Dr. Njoku, bu modelin formülasyonuyla sonuçlanan rehberliği ve anlayışlı tartışmaları için Dr. Noel R. Rose, MD PhD'ye teşekkür etmek istiyor.

Tüm prosedürler hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.
1. Hepatik S-100 sitozolik proteinlerinin veya bir CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu
NOT: İlk olarak, trifloroasetillenmiş S100 (TFA-S100) ve trifloroasetillenmiş CYP2E1 epitopunu (TFA-JHDN5) hazırlayın. Çünkü bağışıklamalar için sinjenik S100 proteinlerine ihtiyaç vardır ve immünojeni üretmek için BALB / c fareleri gereklidir. Preparat büyük miktarda immünojen verir; Bu nedenle, bu bölümü yılda yaklaşık dört kez gerçekleştirmeyi bekleyin. TFA-JHDN5'i yapmak için aynı yöntem kullanılacaktır. CYP2E1 epitopu (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, sıralanabilir veya satın alınabilir.
<ol><li>Karaciğerin S100 fraksiyonunun izolasyonu.
	<ol>
<li>4 - 6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile 5-10 BALB / c farenin sedasyonunu takiben, kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın.</li>
		<li>Mikrocerrahi makas kullanarak, orta hat kesisi kullanarak karın içi içeriği açığa çıkarın ve kanı çıkarmak için inferior vena kavada küçük bir kesim yapın.</li>
		<li>Portal ven içine 24 gauge anjiyokateter yerleştirin ve karaciğeri 4 ° C'de bir su banyosunda 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile 10 mL / dak perfüze edin. Biriken karaciğerleri çıkarın ve tartın ve küçük parçalara (10 – 15 mm) kesin. NOT: Ötenazi, intraperitoneal ilave ketamin / ksilazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) enjeksiyonu, ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.</li>
		<li>Üreticilerin tavsiyelerine göre Komple Proteaz inhibitörü Kokteyl tabletleri ile desteklenmiş sakkaroz (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homojenizasyon tamponunun (pH 7.4) ağırlığının 4 katı ekleyin (bkz. 15 mL'lik bir polipropilen tüpte, genel bir laboratuvar doku homojenizatörü kullanarak, pürüzsüz olana kadar buz üzerinde orta hızda homojenize edin. Homojenizasyon sırasında dokunun ısınmasını önlemek için buz üzerinde homojenize edin.</li>
		<li>Karaciğeri 10 dakika boyunca 1500 x g'de homojenize eden santrifüj yapın ve ardından süpernatanı dökün. Süpernatantı 100.000 x g'de 1 saat boyunca santrifüj edin. Süpernatantı çıtçıtlayın ve -80 ° C'de saklayın. Süpernatant sitozolik S-100'dür.</li>
	</ol></li>
	<li>S100 ve JHDN5'in trifloroasetilasyonu NOT: S-100'ün lizin kalıntılarının ε-amino gruplarının trifloroasetilasyonu, Satoh18 prosedürüne göre gerçekleştirilecektir. Bu deneyin diyalizin son günleri hariç tüm bölümleri duman davlumbazında gerçekleştirilir.<ol>
<li>Bisinkoninik asit tahlili (BCA testi)7 kullanarak sitozolik S-100'ün toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. 20 mg BALB/c fare S100 veya JHDN5 ila 10 mL'yi 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde dH2O ile seyreltin. 1N KOH ile pH'ı 10'a ayarlayın.</li>
		<li>Çözeltiye 4.7 mmol S-etiltriflorotiyoasetat (S-ETFA) ekleyin. KOH'u damlacık şeklinde yaklaşık 1 saat uygulayarak pH'ı 1N KOH ile 9.9 – 10.0 arasında tutun. Her reaksiyon için toplam KOH hacmini kaydedin.</li>
