Dr. Njoku gostaria de reconhecer o Dr. Noel R. Rose, PhD, por sua orientação e discussões perspicazes que resultaram na formulação deste modelo.

Todos os procedimentos foram aprovados pela comissão de cuidados e uso de animais.
1. Trifluoroacetilação de proteínas citosocidas hepáticas S-100 ou um epítope CYP2E1
NOTA: Primeiro, prepare o trifluoroacetilado S100 (TFA-S100) e o epítope CYP2E1 trifluoroatilado (TFA-JHDN5). Como as proteínas S100 síndicas são necessárias para imunizações, e os camundongos BALB/c são necessários para produzir o imunogênio. A preparação produz uma grande quantidade de imunogênio; então, antecipar a realização desta porção cerca de quatro vezes por ano. Um método idêntico será usado para fazer o TFA-JHDN5. O epítope CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, pode ser sequenciado ou adquirido.
<ol><li>Isolamento da fração S100 do fígado.
	<ol>
<li>Após a sedação de 5 – 10 camundongos BALB/c com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4 - 6 mg/kg de xilazina, confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de retirada), além da perda de reflexos de retardo e da perda de reflexos palpebrais.</li>
		<li>Usando uma tesoura microcirúrgica, exponha o conteúdo intra-abdominal usando uma incisão midline e faça um pequeno corte na veia cava inferior para remover o sangue.</li>
		<li>Coloque um angiocateter de 24 bitolas na veia portal e perfunde o fígado 10 mL/min com 40 mL de salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7.4 em um banho de água a 4 °C. Remova e pese os fígados agrupados e corte-os em pequenos pedaços (10 – 15 mm). NOTA: A eutanásia é induzida pela injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.</li>
		<li>Adicione 4 vezes o peso da sacarose (250 mM) -TRIS (10 mM)- Tampão de homogeneização EDTA (1 mM) (pH 7.4) complementado com comprimidos completos do inibidor de Protease (ver Tabela de Materiais) conforme recomendações dos fabricantes. Homogeneize-se em um tubo de polipropileno de 15 mL, utilizando um homogeneizador geral de tecido laboratorial em velocidade média no gelo até ficar homogêneo. Homogeneize-se no gelo para evitar que o tecido fique quente durante a homogeneização.</li>
		<li>Centrifugar o fígado homogeneiza a 1500 x g por 10 min e, em seguida, despeje o supernante. Centrifugar o supernante por 1 h a 100.000 x g. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C. O supernatante é o Csoúsico S-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Trifluoroacetilação de S100 e JHDN5 NOTA: A trifluoroacetilação dos grupos ε-amino de resíduos de liseina da S-100 será realizada de acordo com o procedimento de Satoh18. Todas as partes deste experimento, com exceção dos últimos dias de diálise, são realizadas no capô da fumaça.<ol>
<li>Determine a concentração proteica total do S-100 citosóico utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ensaio BCA)7. Diluir 20 mgs de rato BALB/c S100 ou JHDN5 a 10 mL com dH2O em um frasco de 70 mL Erlenmeyer. Ajuste o pH para 10 com 1N KOH.</li>
		<li>Adicione 4,7 mmole de S-ethyltrifluorothioacetato (S-ETFA), à solução. Mantenha o pH entre 9,9 e 10,0 com KOH 1N administrando KOH na moda gotícula por aproximadamente 1 h. Registo o volume total de KOH para cada reação.</li>
		<li>Transfira as soluções para fitas diálise separadas (Não enchimento demais). Dique as fitas por 72 h contra 4 L de dH2O com três mudanças por dia. Após a diálise, grave o volume final de TFA-S100 ou TFA-JHDN5 e, em seguida, aliquot em tubos rotulados. Encaixe o congelamento e armazene a -80 °C.</li>
		<li>Uma concentração estimada é determinada dividindo a quantidade inicial de S100 ou JHDN5 (em mg) pelo volume final após a diálise (mL). Para determinar a modificação percentual da proteína nativa19, diluir 1,0 mg de cada proteína nativa e alterada tfa (se a concentração final for superior a 1,0 mg) a 1,0 mL com dH2O em tubos de bala separados e preparar um branco usando 1,0 mL dH2O. Se a concentração da proteína alterada pelo TFA for inferior a 1,0 mg, não dilua<ol>
<li>Para separar os poços de uma placa de 96 poços, adicione 50 μL das proteínas em branco, nativas e alteradas. Adicione 50 μL de 4% NaHCO3 seguido por 50 μL de 0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno ácido sulfônico a cada poço.</li>
