Name: induction of drug-induced, autoimmune hepatitis in balb/c mice for the study of its pathogenic mechanisms
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms at JoVE.com

Dr. Njoku, bu modelin formülasyonuyla sonuçlanan rehberliği ve anlayışlı tartışmaları için Dr. Noel R. Rose, MD PhD'ye teşekkür etmek istiyor.

Tüm prosedürler hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.
1. Hepatik S-100 sitozolik proteinlerinin veya bir CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu
NOT: İlk olarak, trifloroasetillenmiş S100 (TFA-S100) ve trifloroasetillenmiş CYP2E1 epitopunu (TFA-JHDN5) hazırlayın. Çünkü bağışıklamalar için sinjenik S100 proteinlerine ihtiyaç vardır ve immünojeni üretmek için BALB / c fareleri gereklidir. Preparat büyük miktarda immünojen verir; Bu nedenle, bu bölümü yılda yaklaşık dört kez gerçekleştirmeyi bekleyin. TFA-JHDN5'i yapmak için aynı yöntem kullanılacaktır. CYP2E1 epitopu (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, sıralanabilir veya satın alınabilir.
<ol><li>Karaciğerin S100 fraksiyonunun izolasyonu.
	<ol>
<li>4 - 6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile 5-10 BALB / c farenin sedasyonunu takiben, kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın.</li>
		<li>Mikrocerrahi makas kullanarak, orta hat kesisi kullanarak karın içi içeriği açığa çıkarın ve kanı çıkarmak için inferior vena kavada küçük bir kesim yapın.</li>
		<li>Portal ven içine 24 gauge anjiyokateter yerleştirin ve karaciğeri 4 ° C'de bir su banyosunda 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile 10 mL / dak perfüze edin. Biriken karaciğerleri çıkarın ve tartın ve küçük parçalara (10 – 15 mm) kesin. NOT: Ötenazi, intraperitoneal ilave ketamin / ksilazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) enjeksiyonu, ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.</li>
		<li>Üreticilerin tavsiyelerine göre Komple Proteaz inhibitörü Kokteyl tabletleri ile desteklenmiş sakkaroz (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homojenizasyon tamponunun (pH 7.4) ağırlığının 4 katı ekleyin (bkz. 15 mL'lik bir polipropilen tüpte, genel bir laboratuvar doku homojenizatörü kullanarak, pürüzsüz olana kadar buz üzerinde orta hızda homojenize edin. Homojenizasyon sırasında dokunun ısınmasını önlemek için buz üzerinde homojenize edin.</li>
		<li>Karaciğeri 10 dakika boyunca 1500 x g'de homojenize eden santrifüj yapın ve ardından süpernatanı dökün. Süpernatantı 100.000 x g'de 1 saat boyunca santrifüj edin. Süpernatantı çıtçıtlayın ve -80 ° C'de saklayın. Süpernatant sitozolik S-100'dür.</li>
	</ol></li>
	<li>S100 ve JHDN5'in trifloroasetilasyonu NOT: S-100'ün lizin kalıntılarının ε-amino gruplarının trifloroasetilasyonu, Satoh18 prosedürüne göre gerçekleştirilecektir. Bu deneyin diyalizin son günleri hariç tüm bölümleri duman davlumbazında gerçekleştirilir.<ol>
<li>Bisinkoninik asit tahlili (BCA testi)7 kullanarak sitozolik S-100'ün toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. 20 mg BALB/c fare S100 veya JHDN5 ila 10 mL'yi 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde dH2O ile seyreltin. 1N KOH ile pH'ı 10'a ayarlayın.</li>
		<li>Çözeltiye 4.7 mmol S-etiltriflorotiyoasetat (S-ETFA) ekleyin. KOH'u damlacık şeklinde yaklaşık 1 saat uygulayarak pH'ı 1N KOH ile 9.9 – 10.0 arasında tutun. Her reaksiyon için toplam KOH hacmini kaydedin.</li>
		<li>Çözeltileri ayrı diyaliz kasetlerine aktarın (Aşırı doldurmayın). Kasetleri günde üç değişiklikle 4 L dH 2 O'ya karşı72saat boyunca diyalize edin. Diyalizden sonra, TFA-S100 veya TFA-JHDN5'in son hacmini kaydedin ve ardından etiketli tüplere aliquot yapın. Dondurun ve –80 °C'de saklayın.</li>
		<li>Tahmini konsantrasyon, S100 veya JHDN5'in (mg cinsinden) başlangıç miktarının diyaliz sonrası son hacme (mL) bölünmesiyle belirlenir. Doğal protein19'un yüzde modifikasyonunu belirlemek için, her bir doğal ve TFA ile değiştirilmiş proteinin 1.0 mg'ını (son konsantrasyon 1.0 mg'dan büyükse) ayrı mermi tüplerinde dH 2 O ile 1.0 mL'yeseyreltin ve 1.0 mL dH2O kullanarak bir boşluk hazırlayın. TFA ile değiştirilmiş proteinin konsantrasyonu 1.0 mg'dan azsa, seyreltmeyin.<ol>
<li>96 kuyucuklu bir plakanın kuyularını ayırmak için, boş, doğal ve değiştirilmiş proteinlerden 50 μL ekleyin. Her bir oyuğa 50 μL% 4 NaHCO3 ve ardından 50 μL% 0.1 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit ekleyin.</li>
			<li>Plakayı 2 saat boyunca 40 ° C'de inkübe edin. Kuluçkayı takiben, her bir kuyucuğa 50 μL% 10 SDS ekleyin ve ardından 25 μL 1N HCl ekleyin.</li>
			<li>334 nm'lik OD'de okuyun ve daha sonra 334 nm'de absorbanstaki karakteristik düşüşü doğrulamak için her bir bileşiğin 200 – 600 nm arasındaki absorbansını kaydedin. Aşağıdaki formülü kullanarak lizin kalıntılarının TFA tarafından yüzde modifikasyonunu hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hepatiti indüklemek için farelerin bağışıklanması
NOT: DIH, BALB / c farelerinde, triflorasetil klorür (TFA), bir model ilaç-metabolit, TFA-S1006 veya TFA9, hepatit, otoreaktif T hücreleri ve CYP2E1 otoantikorlarını indükleyen TFA-JHDN5 tarafından kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu tarafından kovalent olarak değiştirilmiş karaciğer sitozolik proteinleri ile yapılan bağışıklamalarla modellenmiştir. Fareler, ilk immünizasyondan 2 hafta sonra dalak aktivasyon fazı ve granülositik inflamasyon ile karakterize 3 hafta boyunca hepatik bir faz sergiler. Dişi BALB / c fareleri bu modelde hepatite karşı erkeklerden daha hassastır.
<ol><li>0. günde, 6-8 haftalık BALB / c farelerini, boynun tabanında, eşit hacimlerde tam Freund adjuvanı (CFA) olarak emülsifiye edilmiş 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile deri altından bağışıklayın. 0. günde, fareleri arka ayaklardan birinde kas içinden 50 ng boğmaca toksini ile bağışıklayın. 7. günde, her farenin aynı immünojenin iki enjeksiyonunu almasını sağlamak için fareleri kuyruğun tabanında deri altından 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile eşit hacimlerde emülsifiye edilmiş TFA-JHDN5 ile bağışıklayın. NOT: Fareler, aşılamayı takip eden ilk 6 saat boyunca saatlik olarak ve daha sonra bir hafta boyunca günde en az iki kez izlenir. Fareler kambur duruş veya karıştırılmış kürk gibi ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteriyorsa, lokal ACUC'ye uygun olarak analjezikler uygulanmalıdır. Önemli ağrı veya sıkıntı kaydedilirse, ötanazi gerekli olup olmadığını belirlemek için fareler bir veteriner tarafından değerlendirilmelidir.</li>
