍼션 버퍼102.6 마이크로리터를 MIRNA 모방의 14 마이크로리터 알리쿼트에 넣고 부드럽게 파이펫을 섞어 넣습니다.
수정된 MRNA의 전환 혼합을 준비하려면 310 마이크로리터 경질 버퍼의 165마이크로리터를 트랜스페션 버퍼의 165마이크로리터에 추가하여 수정된 MRNA 믹스를 수정했습니다. 파이펫을 섞어. MIRNA 모방의 전환 혼합을 준비하려면 310 마이크로리터 경질 버퍼의 116.6 마이크로리터를 116.6 마이크로리터 트랜스페션 버퍼에 추가하여 116.6 마이크로리터 트랜스페션 버퍼에 KRNA 모방믹스를 추가합니다.
잘 섞고 실온에서 15분 동안 배양하여 수정된 MRNA 및 MIRNA 모방으로 트랜스펙트 버퍼가 복잡해질 수 있도록 합니다. 낮은 산소 인큐베이터에서 세포로 플레이트를 제거합니다. 각 우물에 현명하게 떨어뜨리고, 복잡하고 수정된 MRNA를 포함하는 트랜스페션 믹스의 웰당 100 마이크로리터를 추가합니다.
접시를 위로 위로 가볍게 교반한 다음 오른쪽 왼쪽 움직임을 통해 트랜스페션 컴플렉스를 분산시합니다. 복잡한 MIRNA 모방을 포함하는 형질 믹스의 웰 당 66.7 마이크로 리터를 추가 각 우물에 걸쳐 현명하게 드롭. 접시를 위로 위로 가볍게 교반한 다음 오른쪽 왼쪽 움직임을 통해 트랜스페션 컴플렉스를 분산시합니다.
전자 감염 된 세포와 플레이트를 낮은 산소와 트라이 가스 인큐베이터에 배치합니다. 투명하게 접시를 위아래로 교반한 다음 오른쪽 왼쪽으로 움직여 트랜스펙트 복합체를 분산시합니다. 다음 날 배지를 변경하기 전에 인큐베이터에서 16~20시간 동안 감염된 세포를 배양한다.
15 밀리리터 원모형 튜브에 리프로그래밍 배지 4밀리리터를 추가하고, 하룻밤 동안 평형화하기 위해 풀린 캡이 있는 낮은 O 2 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 아침, 배지를 함유하는 형질전환을 bFGF 및 B18R로 보충한 신선한 미리 평형된 배지로 대체하고 프로토콜에 설명된 바와 같이 경질 요법을 계속한다. 재프로그래밍을 위한 6가지 웰 포맷 접시의 우물로 성공적으로 도금한 후 섬유아세포는 매우 희소해 보였습니다.
첫 번째 성공적인 회전 후 24 시간, 섬유 아세포는 그들의 스핀들 모양을 분실하고 더 둥근 형태를 채택했습니다. 처음 3개의 transfections를 통해, 세포 밀도는 7 일과 8 일 사이에서 일어나는 명백한 파열로 점차적으로 일관되게 증가했습니다. 10일째가 되면 세포는 대체로 혼잡해 보였다.
첫 번째 IPSC 식민지는 11 일 초에 나타났다. 일 15 받는 날 17, IPSC 식민지 크고 분명 하 고 명확 하 게 주변 및 완전히 다시 프로그래밍 된 섬유 아 세포에서 구별 되었다. 자공성 마커 TRA-1-60에 대한 면역 염색은 높은 리프로그래밍 효율을 확인하였다.
최적이 아닌 도금 밀도는 이 프로토콜에서 재프로그래밍의 효율성을 저하시키는 가장 일반적인 이유입니다. 도금 밀도가 너무 낮으면 큰 세포 남작 패치가 나타나고 IPSC 식민지가 형성되지 않았습니다. 다시 프로그래밍 된 세포의 희석 통과 에 따라, IPSC는 단일 식민지로 성장하고 쉽게 섬유 아세포에서 구별했다.
그(것)들은 느슨하게 포장되고 개별적인 세포는 상대적으로 큰 세포질 영역이 있었습니다. 4~7일 동안 IPSC는 확산되어 정의된 가장자리가 있는 특징적인 밀집 식민지를 형성했습니다. 식민지 내의 개별 세포는 눈에 띄는 핵을 가진 큰 핵 분획을 보여주었습니다.
환자 섬유아세포를 재프로그래밍한 후, 결과 IPSCs는 메커니즘을 유발하는 질병을 해명하거나 새로운 재생 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 다양한 체세포로 분화될 수 있다.