			<li>Incubar a placa a 40 °C por 2 h. Após a incubação, adicione 50 μL de 10 % SDS a cada poço seguido por 25 μL de 1N HCl.</li>
			<li>Leia em OD de 334 nm e, em seguida, registo absorvente de cada composto de 200 a 600 nm, a fim de confirmar a queda característica na absorvância a 334 nm. Calcule a modificação percentual dos resíduos de lise por TFA, utilizando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imunização de camundongos para induzir hepatite
NOTA: O DIH é modelado em camundongos BALB/c por meio de imunizações com proteínas citosóicas hepáticas que foram alteradas covalentemente por cloreto de trifluoracetil (TFA), um modelo de metabólito de drogas, TFA-S1006 ou um epítope de CYP2E1 covalentamente alterado por TFA9, TFA-JHDN5 que induz hepatite, células T autorativas e autoanticorpos CYP2E1. Os camundongos exibem uma fase de ativação esplênica 2 semanas após a imunização inicial e uma fase hepática por 3 semanas que é caracterizada por inflamação granulócítica. Camundongos BALB/c fêmeas são mais suscetíveis do que os machos à hepatite neste modelo.
<ol><li>No dia 0, imunizar camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas subcutâneos na base do pescoço com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsificadas em volumes iguais de adjuvante completo de Freund (CFA). No dia 0, imunizar os camundongos com 50 ng de toxina de coqueluche, intramuscularmente em uma das patas traseiras. No dia 7, imunizar os camundongos subcutâneamente na base da cauda com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsionados em volumes iguais de CFA para garantir que cada rato receba duas injeções do mesmo imunogênio. NOTA: Os camundongos são monitorados de hora em hora durante as primeiras 6 horas após a imunização e, em seguida, pelo menos duas vezes por dia durante uma semana. Se os camundongos demonstrarem sinais de dor ou angústia, como postura curvada ou peles de babados, os analgésicos devem ser administrados de acordo com a ACUC local. Se for observado dor ou angústia significativas, os camundongos devem ser avaliados por um veterinário para determinar se a eutanásia é necessária.</li>
	<li>Determinação de respostas imunes de células T CD4+ a auto-proteínas inteiras, epítopos de auto-proteínas ou o hapten TFA usando citometria de fluxo
	<ol>
<li>Após a sedação de camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com xilazina de 4-6 mg/kg via injeção intraperitoneal, confirme a profundidade adequada da anestesia conforme descrito na etapa 1.1.1 e depois identifique o baço após expor a cavidade intra-abdominal usando tesoura microcirúrgica. Corte o baço no pedículo e coloque em uma placa de Petri com soro de bezerro fetal PBS/2% (FCS). NOTA: A eutanásia será induzida nos camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.</li>
		<li>Solte as células usando lâminas de vidro foscos e transfira para um tubo de polipropileno cônico de 50 mL. Lave com PBS/2% FCS, elevando o volume para 50 mL e centrifugando a 335 x g usando uma centrífuga refrigerada no banco. Despeje o supernatante e repita este passo.</li>
		<li>Remova as células vermelhas usando 1 mL de tampão de lysing ACK por 1 min e traga volume de até 50 mL com PBS/2% FCS. Centrifugar a 335 x g e despeje o supernatante.</li>
		<li>Conte as células. Rotule as células com CFSE por 30 minutos no gelo no escuro, de acordo com as instruções do fabricante. Suspender suspensões de célula única em 6 placas de poço de 3x106 células/mL por poço em PBS/2% FCS.</li>
		<li>Estimule as células rotuladas com CYP2E1, JHDN5 ou TFA-OVA (10 μg/mL) por 72 h a 37 °C em 5% DE CO2, 95% de ar (umidificado). Após a incubação, colorigue as células com CD4-APC (1:100) por 30 minutos no gelo e analise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.</li>
		<li>Utilize a seguinte estratégia de gating para identificar células CD4+CFSE+: as células CD4+CFSE+serão identificadas a partir das células vivas fechadas e exibidas como histogramas de células proliferando.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de células imunes infiltradas de camundongos imunizados. 