		<li>Çözeltileri ayrı diyaliz kasetlerine aktarın (Aşırı doldurmayın). Kasetleri günde üç değişiklikle 4 L dH 2 O'ya karşı72saat boyunca diyalize edin. Diyalizden sonra, TFA-S100 veya TFA-JHDN5'in son hacmini kaydedin ve ardından etiketli tüplere aliquot yapın. Dondurun ve –80 °C'de saklayın.</li>
		<li>Tahmini konsantrasyon, S100 veya JHDN5'in (mg cinsinden) başlangıç miktarının diyaliz sonrası son hacme (mL) bölünmesiyle belirlenir. Doğal protein19'un yüzde modifikasyonunu belirlemek için, her bir doğal ve TFA ile değiştirilmiş proteinin 1.0 mg'ını (son konsantrasyon 1.0 mg'dan büyükse) ayrı mermi tüplerinde dH 2 O ile 1.0 mL'yeseyreltin ve 1.0 mL dH2O kullanarak bir boşluk hazırlayın. TFA ile değiştirilmiş proteinin konsantrasyonu 1.0 mg'dan azsa, seyreltmeyin.<ol>
<li>96 kuyucuklu bir plakanın kuyularını ayırmak için, boş, doğal ve değiştirilmiş proteinlerden 50 μL ekleyin. Her bir oyuğa 50 μL% 4 NaHCO3 ve ardından 50 μL% 0.1 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit ekleyin.</li>
			<li>Plakayı 2 saat boyunca 40 ° C'de inkübe edin. Kuluçkayı takiben, her bir kuyucuğa 50 μL% 10 SDS ekleyin ve ardından 25 μL 1N HCl ekleyin.</li>
			<li>334 nm'lik OD'de okuyun ve daha sonra 334 nm'de absorbanstaki karakteristik düşüşü doğrulamak için her bir bileşiğin 200 – 600 nm arasındaki absorbansını kaydedin. Aşağıdaki formülü kullanarak lizin kalıntılarının TFA tarafından yüzde modifikasyonunu hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hepatiti indüklemek için farelerin bağışıklanması
NOT: DIH, BALB / c farelerinde, triflorasetil klorür (TFA), bir model ilaç-metabolit, TFA-S1006 veya TFA9, hepatit, otoreaktif T hücreleri ve CYP2E1 otoantikorlarını indükleyen TFA-JHDN5 tarafından kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu tarafından kovalent olarak değiştirilmiş karaciğer sitozolik proteinleri ile yapılan bağışıklamalarla modellenmiştir. Fareler, ilk immünizasyondan 2 hafta sonra dalak aktivasyon fazı ve granülositik inflamasyon ile karakterize 3 hafta boyunca hepatik bir faz sergiler. Dişi BALB / c fareleri bu modelde hepatite karşı erkeklerden daha hassastır.
<ol><li>0. günde, 6-8 haftalık BALB / c farelerini, boynun tabanında, eşit hacimlerde tam Freund adjuvanı (CFA) olarak emülsifiye edilmiş 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile deri altından bağışıklayın. 0. günde, fareleri arka ayaklardan birinde kas içinden 50 ng boğmaca toksini ile bağışıklayın. 7. günde, her farenin aynı immünojenin iki enjeksiyonunu almasını sağlamak için fareleri kuyruğun tabanında deri altından 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile eşit hacimlerde emülsifiye edilmiş TFA-JHDN5 ile bağışıklayın. NOT: Fareler, aşılamayı takip eden ilk 6 saat boyunca saatlik olarak ve daha sonra bir hafta boyunca günde en az iki kez izlenir. Fareler kambur duruş veya karıştırılmış kürk gibi ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteriyorsa, lokal ACUC'ye uygun olarak analjezikler uygulanmalıdır. Önemli ağrı veya sıkıntı kaydedilirse, ötanazi gerekli olup olmadığını belirlemek için fareler bir veteriner tarafından değerlendirilmelidir.</li>
	<li>Akış sitometrisi kullanılarak tüm öz-proteinlere, öz-proteinlerin epitoplarına veya TFA haptenine CD4 + T hücresi immün yanıtlarının belirlenmesi
	<ol>