	<li>Akış sitometrisi kullanılarak tüm öz-proteinlere, öz-proteinlerin epitoplarına veya TFA haptenine CD4 + T hücresi immün yanıtlarının belirlenmesi
	<ol>
<li>Farelerin intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sedasyonunu takiben, adım 1.1.1'de tarif edildiği gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın ve ardından mikrocerrahi makas kullanarak karın içi boşluğu açığa çıkardıktan sonra dalağı tanımlayın. Dalağı pedikülde kesin ve PBS / % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Ötenazi, farelerde intraperitoneal ek ketamin / ksilazin enjeksiyonu (80 mg / kg: 8 mg / kg), ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenecektir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.</li>
		<li>Buzlu cam slaytlar kullanarak hücreleri serbest bırakın ve 50 mL'lik konik polipropilen tüpe aktarın. PBS/%2 FCS ile hacmi 50 mL'ye çıkararak ve tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak 335 x g'de santrifüj yaparak yıkayın. Süpernatantı dökün ve bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>1 dakika boyunca 1 mL ACK Lysing arabelleği kullanarak kırmızı hücreleri çıkarın ve PBS/%2 FCS ile 50 mL'ye kadar ses getirin. 335 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı dökün.</li>
		<li>Hücreleri sayın. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca CFSE ile etiketleyin. Tek hücreli süspansiyonları, PBS / % 2 FCS'de kuyu başına 3x10 6 hücre / mL'lik6 kuyucuk plakasına askıya alın.</li>
		<li>Etiketli hücreleri CYP2E1, JHDN5 veya TFA-OVA (10 μg / mL) ile 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO2,% 95 havada (nemlendirilmiş) uyarın. Kuluçkadan sonra, hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-APC (1:100) ile boyayın ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analiz edin.</li>
		<li>CD4 + CFSE + hücrelerini tanımlamak için aşağıdaki geçit stratejisini kullanın: CD4 + CFSE + hücreleri, kapılı canlı hücrelerden tanımlanacak ve çoğalan hücrelerin histogramları olarak görüntülenecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bağışıklık sistemi hücrelerine sızan bağışıklık hücrelerinin immünize farelerden izolasyonu. 
	<ol>
<li>14. günde veya 21. günde karaciğerlere sızan bağışıklık hücrelerini izole etmek için, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile intraperitoneal enjeksiyonla anestezi yapın ve adım 1.1.1'de açıklandığı gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın. 1.1.2'de tarif edildiği gibi mikro cerrahi makasla yapılan bir orta hat insizyonu kullanılarak laparotomi yapıldıktan sonra, portal veni 25 gauge iğne ile kanüle edin ve daha sonra böbrek damarlarının altındaki inferior vena kavayı kesin.</li>
		<li>Her karaciğeri 37 °C'lik bir su banyosunda 40 mL PBS ile 10 mL / dak akış hızında perfüze edin. Perfüzyondan sonra, mikro cerrahi makas kullanarak, karaciğeri hepatik pedikülde kesin, safra kesesini çıkarın ve ardından karaciğeri hilumda kesin.</li>
		<li>20 mL steril şırınga havanesi ve soğuk PBS kullanarak karaciğeri bir ağ paslanmaz çelik elek üzerinde bozun. Elde edilen hücre süspansiyonunu, 300 mesh elek kullanarak 50 mL önceden sterilize edilmiş santrifüj tüplerine filtreleyin. Soğuk PBS kullanarak her süspansiyonu 50 mL'ye getirin ve ardından süspansiyonu 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın.</li>
		<li>Süpernatantı atın ve daha sonra her peleti tedavi yoluyla yeni 50 mL tüplere havuzlayın (fare başına bir tüp önerilir; ancak, numuneler bir araya getirilirse, 2-4 pelet / tüp önerilir). Havuzlanmış peletleri 45 mL Percoll% 35 (PBS'de) ve 100 IU / mL heparin içinde askıya alın.</li>
		<li>Her tüpü 20 ° C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 5 mL PBS'de askıya alın ve daha sonra buz üzerinde 10 dakika boyunca her pelete 1 mL ACK lizing tamponu ekleyin.</li>
		<li>Her tüpü PBS ile 50 mL'ye getirin ve 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Süpernatantı atın ve daha sonra hücreleri PBS / 2% FCS ile 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Hücreleri sayın.</li>
		<li>
Akış sitometrisi kullanılarak hücre tipinin analizi NOT: İşte indüklenmiş Foxp3+Treg'lerin nasıl algılanabileceğine dair bir örnek.<ol>
<li>1x106 hücreyi FcR bloke edici reaktif ile inkübe edin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-FITC, CD25-PE ve CD45-PerCP'nin 1:100 seyreltilmesiyle lekeleyin. Daha sonra, hücreleri hücre içi olarak FoxP3-APC ile lekeleyin.</li>
			<li>Hücreleri 250 μL fiksasyon tamponu ile sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analize kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
			<li>Akış sitometrisi kullanarak karaciğer, dalak veya lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlarda indüklenen Foxp3 + Treg'leri tespit etmek için aşağıdaki geçit stratejisi önerilir: Canlı / Ölü Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre leke kitini kullanarak canlı hücreleri tanımlayın. Daha sonra, CD45 + (PerCP, klon RA3-6B2) olan karaciğer hücrelerine kapı ve CD45 + kapısından kapı CD4 + hücreleri (FITC, klonGK1.5). CD4 + hücrelerinden, CD25 + (PE, klon 7D4) ve FoxP3 + (APC, klon 3G3) hücrelerinin yüzdelerini tanımlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hepatit için karaciğer dokularının histolojik analizi
	<ol>
<li>21. günde, karaciğer bölümlerini (5 μm kalınlığında) % 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin ve Hematoksilin ve Eosin ile lekeleyin.</li>
		<li>Histoloji puanlarını önce düşük güçte (40X) ortalama 2 görüntülemede belirleyin ve 64X'te onaylayın. Doku bölümlerini aşağıdaki gibi puanlayın: Derece 0 = iltihap veya nekroz yok; Derece 1 = nekroz olmadan minör lobüler inflamasyon; Derece 2= kesitin %<50'sini tutan lobüler inflamasyon; Derece 3 = kesitin ≥% 50'sini içeren lobüler inflamasyon; ve Grade 4 = nekroz ile iltihaplanma.</li>