	<ol>
<li>Para isolar as células imunes infiltradas nos fígados no dia 14 ou dia 21, anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina e confirmar a profundidade adequada da anestesia como descrito na etapa 1.1.1. Após laparotomia usando uma incisão midline feita com uma tesoura micro cirúrgica, como descrito em 1.1.2, cannulate a veia portal com uma agulha de calibre 25 e, em seguida, corte a cava vena inferior abaixo das veias renais.</li>
		<li>Perfunda cada fígado a uma taxa de fluxo de 10 mL/min com 40 mL de PBS em um banho de água 37 °C. Após a perfusão, usando uma tesoura micro cirúrgica, corte o fígado no pediculo hepático, remova a vesícula biliar e corte o fígado no hilum.</li>
		<li>Interrompa o fígado em uma peneira de aço inoxidável de malha usando um pilão de seringa estéril de 20 mL e PBS frio. Filtre a suspensão celular resultante em tubos de centrífuga pré-esterilizados de 50 mL usando uma tela de malha de 300. Leve cada suspensão a 50 mL usando PBS frio e depois lave a suspensão por centrifugação por 10 min a 370 x g.</li>
		<li>Descarte o supernasce e, em seguida, acumule cada pelota por tratamento em novos tubos de 50 mL (recomenda-se um tubo por rato; no entanto, se as amostras forem agrupadas, 2-4 pelotas/tubo são recomendadas). Suspenda as pelotas agrupadas em 45 mL Percoll 35% (em PBS) e 100 UI/mL heparina.</li>
		<li>Gire cada tubo a 500 x g por 10 min a 20 °C. Descarte o supernascimento e suspenda a pelota em 5 mL de PBS e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lise ACK a cada pelota por 10 minutos no gelo.</li>
		<li>Leve cada tubo a 50 mL com PBS e lave por centrifugação por 10 min a 370 x g. Descarte o supernasce e depois lave as células com PBS/2% FCS por centrifugação por 10 min a 370 x g. Conte as células.</li>
		<li>
Análise do tipo celular usando citometria de fluxo NOTA: Aqui está um exemplo de como foxp3+tregs induzidos podem ser detectados.<ol>
<li>Incubar células 1x106 com reagente de bloqueio fcr e mancha com diluições de 1:100 de CD4-FITC, CD25-PE e CD45-PerCP por 30 minutos no gelo. Em seguida, colora as células intracelularmente com FoxP3-APC.</li>
			<li>Fixar as células com 250 μL de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) e armazenar a 4 °C até a análise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.</li>
			<li>Recomenda-se a seguinte estratégia de gating para detectar Foxp3+Tregs induzidos em suspensões de células únicas de fígado, baço ou linfonodos usando citometria de fluxo: Identifique células vivas usando o kit de manchas Aqua Dead Cell Live/Dead Fixable. Em seguida, portão em células hepáticas que são CD45+ (PerCP, clone RA3-6B2) e células gate CD4+ (FITC, cloneGK1.5) do portão CD45+. Das células CD4+, identifique as porcentagens das células CD25+(PE, clone 7D4) e FoxP3+ (APC, clone 3G3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise histológica dos tecidos hepáticos para hepatite
	<ol>
<li>No dia 21, fixar as seções hepáticas (5 μm de espessura) em formalina tamponada 10% neutra e mancha com Hemaoxilina &Eosin.</li>
		<li>Determine as pontuações de histologia primeiro em baixa potência (40X) em uma média de 2 visualizações e confirme em 64X. Escore as seções teciduais da seguinte forma: Grau 0=sem inflamação ou necrose; Grau 1= inflamação lobular menor sem necrose; Grau 2= inflamação lobular envolvendo <50% da seção; Inflamação grau 3=lobular envolvendo ≥ 50% da seção; e grau 4=inflamação com necrose.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação dos níveis de citocina tecidual em baços e fígados. 