<li>Farelerin intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sedasyonunu takiben, adım 1.1.1'de tarif edildiği gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın ve ardından mikrocerrahi makas kullanarak karın içi boşluğu açığa çıkardıktan sonra dalağı tanımlayın. Dalağı pedikülde kesin ve PBS / % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Ötenazi, farelerde intraperitoneal ek ketamin / ksilazin enjeksiyonu (80 mg / kg: 8 mg / kg), ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenecektir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.</li>
		<li>Buzlu cam slaytlar kullanarak hücreleri serbest bırakın ve 50 mL'lik konik polipropilen tüpe aktarın. PBS/%2 FCS ile hacmi 50 mL'ye çıkararak ve tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak 335 x g'de santrifüj yaparak yıkayın. Süpernatantı dökün ve bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>1 dakika boyunca 1 mL ACK Lysing arabelleği kullanarak kırmızı hücreleri çıkarın ve PBS/%2 FCS ile 50 mL'ye kadar ses getirin. 335 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı dökün.</li>
		<li>Hücreleri sayın. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca CFSE ile etiketleyin. Tek hücreli süspansiyonları, PBS / % 2 FCS'de kuyu başına 3x10 6 hücre / mL'lik6 kuyucuk plakasına askıya alın.</li>
		<li>Etiketli hücreleri CYP2E1, JHDN5 veya TFA-OVA (10 μg / mL) ile 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO2,% 95 havada (nemlendirilmiş) uyarın. Kuluçkadan sonra, hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-APC (1:100) ile boyayın ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analiz edin.</li>
		<li>CD4 + CFSE + hücrelerini tanımlamak için aşağıdaki geçit stratejisini kullanın: CD4 + CFSE + hücreleri, kapılı canlı hücrelerden tanımlanacak ve çoğalan hücrelerin histogramları olarak görüntülenecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bağışıklık sistemi hücrelerine sızan bağışıklık hücrelerinin immünize farelerden izolasyonu. 
	<ol>
<li>14. günde veya 21. günde karaciğerlere sızan bağışıklık hücrelerini izole etmek için, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile intraperitoneal enjeksiyonla anestezi yapın ve adım 1.1.1'de açıklandığı gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın. 1.1.2'de tarif edildiği gibi mikro cerrahi makasla yapılan bir orta hat insizyonu kullanılarak laparotomi yapıldıktan sonra, portal veni 25 gauge iğne ile kanüle edin ve daha sonra böbrek damarlarının altındaki inferior vena kavayı kesin.</li>
		<li>Her karaciğeri 37 °C'lik bir su banyosunda 40 mL PBS ile 10 mL / dak akış hızında perfüze edin. Perfüzyondan sonra, mikro cerrahi makas kullanarak, karaciğeri hepatik pedikülde kesin, safra kesesini çıkarın ve ardından karaciğeri hilumda kesin.</li>
		<li>20 mL steril şırınga havanesi ve soğuk PBS kullanarak karaciğeri bir ağ paslanmaz çelik elek üzerinde bozun. Elde edilen hücre süspansiyonunu, 300 mesh elek kullanarak 50 mL önceden sterilize edilmiş santrifüj tüplerine filtreleyin. Soğuk PBS kullanarak her süspansiyonu 50 mL'ye getirin ve ardından süspansiyonu 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın.</li>