	</ol></li>
	<li>Dalak ve karaciğerlerde doku sitokin düzeylerinin belirlenmesi. 
	<ol>
<li>14. gün veya 21. günde, her fareden alınan karaciğer veya dalak örneklerini (1 g) 1 mL RPMI/%2 FCS içinde, orta ayarda genel bir laboratuvar homojenizatörü kullanılarak pürüzsüz hale getirilene kadar homojenize edin. Numuneyi buz üzerinde soğuk tutun.</li>
		<li>Soğutulmuş bir masaüstü santrifüj kullanarak homojenatı 4 °C'de 1455 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çırpın ve kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Sitokin ve kemokin seviyeleri, kit talimatlarına göre ticari ELISA kitleri ile ölçülebilir. Seviyeleri (mL veya μL cinsinden) dokunun pg / g'sine dönüştürerek sitokin seviyelerini standartlaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>CYP2E1, CYP2E1 epitopu JHDN5 ve TFA ilaç metabolitine karşı serum antikorlarının saptanması.
	<ol>
<li>14 veya 21. günlerde, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sakinleştirin. Kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak, ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın. Bir tüberkülin şırıngasına bağlı 25 G'lik bir iğne kullanın ve iğneyi yavaşça kaburgaların altındaki göğüs boşluğuna ve hemen ksifoid sürece yanal olarak ilerlederek kalbe yaklaşın. İntrakardiyak ponksiyon kullanarak kan toplayın.</li>
		<li>Kan toplandıktan sonra, oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin verin. Kan örneklerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 295 x g'de santrifüj yapın. Serumları dikkatlice çıkarın, serumları aliquot edin ve -20 ° C'de dondurun.</li>
		<li>100 μL CYP2E1, JHDN5 veya TFA-ovalbümin (OVA) test antijenlerini (PBS'de 5 μg / mL) 96 kuyucuk plakasına gece boyunca 4 ° C'de en az 18 saat boyunca uygulayın. Ertesi gün, plakaları yıkama tamponu (PBS / % 2 FCS), 2 döngü (her biri 4 yıkama) ile yıkayın.</li>
		<li>PBS/%2 FCS'de 100 μL fare serumu (1:100) uygulayın ve plakalara üçlü olarak uygulayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. 2 saat sonra, plakaları adım 2.6.2'de açıklandığı gibi yıkama tamponu ile yıkayın.</li>
		<li>2 saat boyunca 100 μL Alkalen fosfataz (AKP)-keçi anti-fare IgG, AKP-sıçan anti-fare IgG1 veya AKP-sıçan anti-fare IgG2a sekonder antikorları (1:1000) ekleyin, ardından yıkama tamponu ile 1 döngü ve PBS ile 1 döngü yıkama adımı. Bir AKP substrat kiti kullanarak antikorları tespit edin ve bir spektrofotometre ile her 15 dakikada bir OD 405 nm'de ölçüm yapın. TFA genellikle 15 dakika içinde tamamen gelişirken, CYP2E1 ve CYP2E1 epitopu 30 ila 60 dakika7 arasında gelişebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>JHDN5 IgG ile indüklenen oksidatif stresin in vitro gelişimi üzerine çalışmalar.
	<ol>
<li>12 kuyucuk plakası kullanarak, CYP2E1 aktivitesini en üst düzeye çıkarmak için önerildiği gibi, 37 ° C'de, 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde glutamin ve genel takviye ile desteklenmiş 1000 μL Williams E ortamındaki fibronektin kaplı kapak kaymalarında kuyu başına 106 terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreyi inkübe edin.</li>
		<li>Kuyuları ayırmak ve 37 °C, %5 CO2, %95 nemde 2 saat kuluçkaya yatırmak için JHDN5 IgG (1:40) veya fare IgG (1:1000) ekleyin. Hibridoma serumları çok seyreltikti. Tüm kuyucuklara 30 dakika daha koyu kırmızı floresan antikor dedektörü ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Kuyucukları karanlıkta 1 mL PBS ile 3 kat yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca% 3.7 formaldehit içinde sabitleyin. 24 saat içinde konfokal mikroskopi ile inceleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>JHDN5 IgG'nin in vitro mitokondri gibi hücre içi organellerle birlikte lokalizasyon çalışmaları. 
	<ol>
<li>JHDN5 IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunu göstermek için, seyrek kültür (~% 30 birleşim), fibronektin kaplı kapak üzerindeki terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreler, adım 2.7'de açıklandığı gibi boyasız Williams'ın media E'sinde 7 gün boyunca kaymaktadır.</li>
		<li>Doğru absorpsiyon dalga boylarını belirledikten sonra, 2 saat (37 °C), %5 CO2, %95 nem için yeşil floresan, 488 nm konjuge fare IgG veya JHDN-5 (1:100) ve Kırmızı floresan, 594 konjuge Mito-tracker Kırmızı (1:100) ekleyin.</li>
		<li>Etiketli fibronektin kaplı kapak kaymalarını DAPI ile Anti-solma Reaktifi ile monte edin ve konfokal mikroskopi ile inceleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Genel protokol notları
<ol><li>Bileşikler klinik kullanım formülasyonunda mevcut olmadığında farmasötik olmayan sınıf araçları kullanın. Ancak, bu araçların her birini bu yöntemde tanımlanan güvenilir ticari tedarikçilerden edinin. Her zaman Amerikan Kimya Derneği Analitik Reaktifler Komitesi tarafından tanımlanan ve en azından reaktif sınıf seviyesine uygun kimyasallar kullanın. Yöntemlerimiz için, mümkün olduğunda analitik sınıf düzeyinde reaktifler kullanın.</li>
	<li>Hayvan refahını veya verilerin yorumlanmasını olumsuz yönde etkileyebilecek kontaminasyonu önlemek için TFA ile değiştirilmiş proteinlerin formülasyonu için katı aseptik tekniği izleyin.</li>
	<li>Farmasötik olmayan sınıf formülasyonları, mevcut teknik bilgilere göre, formülasyonun güçlü kalacağı sürelerde saklayın ve kullanın. CFA'yı oda sıcaklığında, CYP2E1 ve epitoplarını -20 veya -80 °C'de saklayın. TFA ile değiştirilmiş proteinleri -80 ° C'de saklayın ve CFA ile emülsifikasyondan önce 4 ° C'ye gelmesine izin verin. TFA değiştirilmiş proteinleri -80 ° C'de saklayın ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için alikotlarda saklayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune+liver+disease:+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease.">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li><li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence,+presentation,+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland.">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li><li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis:+a+diagnostic+challenge.">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li><li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis.">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li><li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis.">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li><li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB/c+mouse.">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li><li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+drug-induced,+immune-mediated+hepatitis,+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3++T-cell+activity.">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li><li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+hepatitis:+disease+induction,+time+course+and+T-cell+reactivity.">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li><li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis.">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li><li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+bias+in+experimental+immune-mediated,+drug-induced+liver+injury+in+BALB/c+mice:+suggested+roles+for+Tregs,+estrogen,+and+IL-6.">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).</li><li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity.">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li><li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis.">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li><li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis.">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li><li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury.">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li><li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+adducts,+circulating+antibodies,+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity.">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li><li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice.">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li><li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+autoimmunity.">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li><li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity:+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes.">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li><li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li><li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halothane+metabolism:+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides.">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li><li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid.">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu protokolün gücü, tekrarlanabilirliğine dayanır; Bu nedenle, önerilen adımlara uymak çok önemlidir. İmmünojenin formülasyonu bazıları için bir bariyer olabilir; Bununla birlikte, belgemizde açıklanan epitopu kullanarak modelimizi yeniden ürettik, bu da karaciğerin S100 fraksiyonunu izole etme ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Ek epitopların veya proteinlerin modifiye edilmesi ve bağışıklamaları takiben hepatiti indüklemesi muhtemeldir; ancak, kullandığımız proteinleri güvenilir sonuçlarla tanımlıyoruz. Halojenli anestezik maruziyet üzerine trifloroasetilat yapılan çeşitli proteinler gösterilmiştir. Büyük olasılıkla epitop yayılması nedeniyle, bu proteinlerin bazıları aynı zamanda yerli, trifloroasetillenmemiş durumlarında otoantikorların hedefidir. Örnek olarak, piruvat dehidrogenaz kompleksinin (PDH-E2) E2 alt birimi, TFA-addüktörlerindeki TFA-moiety ile yapısal benzerliği olan epitopları (lipoik asit protez grubu) taşır. Halotan hepatitli hastalarda üretilen antikorların TFA-proteinlerine ve PDH-E2 20,21'e çapraz reaktif olduğu gösterilmiştir.
DIH modelimiz, farelerin arkası boyunca CFA'da emülsifiye edilen iki bağışıklama gerektirir. CFA'lı ayak yastığı enjeksiyonlarının farede ağrı ve sıkıntı ile ilişkili olduğunu biliyoruz. Bu nedenle, deneysel DIH modelinin geliştirilmesi birkaç deneysel çalışmayı içeriyordu. Modeli CFA kullanarak bir bağışıklama kullanarak değerlendirdiğimizde, ikinci bağışıklama immünojenimizle her iki enjeksiyonda da eksik Freund adjuvanı (IFA) veya IFA kullanarak, hepatik inflamasyon gelişmedi. Keskin bir tezat olarak, CFA ile iki bağışıklama kullanarak fareleri immünojen ile bağışıkladığımızda, önemli hepatik inflamasyon mevcuttu. Başka bir otoimmün hepatit modelinin orijinal tanımı, bizimkine benzer çalışmaları içeriyordu ve önemli karaciğer iltihabını göstermek için CFA ile iki bağışıklamagerektiriyordu 8. Buna rağmen, CFA olmadan inflamasyonu optimize etmeye çalışmak için literatür taramalarını kullanarak adjuvanları sürekli olarak yeniden değerlendiriyoruz. Örnek olarak, B hücresi yanıtlarını artıracak iyi bilinen bir adjuvan Titer Max vardır; Bununla birlikte, antikorlar DIH'nin bir bileşeni olmasına rağmen, biz ve diğerleri model14'ümüzde T hücresi yanıtları için kritik bir rol oynadığımızı gösterdik.
Güvenilir modellerin geliştirilmesi, DIH'nin patogenezinin araştırılmasını kolaylaştırmaktadır. Bu modelde karaciğer histolojisi ve bağışıklık hücrelerinin çeşitli aşamalarda güvenilir bir şekilde değerlendirilebileceğini gösteriyoruz. DIH'nin gelişimini incelemek için kullanılabilecek antijene özgü T hücrelerinin, serum antikorlarının ve doku sitokinlerinin tanımlandığını gösteriyoruz. İltihaplı karaciğerden hücreleri izole etme yöntemlerini gösteriyoruz ve heparin kullanımını öneriyoruz. Ancak bu tekniği heparin olmadan uyguladık ve sonuçlar ayırt edilemezdi. Ek olarak, mevcut doku bozulma yöntemleri de karaciğerden hücreleri serbest bırakabilir.
Son zamanlarda, yeni nesil dizileme ve kantitatif PCR gibi modern araçları kullandık ve tekrarlanabilir sonuçlar elde ettik. IL-4, IL-4 reseptörü, IL-6, IL-6 reseptörü IL-33 ve ST2 eksikliği olan fareleri kullanarak DIH ile ilgili sonuçları yayınladık, böylece BALB / c faresini kontrol faremiz olarak kullanabiliriz. Bu DIH modelinin gelecekteki uygulamaları, DIH'nin patogenezinden sorumlu daha önce tanınmayan mekanizmaları ortaya çıkarmak için CRISPR teknolojisinin kullanılmasına ek olarak farelerde vuruntu geliştirilmesini de içerecektir.