	<ol>
<li>No dia 14 ou dia 21, homogeneize as amostras de fígado ou baço (1 g) de cada rato em 1 mL de RPMI/2% FCS até suavizar usando um homogeneizador de laboratório geral em configuração média. Mantenha a amostra fria no gelo.</li>
		<li>Centrifugar o homogeneizado por 15 min a 1455 x g a 4 °C usando uma centrífuga de desktop refrigerada. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C até ficar pronto para uso. Os níveis de citocina e quimiocina podem ser medidos com kits comerciais elisa, conforme instruções do kit. Padronize os níveis de citocinas convertendo os níveis (em mL ou μL) em pg/g de tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de anticorpos de soro para CYP2E1, o epítope CYP2E1 JHDN5 e o metabólito da droga TFA.
	<ol>
<li>Nos dias 14 ou 21, sedeia os camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de abstinência), além da perda de reflexos de direito e perda de reflexos palpebrais. Utilize uma agulha de 25 G presa a uma seringa tuberculina e aproxime-se do coração avançando lentamente a agulha para a cavidade torácica sob as costelas e imediatamente lateral ao processo xifoide. Coletar sangue usando punção intracardiac.</li>
		<li>Uma vez coletado o sangue, deixe-o coagular à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras de sangue a 295 x g por 20 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a sera, aliquot a sera e escor ao congelamento de encaixe a -20 °C.</li>
		<li>Aplique 100 μL de antígenos de teste CYP2E1, JHDN5 ou TFA-ovalbumin (OVA) (5 μg/mL em PBS) a 96 placas de poço por pelo menos 18 h a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, lave as placas com tampão de lavagem (PBS/2%FCS), 2 ciclos (4 lavagens cada).</li>
		<li>Aplique 100 μL de sera de rato (1:100) em PBS/2% FCS em triplicado nas placas e incubar em temperatura ambiente por 2h. Após 2h, lave as placas com tampão de lavagem conforme descrito na etapa 2.6.2.</li>
		<li>Adicione 100 μL de fosfatase alcalina (AKP)-anti-cabra anti-mouse IgG, AKP-rat anti-mouse IgG1, ou akp-rat anti-mouse IgG2a anticorpos secundários (1:1000) por 2 h seguido por um passo de lavagem de 1 ciclo com tampão de lavagem e 1 ciclo com PBS. Detecte os anticorpos usando um kit de substrato AKP e meça em OD 405 nm a cada 15 minutos com um espectotúmetro. TFA geralmente se desenvolve completamente em 15 min, enquanto CYP2E1 e o epítope CYP2E1 podem desenvolver-se de 30 a 60 min7.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudos do desenvolvimento do estresse oxidativo induzido pelo IgG JHDN5 in vitro.
	<ol>
<li>Utilizando 12 placas de poço, incubar 106 células hepáticas terminatualmente diferenciadas por poço em deslizamentos de cobertura cobertos de fibronectina em 1000 μL de mídia Williams E complementadas com glutamina e suplemento geral (ver Tabela de Materiais) a 37 °C, 5% de CO2, 95% de umidade por 7 dias, conforme recomendado para maximizar a atividade CYP2E1.</li>
		<li>Adicione JHDN5 IgG (1:40) ou mouse IgG (1:1000) para separar poços e incubar por 2h a 37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade. Hybridoma sera foi muito diluído. Adicione detector de anticorpos fluorescentes vermelhos profundos (ver Tabela de Materiais) por mais 30 minutos a todos os poços.</li>
		<li>Lave os poços 3x com 1 mL de PBS no escuro. Fixar as células em 3,7% de formaldeído por 10 minutos. Examine por microscopia confocal dentro de 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudos de co-localização de JHDN5 IgG com organelas intracelulares como mitocôndrias in vitro. 