		<li>Süpernatantı atın ve daha sonra her peleti tedavi yoluyla yeni 50 mL tüplere havuzlayın (fare başına bir tüp önerilir; ancak, numuneler bir araya getirilirse, 2-4 pelet / tüp önerilir). Havuzlanmış peletleri 45 mL Percoll% 35 (PBS'de) ve 100 IU / mL heparin içinde askıya alın.</li>
		<li>Her tüpü 20 ° C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 5 mL PBS'de askıya alın ve daha sonra buz üzerinde 10 dakika boyunca her pelete 1 mL ACK lizing tamponu ekleyin.</li>
		<li>Her tüpü PBS ile 50 mL'ye getirin ve 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Süpernatantı atın ve daha sonra hücreleri PBS / 2% FCS ile 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Hücreleri sayın.</li>
		<li>
Akış sitometrisi kullanılarak hücre tipinin analizi NOT: İşte indüklenmiş Foxp3+Treg'lerin nasıl algılanabileceğine dair bir örnek.<ol>
<li>1x106 hücreyi FcR bloke edici reaktif ile inkübe edin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-FITC, CD25-PE ve CD45-PerCP'nin 1:100 seyreltilmesiyle lekeleyin. Daha sonra, hücreleri hücre içi olarak FoxP3-APC ile lekeleyin.</li>
			<li>Hücreleri 250 μL fiksasyon tamponu ile sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analize kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
			<li>Akış sitometrisi kullanarak karaciğer, dalak veya lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlarda indüklenen Foxp3 + Treg'leri tespit etmek için aşağıdaki geçit stratejisi önerilir: Canlı / Ölü Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre leke kitini kullanarak canlı hücreleri tanımlayın. Daha sonra, CD45 + (PerCP, klon RA3-6B2) olan karaciğer hücrelerine kapı ve CD45 + kapısından kapı CD4 + hücreleri (FITC, klonGK1.5). CD4 + hücrelerinden, CD25 + (PE, klon 7D4) ve FoxP3 + (APC, klon 3G3) hücrelerinin yüzdelerini tanımlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hepatit için karaciğer dokularının histolojik analizi
	<ol>
<li>21. günde, karaciğer bölümlerini (5 μm kalınlığında) % 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin ve Hematoksilin ve Eosin ile lekeleyin.</li>
		<li>Histoloji puanlarını önce düşük güçte (40X) ortalama 2 görüntülemede belirleyin ve 64X'te onaylayın. Doku bölümlerini aşağıdaki gibi puanlayın: Derece 0 = iltihap veya nekroz yok; Derece 1 = nekroz olmadan minör lobüler inflamasyon; Derece 2= kesitin %<50'sini tutan lobüler inflamasyon; Derece 3 = kesitin ≥% 50'sini içeren lobüler inflamasyon; ve Grade 4 = nekroz ile iltihaplanma.</li>
	</ol></li>
	<li>Dalak ve karaciğerlerde doku sitokin düzeylerinin belirlenmesi. 
	<ol>
<li>14. gün veya 21. günde, her fareden alınan karaciğer veya dalak örneklerini (1 g) 1 mL RPMI/%2 FCS içinde, orta ayarda genel bir laboratuvar homojenizatörü kullanılarak pürüzsüz hale getirilene kadar homojenize edin. Numuneyi buz üzerinde soğuk tutun.</li>
		<li>Soğutulmuş bir masaüstü santrifüj kullanarak homojenatı 4 °C'de 1455 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çırpın ve kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Sitokin ve kemokin seviyeleri, kit talimatlarına göre ticari ELISA kitleri ile ölçülebilir. Seviyeleri (mL veya μL cinsinden) dokunun pg / g'sine dönüştürerek sitokin seviyelerini standartlaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>CYP2E1, CYP2E1 epitopu JHDN5 ve TFA ilaç metabolitine karşı serum antikorlarının saptanması.