Bu yöntemin amacı, in vivo gelişen ilaca bağlı otoimmün hepatitin fare modelini tanımlamak ve bu hastalığın moleküler, immünolojik ve genetik temelini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Çalışmalarımızın uzun vadeli amacı, duyarlı hastalarda DİH'yi inceleyerek kronik karaciğer inflamasyonu ve hasarının gelişiminden sorumlu mekanizmaları ortaya çıkarmaktır. Karaciğer hastalığı ve siroz, 25-64 yaş arası erişkinlerde altıncı en sık ölüm nedenidir. Bazen ilaca bağlı otoimmün hepatit (DIH) olarak adlandırılan idiosyncratic DILI, Amerika Birleşik Devletleri'nde akut karaciğer yetmezliğinin üçüncü en yaygın nedenidir. DIH, otoimmün hepatit1'li hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en yaygın hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadın 2,3,4'tür. İzofluran, sevofluran, desfluran veya halotan gibi halojenli uçucu anesteziklerin uygulanmasını takiben duyarlı bireylerde bir tür DIH gelişir. Bu anestezikler, metabolizmalarının reaktif ürünleri ile karaciğer proteinlerine kovalent olarak bağlanır, böylece alerjik veya otoimmün yanıtları ortaya çıkarabilen yeni otoantijenler oluşturur5.
Anestezik ve herhangi bir DIH formunun gelişiminde rol oynayan patojenik mekanizmaların incelenmesi, daha önce insan hastalığının indüksiyonunu yakından taklit eden bir hayvan modelinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Hastalarda immün aracılı DILI'ye benzeyen özelliklere sahip deneysel bir DIH murin modeli geliştirdik. Hepatit, sitokrom P450 2E1 (CYP2E1)5 enzimi tarafından anestezinin oksidatif metabolizmasını takiben oluşan trifloroasetil klorür (TFA) metaboliti tarafından kovalent olarak modifiye edilmiş iki otoantijenden biri ile immünizasyon ile indüklenir. Bir otoantijen, birkaç proteinin karışımı olan hepatik sitozolik S100 karaciğer fraksiyonudur6 ve ikinci otoantijen, anestezik immün aracılı DILI7'li hastalardan serumlar tarafından tanınan bir CYP2E1 epitopudur. Deneysel otoimmün hepatite nispeten dirençli olan BALB / c farelerini kullanarak, modelimizi C57Bl / 6J farelerde otoimmün hepatitin S100 kaynaklı immünizasyon modelinden ayırıyoruz8.
Çeşitli klinik prezentasyonları nedeniyle, DIH'nin hastalarda incelenmesi zordur. Translasyonel deneysel modeller, hastalığın patogenezini in vivo ve in vitro olarak değerlendirme olanağı sunmaktadır. Şu anda, DİH'yi indüklemek için, hayvan kullanmadan in vivo veya in vitro adaptif veya doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tam olarak inceleyen başka alternatif yöntemler yoktur. Dahası, S-100 veya CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu tahriş edici bir immünojen üretmediğinden ve TFA ile değiştirilmiş proteinlerle bağışıklama yoluyla DIH'yi indüklediğimizden, bu hayvanlara bağışıklama veya diğer prosedürlerden önce eter, herhangi bir halojenli anestezik, barbitürat veya alkol almayacaktır. Buna rağmen, keşfedilen CYP2E1 epitopu9'un bağlanma tercihlerini doğrulamak için bilgisayar simülasyonunu kullanarak fare kullanımımızı azalttık ve dişi BALB / c farelerinin daha şiddetli bir DIH10 geliştirdiğini göstererek kadın cinsiyetini içeren insan DIH'sini yansıttık.
Hastalarda DİH'nin çeşitli sunumlarına ve klinik hastalık çalışmalarındaki zorluklara rağmen, reaktif ilaç metabolitleri tarafından doğal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonu, halojenli anestezikleri takip eden patogenez DİH'de kabul edilen anahtar bir mekanizmadır11. Araştırmacılar ayrıca CYP2E1'in bu süreçte12,13 majör bir otoantijen olduğunu kabul etmektedir. Translasyonel olarak modifiye edilmiş bir CYP2E1 ve diğer karaciğer proteinlerini tanıyan interlökin (IL)-4-yukarı regüle CD4 + T hücrelerinin rolü, nötrofilleri, eozinofilleri ve mast hücrelerini karaciğer14'e çekerek anestezik DIH'nin kabul edilen bir başlatıcısıdır ve bu mekanizma DIH 15,16'nın birçok formunda doğrulanmıştır. İndüklenen FoxP3 eksprese eden CD4 + CD25 + T hücreleri (Tregs) DIH'nin şiddetini azaltır ve bu hücrelerin dalaktaki göreceli eksiklikleri DIH 10,7'yi kötüleştirir. Bu nedenle, DIH'yi anlamadaki ilerlemelerin çoğu, DIH'nin genetik, metabolik ve immünolojik mekanizmalarını hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için in vivo fare modellerinin kullanılmasıyla mümkün olmuştur.
Biz ve diğer araştırmacılar, farklı fare modelleri kullanarak DIH'nin başlatılmasında IL-4, nötrofiller ve eozinofiller için rolleri ortaya çıkardığımız için, bu gözlemin, kullanılan DIH modelinden bağımsız olarak, hepatit ve yaralanmanın IL-4 tarafından indüklendiği iddiamızı desteklediğine inanıyoruz. Protokolümüzün gücü, hem erkek hem de dişi fareler olmak üzere in vivo metodolojinin kullanılmasında ve histolojinin, CD4 + T hücre proliferasyon tahlillerinin ve sitokinlerin tekrarlanmasında yatmaktadır. İn vitro çalışmaları kullanmamızın gücü, DIH'yi yönlendiren hücresel etkileşimleri izole etmek için metodoloji sağlarken ihtiyaç duyulan fare sayısını azaltmalarıdır. Erkek ve dişi farelerin kullanılmasını öneriyoruz, çünkü bu, sonuçların yorumlanmasında bilinçsiz önyargı olasılığını azaltır ve DIH insidansı, prevalansı ve şiddeti kadınlarda daha yüksek olduğu için çalışmalarımızın çeviri potansiyelini güçlendirir17. Farelerin tek bir satıcıdan elde edilmesini öneririz; Bununla birlikte, bu mümkün değilse, genetiği değiştirilmiş farelerle aynı satıcıdan çöp eşi kontrolleri veya vahşi tip fareler edinin.