	<ol>
<li>Para demonstrar a co-localização do JHDN5 IgG com mitocôndrias, a cultura escassa (~30% de confluência) intereticamente diferenciadas células hepáticas em deslizamentos de cobertura cobertas de fibronectina por 7 dias na mídia E livre de corantes da Williams complementadas como descrito na etapa 2.7.</li>
		<li>Depois de determinar os comprimentos de onda de absorção corretos, adicione fluorescente verde, 488 nm -conjugado mouse IgG ou JHDN-5 (1:100) e fluorescente vermelho, 594-conjugado Mito-tracker Vermelho (1:100) para 2 h (37 °C), 5% CO2, 95% de umidade.</li>
		<li>Monte deslizamentos de cobertura cobertos de fibronectina com Reagente Anti-fade com DAPI, e examine por microscopia confocal.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Notas gerais do protocolo
<ol><li>Utilize ferramentas de grau não farmacêutico quando os compostos não estiverem disponíveis em uma formulação de uso clínico. No entanto, obtenha cada uma dessas ferramentas de fornecedores comerciais confiáveis identificados neste método. Use sempre produtos químicos que estejam de acordo com as especificações definidas pelo Comitê de Reagentes Analíticos da Sociedade Química Americana de pelo menos o nível de grau de reagente. Para nossos métodos, utilize reagentes de nível analítico sempre que possível.</li>
	<li>Siga uma técnica asséptica rigorosa para a formulação das proteínas alteradas pelo TFA, a fim de evitar contaminação que possa afetar negativamente o bem-estar animal ou a interpretação dos dados.</li>
	<li>Armazenar e utilizar formulações de grau não farmacêutico em durações para as quais a formulação permanecerá potente, de acordo com as informações técnicas disponíveis. Armazene CFA em temperatura ambiente, CYP2E1 e seus epítopos a -20 ou -80 °C. Armazene proteínas alteradas por TFA a -80 °C e deixe chegar a 4 °C antes da emulsificação com CFA. Armazene proteínas alteradas tfa a -80 °C e armazene em alíquotas para evitar ciclos de congelamento repetidos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune+liver+disease:+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease.">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li><li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence,+presentation,+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland.">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li><li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis:+a+diagnostic+challenge.">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li><li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis.">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li><li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis.">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li><li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB/c+mouse.">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li><li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+drug-induced,+immune-mediated+hepatitis,+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3++T-cell+activity.">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li><li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+hepatitis:+disease+induction,+time+course+and+T-cell+reactivity.">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li><li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis.">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li><li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+bias+in+experimental+immune-mediated,+drug-induced+liver+injury+in+BALB/c+mice:+suggested+roles+for+Tregs,+estrogen,+and+IL-6.">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).</li><li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity.">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li><li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis.">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li><li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis.">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li><li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury.">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li><li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+adducts,+circulating+antibodies,+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity.">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li><li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice.">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li><li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+autoimmunity.">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li><li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity:+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes.">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li><li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li><li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halothane+metabolism:+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides.">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li><li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid.">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A força deste protocolo repousa em sua reprodutibilidade; por isso, é fundamental aderir às etapas sugeridas. A formulação do imunogênio pode ser uma barreira para alguns; no entanto, reproduzimos nosso modelo usando o epítope descrito em nosso documento, que remove a necessidade de isolar a fração S100 do fígado. É provável que epítopos adicionais ou proteínas possam ser alterados e induzir hepatite após as imunizações; no entanto, descrevemos essas proteínas que usamos com resultados confiáveis. Vár...

O objetivo deste método é descrever um modelo de camundongo de hepatite autoimune induzida por drogas que se desenvolve in vivo e demonstrar como ela pode ser utilizada para investigar a base molecular, imunológica e genética desta doença. O objetivo de longo prazo de nossos estudos é descobrir mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de inflamação hepática crônica e lesão, estudando DIH em pacientes suscetíveis. A doença hepática e a cirrose constituem a sexta causa de morte mais comum em adultos entre 25 e 64 anos. DILI idiossincrática, às vezes referida como hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos. DIH é o processo de hipersensibilidade hepática mais comum, observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatiteautoimune 1. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres 2,3,4. Um tipo de DIH desenvolve-se em indivíduos suscetíveis após a administração de anestésicos voláteis halogenados, como isoflurano, sevoflurano, desflurano ou halotano. Esses anestésicos se ligam covalentemente a proteínas hepáticas com produtos reativos de seu metabolismo, criando assim novos autoantigens capazes de provocar respostas alérgicas ou autoimunes5.