	<ol>
<li>14 veya 21. günlerde, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sakinleştirin. Kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak, ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın. Bir tüberkülin şırıngasına bağlı 25 G'lik bir iğne kullanın ve iğneyi yavaşça kaburgaların altındaki göğüs boşluğuna ve hemen ksifoid sürece yanal olarak ilerlederek kalbe yaklaşın. İntrakardiyak ponksiyon kullanarak kan toplayın.</li>
		<li>Kan toplandıktan sonra, oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin verin. Kan örneklerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 295 x g'de santrifüj yapın. Serumları dikkatlice çıkarın, serumları aliquot edin ve -20 ° C'de dondurun.</li>
		<li>100 μL CYP2E1, JHDN5 veya TFA-ovalbümin (OVA) test antijenlerini (PBS'de 5 μg / mL) 96 kuyucuk plakasına gece boyunca 4 ° C'de en az 18 saat boyunca uygulayın. Ertesi gün, plakaları yıkama tamponu (PBS / % 2 FCS), 2 döngü (her biri 4 yıkama) ile yıkayın.</li>
		<li>PBS/%2 FCS'de 100 μL fare serumu (1:100) uygulayın ve plakalara üçlü olarak uygulayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. 2 saat sonra, plakaları adım 2.6.2'de açıklandığı gibi yıkama tamponu ile yıkayın.</li>
		<li>2 saat boyunca 100 μL Alkalen fosfataz (AKP)-keçi anti-fare IgG, AKP-sıçan anti-fare IgG1 veya AKP-sıçan anti-fare IgG2a sekonder antikorları (1:1000) ekleyin, ardından yıkama tamponu ile 1 döngü ve PBS ile 1 döngü yıkama adımı. Bir AKP substrat kiti kullanarak antikorları tespit edin ve bir spektrofotometre ile her 15 dakikada bir OD 405 nm'de ölçüm yapın. TFA genellikle 15 dakika içinde tamamen gelişirken, CYP2E1 ve CYP2E1 epitopu 30 ila 60 dakika7 arasında gelişebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>JHDN5 IgG ile indüklenen oksidatif stresin in vitro gelişimi üzerine çalışmalar.
	<ol>
<li>12 kuyucuk plakası kullanarak, CYP2E1 aktivitesini en üst düzeye çıkarmak için önerildiği gibi, 37 ° C'de, 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde glutamin ve genel takviye ile desteklenmiş 1000 μL Williams E ortamındaki fibronektin kaplı kapak kaymalarında kuyu başına 106 terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreyi inkübe edin.</li>
		<li>Kuyuları ayırmak ve 37 °C, %5 CO2, %95 nemde 2 saat kuluçkaya yatırmak için JHDN5 IgG (1:40) veya fare IgG (1:1000) ekleyin. Hibridoma serumları çok seyreltikti. Tüm kuyucuklara 30 dakika daha koyu kırmızı floresan antikor dedektörü ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Kuyucukları karanlıkta 1 mL PBS ile 3 kat yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca% 3.7 formaldehit içinde sabitleyin. 24 saat içinde konfokal mikroskopi ile inceleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>JHDN5 IgG'nin in vitro mitokondri gibi hücre içi organellerle birlikte lokalizasyon çalışmaları. 
	<ol>
<li>JHDN5 IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunu göstermek için, seyrek kültür (~% 30 birleşim), fibronektin kaplı kapak üzerindeki terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreler, adım 2.7'de açıklandığı gibi boyasız Williams'ın media E'sinde 7 gün boyunca kaymaktadır.</li>
		<li>Doğru absorpsiyon dalga boylarını belirledikten sonra, 2 saat (37 °C), %5 CO2, %95 nem için yeşil floresan, 488 nm konjuge fare IgG veya JHDN-5 (1:100) ve Kırmızı floresan, 594 konjuge Mito-tracker Kırmızı (1:100) ekleyin.</li>
		<li>Etiketli fibronektin kaplı kapak kaymalarını DAPI ile Anti-solma Reaktifi ile monte edin ve konfokal mikroskopi ile inceleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Genel protokol notları
<ol><li>Bileşikler klinik kullanım formülasyonunda mevcut olmadığında farmasötik olmayan sınıf araçları kullanın. Ancak, bu araçların her birini bu yöntemde tanımlanan güvenilir ticari tedarikçilerden edinin. Her zaman Amerikan Kimya Derneği Analitik Reaktifler Komitesi tarafından tanımlanan ve en azından reaktif sınıf seviyesine uygun kimyasallar kullanın. Yöntemlerimiz için, mümkün olduğunda analitik sınıf düzeyinde reaktifler kullanın.</li>
	<li>Hayvan refahını veya verilerin yorumlanmasını olumsuz yönde etkileyebilecek kontaminasyonu önlemek için TFA ile değiştirilmiş proteinlerin formülasyonu için katı aseptik tekniği izleyin.</li>
	<li>Farmasötik olmayan sınıf formülasyonları, mevcut teknik bilgilere göre, formülasyonun güçlü kalacağı sürelerde saklayın ve kullanın. CFA'yı oda sıcaklığında, CYP2E1 ve epitoplarını -20 veya -80 °C'de saklayın. TFA ile değiştirilmiş proteinleri -80 ° C'de saklayın ve CFA ile emülsifikasyondan önce 4 ° C'ye gelmesine izin verin. TFA değiştirilmiş proteinleri -80 ° C'de saklayın ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için alikotlarda saklayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune+liver+disease:+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease.">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li><li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence,+presentation,+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland.">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li><li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis:+a+diagnostic+challenge.">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li><li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis.">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li><li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis.">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li><li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB/c+mouse.">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li><li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+drug-induced,+immune-mediated+hepatitis,+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3++T-cell+activity.">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li><li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+hepatitis:+disease+induction,+time+course+and+T-cell+reactivity.">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li><li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis.">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li><li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+bias+in+experimental+immune-mediated,+drug-induced+liver+injury+in+BALB/c+mice:+suggested+roles+for+Tregs,+estrogen,+and+IL-6.">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).</li><li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity.">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li><li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis.">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li><li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis.">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li><li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury.">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li><li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+adducts,+circulating+antibodies,+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity.">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li><li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice.">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li><li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+autoimmunity.">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li><li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity:+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes.">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li><li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li><li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halothane+metabolism:+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides.">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li><li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid.">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu protokolün gücü, tekrarlanabilirliğine dayanır; Bu nedenle, önerilen adımlara uymak çok önemlidir. İmmünojenin formülasyonu bazıları için bir bariyer olabilir; Bununla birlikte, belgemizde açıklanan epitopu kullanarak modelimizi yeniden ürettik, bu da karaciğerin S100 fraksiyonunu izole etme ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Ek epitopların veya proteinlerin modifiye edilmesi ve bağışıklamaları takiben hepatiti indüklemesi muhtemeldir; ancak, kullandığımız proteinleri güvenilir sonuçlar...

Bu yöntemin amacı, in vivo gelişen ilaca bağlı otoimmün hepatitin fare modelini tanımlamak ve bu hastalığın moleküler, immünolojik ve genetik temelini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Çalışmalarımızın uzun vadeli amacı, duyarlı hastalarda DİH'yi inceleyerek kronik karaciğer inflamasyonu ve hasarının gelişiminden sorumlu mekanizmaları ortaya çıkarmaktır. Karaciğer hastalığı ve siroz, 25-64 yaş arası erişkinlerde altıncı en sık ölüm nedenidir. Bazen ilaca bağlı otoimmün hepatit (DIH) olarak adlandırılan idiosyncratic DILI, Amerika Birleşik Devletleri'nde akut karaciğer yetmezliğinin üçüncü en yaygın nedenidir. DIH, otoimmün hepatit1'li hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en yaygın hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadın 2,3,4'tür. İzofluran, sevofluran, desfluran veya halotan gibi halojenli uçucu anesteziklerin uygulanmasını takiben duyarlı bireylerde bir tür DIH gelişir. Bu anestezikler, metabolizmalarının reaktif ürünleri ile karaciğer proteinlerine kovalent olarak bağlanır, böylece alerjik veya otoimmün yanıtları ortaya çıkarabilen yeni otoantijenler oluşturur5.
Anestezik ve herhangi bir DIH formunun gelişiminde rol oynayan patojenik mekanizmaların incelenmesi, daha önce insan hastalığının indüksiyonunu yakından taklit eden bir hayvan modelinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Hastalarda immün aracılı DILI'ye benzeyen özelliklere sahip deneysel bir DIH murin modeli geliştirdik. Hepatit, sitokrom P450 2E1 (CYP2E1)5 enzimi tarafından anestezinin oksidatif metabolizmasını takiben oluşan trifloroasetil klorür (TFA) metaboliti tarafından kovalent olarak modifiye edilmiş iki otoantijenden biri ile immünizasyon ile indüklenir. Bir otoantijen, birkaç proteinin karışımı olan hepatik sitozolik S100 karaciğer fraksiyonudur6 ve ikinci otoantijen, anestezik immün aracılı DILI7'li hastalardan serumlar tarafından tanınan bir CYP2E1 epitopudur. Deneysel otoimmün hepatite nispeten dirençli olan BALB / c farelerini kullanarak, modelimizi C57Bl / 6J farelerde otoimmün hepatitin S100 kaynaklı immünizasyon modelinden ayırıyoruz8.