<table><tbody><tr><td>0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Substrate Kit</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&amp;trade; CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>General supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&amp;trade; cells cryopreserved</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>List Biologicals</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&amp;trade; SDS Solution, 10%</td><td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

induction of drug-induced, autoimmune hepatitis in balb/c mice for the study of its pathogenic mechanisms

İlaca bağlı otoimmün hepatit (DIH), otoimmün hepatitli hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en sık görülen hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadındır. Prevalansındaki bu cinsiyet farklılıklarının altında yatan mekanizmalar, insan hastalığını taklit eden hayvan modellerinin azlığı nedeniyle belirsizdir. Buna rağmen, altta yatan mekanizmaların insan lökosit antijen haplotipleri ve cinsiyet hormonları ile ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Buna karşılık, bir DIH fare modeli kullanarak, IL-4'ün bir sitokrom P450 2E1 epitopuna karşı yönlendirilmiş CD4 + T hücrelerini başlattığını, nötrofillerin, makrofajların ve mast hücrelerinin dişi BALB / c farelerinin karaciğerlerine akışını indüklediğini ortaya çıkardık. Bu modeli kullanarak, IL-33 ile indüklenen FoxP3 + düzenleyici T hücrelerinin dişi ve erkek farelerde DIH'ye karşı koruma sağladığını da gösterdik. Bu DIH modeli, farelerin DIH ile ilişkili bir ilaç metaboliti ile kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu ile aşılanması ile indüklenir. Bu epitop DIH'li hastalar tarafından tanınır. Yöntemimiz, DIH'nin patogenezini incelemek için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir hepatit ve otoantikorları indüklemektedir. İn vivo çalışmalar, yanlış yapıldığında farelerde aşırı ağrı ve sıkıntıya neden olabilirken, in vivo bir modelin avantajı, çok sayıda farede hastalığın patogenezini değerlendirme yeteneğidir. Ek olarak, değiştirilmiş karaciğer proteinlerinin biyolojik etkileri, invaziv prosedürler kullanılarak incelenebilir. Deneysel tasarıma in vitro çalışmaların eklenmesi, hücresel düzeyde hızlı tekrarlama ve mekanik analize izin verir. Bu nedenle, model protokolümüzü ve DIH'nin in vivo ve in vitro mekanizmalarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz.