O estudo de mecanismos patogênicos envolvidos no desenvolvimento de anestésicos e qualquer forma de DIH tem sido previamente dificultado pela falta de um modelo animal que imita de perto a indução da doença humana. Desenvolvemos um modelo experimental de murina de DIH com características semelhantes à DILI mediada imunológica em pacientes. A hepatite é induzida pela imunização com um dos dois autoantígenos que foram covalentemente modificados pelo metabólito de cloreto de trifluoroacetil (TFA) que é formado seguindo o metabolismo oxidativo do anestésico pelo citocromo enzimático P450 2E1 (CYP2E1)5. Um autoantígeno é a fração hepática cística cística hepótica S100, que é uma mistura de várias proteínas6, e o segundo autoantígeno é um epítope de CYP2E1 que é reconhecido por soro de pacientes com DILI7 anestésico imuno mediado. Ao usar camundongos BALB/c, que são relativamente resistentes à hepatite autoimune experimental, distinguemos nosso modelo do modelo de imunização induzido pelo S100 de hepatite autoimune em camundongos C57Bl/6J8.
Devido às suas diversas apresentações clínicas, o DIH é difícil de estudar em pacientes. Modelos experimentais translacionais oferecem a capacidade de avaliar a patogênese da doença in vivo e in vitro. Atualmente, não existem outros métodos alternativos para induzir DIH que examinem totalmente as respostas imunes in vivo ou in vitro adaptativas ou inatas sem o uso de animais. Além disso, como a trifluoroacetilação do S-100 ou do epítope CYP2E1 não parece produzir um imunogênio irritante, e estamos induzindo o DIH pela imunização com proteínas alteradas pelo TFA, esses animais não receberão éter, qualquer anestésico halogenado, barbiturado ou álcool antes da imunização ou outros procedimentos, considerando que esses agentes podem alterar os parâmetros que estamos estudando. Mesmo assim, diminuímos o uso do nosso mouse utilizando simulação de computador para confirmar as preferências vinculantes do nosso epítope CYP2E1descoberto 9 e espelhamos o DIH humano implicando sexo feminino, demonstrando que ratos BALB/c fêmeas desenvolvem um DIH10 mais severo.
Apesar das diversas apresentações de DIH em pacientes e desafios no estudo da doença clínica, a modificação pós-translacional de proteínas nativas por metabólitos reativas é um mecanismo-chave aceito na patogênese DIH que segue anestésicos halogenados11. Os investigadores também aceitam que o CYP2E1 é um grande autoantígeno neste processo12,13. O papel das células CD4+T regulamentadas (IL)-4-upregulated que reconhecem um CYP2E1 pós-translacionada e outras proteínas hepáticas é um iniciador aceito de DIH anestésico, atraindo neutrófilos, eosinófilos e células de mastro para o fígado14, e este mecanismo foi confirmado em muitas formas de DIH15,16. As células CD4+CD25+T (Tregs) induzidas a expressar o FoxP3 reduzem a gravidade do DIH, e deficiências relativas dessas células no baço pioram o DIH 10,7. Assim, a maioria dos avanços na compreensão do DIH têm sido possíveis utilizando modelos de camundongos in vivo para avaliar os mecanismos genéticos, metabólicos e imunológicos do DIH tanto in vivo quanto in vitro.