Çeşitli klinik prezentasyonları nedeniyle, DIH'nin hastalarda incelenmesi zordur. Translasyonel deneysel modeller, hastalığın patogenezini in vivo ve in vitro olarak değerlendirme olanağı sunmaktadır. Şu anda, DİH'yi indüklemek için, hayvan kullanmadan in vivo veya in vitro adaptif veya doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tam olarak inceleyen başka alternatif yöntemler yoktur. Dahası, S-100 veya CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu tahriş edici bir immünojen üretmediğinden ve TFA ile değiştirilmiş proteinlerle bağışıklama yoluyla DIH'yi indüklediğimizden, bu hayvanlara bağışıklama veya diğer prosedürlerden önce eter, herhangi bir halojenli anestezik, barbitürat veya alkol almayacaktır. Buna rağmen, keşfedilen CYP2E1 epitopu9'un bağlanma tercihlerini doğrulamak için bilgisayar simülasyonunu kullanarak fare kullanımımızı azalttık ve dişi BALB / c farelerinin daha şiddetli bir DIH10 geliştirdiğini göstererek kadın cinsiyetini içeren insan DIH'sini yansıttık.
Hastalarda DİH'nin çeşitli sunumlarına ve klinik hastalık çalışmalarındaki zorluklara rağmen, reaktif ilaç metabolitleri tarafından doğal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonu, halojenli anestezikleri takip eden patogenez DİH'de kabul edilen anahtar bir mekanizmadır11. Araştırmacılar ayrıca CYP2E1'in bu süreçte12,13 majör bir otoantijen olduğunu kabul etmektedir. Translasyonel olarak modifiye edilmiş bir CYP2E1 ve diğer karaciğer proteinlerini tanıyan interlökin (IL)-4-yukarı regüle CD4 + T hücrelerinin rolü, nötrofilleri, eozinofilleri ve mast hücrelerini karaciğer14'e çekerek anestezik DIH'nin kabul edilen bir başlatıcısıdır ve bu mekanizma DIH 15,16'nın birçok formunda doğrulanmıştır. İndüklenen FoxP3 eksprese eden CD4 + CD25 + T hücreleri (Tregs) DIH'nin şiddetini azaltır ve bu hücrelerin dalaktaki göreceli eksiklikleri DIH 10,7'yi kötüleştirir. Bu nedenle, DIH'yi anlamadaki ilerlemelerin çoğu, DIH'nin genetik, metabolik ve immünolojik mekanizmalarını hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için in vivo fare modellerinin kullanılmasıyla mümkün olmuştur.