Şekil 1'de gösterilen DIH'yi indüklemek için kullanılan bağışıklama programı, boynun tabanında (gün 0) ve kuyruğun tabanında (gün 7) gerekli olan iki bağışıklamayı temsil eder. Şekil 2, CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 epitopu ve anesteziklerin trifloroasetil (TFA) metabolitine yanıt olarak CFSE kullanılarak 14. günde elde edilen temsili proliferasyon verilerini göstermektedir. Şekil 3, 14. günde elde edilen indüklenmiş CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg'lerin geçit stratejisi ve temsili akış sitometri analizini göstermektedir. Şekil 4, 21. günde hepatitin evrimini gösteren temsili hematoksilin ve eozin boyalı slaytları göstermektedir. Şekil 5, bu karaciğerlerdeki karşılaştırmalı hücresel içeriğe ek olarak, 21. günde erkeklere kıyasla dişi BALB / c farelerinde daha şiddetli hepatit gösteren temsili hematoksilin ve eozin boyalı slaytları göstermektedir10. Şekil 6, fare IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunun olmadığını gösteren temsili konfokal mikroskopi slaytlarını göstermektedir. Şekil 7, JHDN5 IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunu gösteren temsili konfokal mikroskopiyi göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig1.jpg"> Şekil 1: Hepatiti indüklemek için farelerin bağışıklanması. DİH, dişi BALB/c farelerde (örnek olarak), 0. günde (Adım 1) arka bacakta deri altından (SC) tam Freund adjuvanında (CFA) emülsifiye edilen TFA-JHDN5 (100 μg) ile bağışıklama ile indüklenebilir (Adım 1). 7. günde, BALB / c fareleri daha sonra kuyruğun baesinde CFA'da (s.c.) emülsifiye edilmiş TFA-JHDN5 (100μg) ile aşılanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig2.jpg"> Şekil 2: CD4 + T hücresinin tüm öz proteinlere, öz proteinlerin epitoplarına veya TFA haptenine karşı immün yanıtlarının akış sitometrisi kullanılarak belirlenmesi. Dalinositlerin ilk bağışıklamadan sonraki 14. günde izole edilen, CFSE ile etiketlenmiş, TFA-OVA, CYP2E1 veya JHDN5 (10 μg / mL) ile 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO2,% 95 hava (nemlendirilmiş), CD4-APC ile boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiş 6-8 haftalık BALB / c farelerden tek hücreli süspansiyonları. Kontrol olarak antijensiz (media) kuyular kullanıldı. BALB / c fareleri, medyaya kıyasla JHDN5'e değil, OVA-TFA ve CYP2E1'e yanıt olarak proliferasyon geliştirdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig3.jpg"> Şekil 3: CD4+CD25+FoxP3+ kaynaklı Treg'lerin 2.3.7'de açıklanan yöntemi kullanarak tanımlanması için geçiş stratejisi. İlk kapı canlı hücreleri tanımlar. Bağışıklık hücrelerini tespit etmek için, CD45 + hücreleri başlangıçta kapılıydı. Daha sonra, CD4 + T hücreleri tanımlandı ve kapılandı, ardından CD4 + T hücre popülasyonu içindeki CD25 + FoxP3 + hücrelerinin tanımlanması izledi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig4.jpg"> Şekil 4: Hepatit için karaciğer dokularının histolojik analizi. CFA bağışıklı fareler (üst panel) araç kontrolleri olarak kullanıldı. S100 bağışıklanmış fareler (orta panel) aynı programdaki bağışıklamaları takiben değerlendirildi. 21. günde, fareler ötenazi yapıldı ve karaciğer formalin ile sabitlendi. 5 μm kalınlığında kesitler hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyanarak boyandı. CFA (üst) ve S100 (orta) bağışıklamalarını takiben minimal hepatik inflamasyon (mavi hücreler) ve TFA-S100 ile yapılan bağışıklamaları takiben büyük miktarda inflamasyon gösterilmiştir. (H&E, büyütme 64X). Bu şekilizin 6 ile kullanılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig5.jpg"> Şekil 5: Dişi BALB / c fareleri, erkek BALB / c farelere kıyasla daha fazla DIH geliştirir. (A) Dişi farelerde (n = 8), TFA-S100 / CFA aşılarından 3 hafta sonra erkeklerden (n = 7 / grup) anlamlı derecede daha şiddetli hepatit vardı. (B) Dişi ve erkek farelerden temsili karaciğer kesitleri (H&E, büyütme 64X). (C) Hepatik CD4+, CD8+, NK + ve NK + hücrelerinin sayısı kadınlarda erkeklerden anlamlı olarak daha yüksekti. Ortalama ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Bu şekil10 izinle kullanılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig6.jpg"> Şekil 6: Fare IgG, mitokondri ile birlikte lokalize olmaz. Kırmızı floresan (594) ile ek olarak yeşil floresan (488nm) etiketli fare IgG (1:100) (yeşil) ile boyanmış terminal olarak farklılaşmış hepatik hücrelerin konfokal görüntüsü - Mitotracker Red (1: 100) etiketli. Yeşil floresan (488nm) etiketli Fare IgG, Mitotracker Red (63X büyütme) ile birlikte lokalize olmaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig6large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59174/59174fig7.jpg"> Şekil 7: JHDN5 IgG, mitokondri ile birlikte lokalize olur. Yeşil floresan (488) ile boyanmış terminal olarak farklılaşmış hepatik progenitör hücrelerin konfokal görüntüsü - kırmızı floresana (594) ek olarak JHDN-5 IgG (1: 100) etiketli - Mitotracker Kırmızı (1: 100). Yeşil floresan (488nm) etiketli JHDN-5 IgG, temsili görüntüdeki sarı renk tonu (63X Büyütme) ile gösterilen Mito-tracker Red ile birlikte lokalize olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59174/59174fig7large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms at JoVE.com