Como nós e outros investigadores descobrimos papéis para IL-4, neutrófilos e eosinófilos no início do DIH usando diferentes modelos de camundongos, acreditamos que esta observação suporta nossa alegação de que, independentemente do modelo DIH utilizado, hepatite e lesão são induzidas pelo IL-4. A força do nosso protocolo está na utilização da metodologia in vivo, tanto de camundongos masculinos quanto femininos, e na repetição da histologia, ensaios de proliferação de células T CD4+ e citocinas. A força do nosso uso de estudos in vitro é que eles reduzem o número de camundongos necessários, fornecendo a metodologia para isolar as interações celulares que impulsionam o DIH. Recomendamos o uso de camundongos masculinos e femininos, pois isso reduz a possibilidade de viés inconsciente na interpretação dos resultados e fortalece o potencial de tradução de nossos estudos, uma vez que a incidência, prevalência e gravidade do DIH é maior em mulheresde 17 anos. Recomendamos que os camundongos sejam obtidos de um único fornecedor; no entanto, se isso não for possível, obtenha controles de erva-mate ou camundongos do mesmo tipo de fornecedor que os camundongos geneticamente alterados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28997</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AKP Substrate Kit</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">172-1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BALB/c mice</td>
			<td style="width:71px;">Jackson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">CFA H37Ra</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson (Difco Bacto)</td>
			<td align="right" style="width:119px;">231131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FcR Blocking reagent</td>
			<td style="width:71px;">Milteyi</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">General supplement</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">HPRG770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepaRG&#8482; cells cryopreserved</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">HPR GC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit&#160;</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">L34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaHC03</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Percoll&#174;</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1644-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pertussis Toxin</td>
			<td style="width:71px;">List Biologicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline pH 7.4</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce&#8482; Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">177474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">66810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure&#8482; SDS Solution, 10%</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Williams Media E, no phenol red</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A1217601</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of drug-induced, autoimmune hepatitis in balb/c mice for the study of its pathogenic mechanisms

A hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é o processo de hipersensibilidade induzida por medicamentos hepáticos mais comum observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatite autoimune. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres. Os mecanismos subjacentes dessas diferenças sexuais na prevalência não são claros devido à escassez de modelos animais que imitam doenças humanas. Mesmo assim, acredita-se que os mecanismos subjacentes estejam amplamente associados a haplotipos de antígenos leucócitos humanos e hormônios sexuais. Em contraste, usando um modelo de rato DIH, descobrimos que as células CD4+ T iniciadas il-4 contra um epítope de citocromo P450 2E1 induz o fluxo de neutrófilos, macrófagos e células de mastro nos fígados de camundongos BALB/c fêmeas. Usando este modelo, também mostramos que as células T induzidas pelo IL-33+regulamente conferem proteção contra DIH em camundongos femininos e masculinos. Este modelo DIH é induzido pela imunização de camundongos com um epítope de CYP2E1 que foi alterado covalentemente com um metabólito de droga que tem sido associado com DIH. Este epítope é reconhecido por pacientes com DIH. Nosso método induz hepatites robustas e reprodutíveis e autoanticorpos que podem ser utilizados para estudar a patogênese do DIH. Enquanto estudos in vivo podem causar dor e angústia indevidas em camundongos quando feitos de forma inadequada, a vantagem de um modelo in vivo é a capacidade de avaliar a patogênese da doença em um grande número de camundongos. Além disso, os efeitos biológicos das proteínas hepáticas alteradas podem ser estudados por meio de procedimentos invasivos. A adição de estudos in vitro ao projeto experimental permite repetição rápida e análise mecanicista a nível celular. Assim, demonstraremos nosso protocolo de modelo e como ele pode ser utilizado para estudar mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

O calendário de vacinação utilizado para induzir o DIH apresentado na Figura 1 representa as duas imunizações necessárias na base do pescoço (dia 0) e a base da cauda (dia 7). A Figura 2 mostra dados representativos de proliferação obtidos no dia 14 utilizando CFSE em resposta ao CYP2E1, JHDN5, o epítope CYP2E1 e o metabólito trifluoroacetil (TFA) dos anestésicos. A Figura 3 mostra a estratégia de gating e a análise re...

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Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.9K visualizações.  Johns Hopkins University. Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Vídeo: Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Imunologia e Infecção

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

Determinação de ácidos graxos tolerável e Concentrações toxina da cólera Usando Humanos células epiteliais intestinais e BALB / c mouse macrófagos

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...