Biz ve diğer araştırmacılar, farklı fare modelleri kullanarak DIH'nin başlatılmasında IL-4, nötrofiller ve eozinofiller için rolleri ortaya çıkardığımız için, bu gözlemin, kullanılan DIH modelinden bağımsız olarak, hepatit ve yaralanmanın IL-4 tarafından indüklendiği iddiamızı desteklediğine inanıyoruz. Protokolümüzün gücü, hem erkek hem de dişi fareler olmak üzere in vivo metodolojinin kullanılmasında ve histolojinin, CD4 + T hücre proliferasyon tahlillerinin ve sitokinlerin tekrarlanmasında yatmaktadır. İn vitro çalışmaları kullanmamızın gücü, DIH'yi yönlendiren hücresel etkileşimleri izole etmek için metodoloji sağlarken ihtiyaç duyulan fare sayısını azaltmalarıdır. Erkek ve dişi farelerin kullanılmasını öneriyoruz, çünkü bu, sonuçların yorumlanmasında bilinçsiz önyargı olasılığını azaltır ve DIH insidansı, prevalansı ve şiddeti kadınlarda daha yüksek olduğu için çalışmalarımızın çeviri potansiyelini güçlendirir17. Farelerin tek bir satıcıdan elde edilmesini öneririz; Bununla birlikte, bu mümkün değilse, genetiği değiştirilmiş farelerle aynı satıcıdan çöp eşi kontrolleri veya vahşi tip fareler edinin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28997</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AKP Substrate Kit</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">172-1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BALB/c mice</td>
			<td style="width:71px;">Jackson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">CFA H37Ra</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson (Difco Bacto)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">231131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FcR Blocking reagent</td>
			<td style="width:71px;">Milteyi</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">General supplement</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">HPRG770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepaRG&#8482; cells cryopreserved</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">HPR GC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit&#160;</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">L34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaHC03</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Percoll&#174;</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1644-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pertussis Toxin</td>
			<td style="width:71px;">List Biologicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce&#8482; Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">177474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">66810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure&#8482; SDS Solution, 10%</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Williams Media E, no phenol red</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A1217601</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of drug-induced, autoimmune hepatitis in balb/c mice for the study of its pathogenic mechanisms

İlaca bağlı otoimmün hepatit (DIH), otoimmün hepatitli hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en sık görülen hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadındır. Prevalansındaki bu cinsiyet farklılıklarının altında yatan mekanizmalar, insan hastalığını taklit eden hayvan modellerinin azlığı nedeniyle belirsizdir. Buna rağmen, altta yatan mekanizmaların insan lökosit antijen haplotipleri ve cinsiyet hormonları ile ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Buna karşılık, bir DIH fare modeli kullanarak, IL-4'ün bir sitokrom P450 2E1 epitopuna karşı yönlendirilmiş CD4 + T hücrelerini başlattığını, nötrofillerin, makrofajların ve mast hücrelerinin dişi BALB / c farelerinin karaciğerlerine akışını indüklediğini ortaya çıkardık. Bu modeli kullanarak, IL-33 ile indüklenen FoxP3 + düzenleyici T hücrelerinin dişi ve erkek farelerde DIH'ye karşı koruma sağladığını da gösterdik. Bu DIH modeli, farelerin DIH ile ilişkili bir ilaç metaboliti ile kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu ile aşılanması ile indüklenir. Bu epitop DIH'li hastalar tarafından tanınır. Yöntemimiz, DIH'nin patogenezini incelemek için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir hepatit ve otoantikorları indüklemektedir. İn vivo çalışmalar, yanlış yapıldığında farelerde aşırı ağrı ve sıkıntıya neden olabilirken, in vivo bir modelin avantajı, çok sayıda farede hastalığın patogenezini değerlendirme yeteneğidir. Ek olarak, değiştirilmiş karaciğer proteinlerinin biyolojik etkileri, invaziv prosedürler kullanılarak incelenebilir. Deneysel tasarıma in vitro çalışmaların eklenmesi, hücresel düzeyde hızlı tekrarlama ve mekanik analize izin verir. Bu nedenle, model protokolümüzü ve DIH'nin in vivo ve in vitro mekanizmalarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz.

Şekil 1'de gösterilen DIH'yi indüklemek için kullanılan bağışıklama programı, boynun tabanında (gün 0) ve kuyruğun tabanında (gün 7) gerekli olan iki bağışıklamayı temsil eder. Şekil 2, CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 epitopu ve anesteziklerin trifloroasetil (TFA) metabolitine yanıt olarak CFSE kullanılarak 14. günde elde edilen temsili proliferasyon verilerini göstermektedir. Şekil 3, 14. günde elde edilen indükle...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms at JoVE.com

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.9K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Video: Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

İnsan Bağırsak Epitel Hücreleri ve BALB / c Fare makrofajlar kullanarak Tolere edilebilir yağ asitleri ve Kolera Toksin Konsantrasyonları belirlenmesi

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

Miyelin Oligodendrosit Glikoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 Farelerde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Bağlı

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Glukoz-6-Fosfat İzomazlarında (G6PI)-Indüklenen RA Farelerde iNKT Hücrelerinin Benimseyici İmmünoterapisi

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...