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.9K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Video: Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to generate an animal model that reflects the characteristics of the human disease 3-5. However, in various models the induction of disease was rather complex and often hepatitis was only transient3-5. Therefore, we have developed a straightforward mouse model that uses the major human autoantigen in type 2 autoimmune hepatitis (AIH-2), namely hCYP2D6, as a trigger6. Type 1 liver-kidney microsomal antibodies (LKM-1) antibodies recognizing hCYP2D6 are the hallmark of AIH-27,8. Delivery of hCYP2D6 into wildtype FVB or C57BL/6 mice was by an Adenovirus construct (Ad-2D6) that ensures a direct delivery of the triggering antigen to the liver. Thus, the ensuing local inflammation generates a fertile field9 for the subsequent development of autoimmunity. A combination of intravenous and intraperitoneal injection of Ad-2D6 is the most effective route to induce a long-lasting autoimmune damage to the liver (section 1). Here we provide a detailed protocol on how autoimmune liver disease is induced in the CYP2D6 model and how the different aspects of liver damage can be assessed. First, the serum levels of markers indicating hepatocyte destruction, such as aminotransferases, as well as the titers of hCYP2D6 antibodies are determined by sampling blood retroorbitaly (section 2). Second, the hCYP2D6-specific T cell response is characterized by collecting lymphocytes from the spleen and the liver. In order to obtain pure liver lymphocytes, the livers are perfused by PBS via the portal vein (section 3), digested in collagen and purified over a Percoll gradient (section 4). The frequency of hCYP2D6-specific T cells is analyzed by stimulation with hCYP2D6 peptides and identification of IFN&gamma;-producing cells by flow cytometry (section 5). Third, cellular infiltration and fibrosis is determined by immunohistochemistry of liver sections (section 6). Such analysis regimen has to be conducted at several times after initiation of the disease in order to prove the chronic nature of the model. The magnitude of the immune response characterized by the frequency and activity of hCYP2D6-specific T and/or B cells and the degree of the liver damage and fibrosis have to be assessed for a subsequent evaluation of possible treatments to prevent, delay or abrogate the autodestructive process of the liver.

Infection of mice with an Adenovirus expressing the major human autoantigen cytochrome P450 2D6 (hCYP2D6) recognized by sera of patients suffering from type 2 autoimmune hepatitis results in a persistent form of autoimmune-mediated liver disease characterized by extensive hepatitis, fibrosis and generation of a CYP2D6-specific immune response.

CYP2D6 Hayvan Modeli:, Fare Otoimmün Hepatit indükleyin nasıl

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to ...

Tıp

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and the detection of specific serum autoantibodies. Although the potential mechanism is still not clear, the risk of Hashimoto's thyroiditis is related to genetic and environmental factors. At present, there are several types of models of autoimmune thyroiditis, including experimental autoimmune thyroiditis (EAT) and spontaneous autoimmune thyroiditis (SAT).
EAT in mice is a common model for HT, which is immunized with lipopolysaccharide (LPS) combined with thyroglobulin (Tg) or supplemented with complete Freund's adjuvant (CFA). The EAT mouse model is widely established in many types of mice. However, the disease progression is more likely associated with the Tg antibody response, which may vary in different experiments.
SAT is also widely used in the study of HT in the NOD.H-2h4 mouse. The NOD.H2h4 mouse is a new strain obtained from the cross of the nonobese diabetic (NOD) mouse with the B10.A(4R), which is significantly induced for HT with or without feeding iodine. During the induction, the NOD.H-2h4 mouse has a high level of TgAb accompanied by lymphocyte infiltration in the thyroid follicular tissue. However, for this type of mouse model, there are few studies to comprehensively evaluate the pathological process during the induction of iodine.
A SAT mouse model for HT research is established in this study, and the pathologic changing process is evaluated after a long period of iodine induction. Through this model, researchers can better understand the pathological development of HT and screen new treatment methods for HT.

Several types of animal models of Hashimoto's thyroiditis have been established, as has spontaneous autoimmune thyroiditis in the NOD mouse. H-2h4 mice are a simple and reliable model for HT induction. This article describes this approach and evaluates the pathological process for a better understanding of the SAT murine model.

Bir Fare Spontan Otoimmün Tiroidit Modelinin Oluşturulması

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Farede Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Değerlendirilmesi

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS). It is characterized by different prevalence in the sexes, affecting more women than men, and different outcomes, showing more aggressive forms in men than in women. Furthermore, MS is highly heterogeneous in terms of clinical aspects, radiological, and pathological features. Thus, it is necessary to take advantage of experimental animal models that allow the investigation of as many aspects of the pathology as possible. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) represents one of the most used models of MS in mice, modeling different disease features, from the activation of the immune system to CNS damage. Here we describe a protocol for the induction of EAE in both male and female C57BL/6J mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) immunization, which leads to the development of a chronic form of the disease. We also report the evaluation of the daily clinical score and motor performance of these mice for 28 days post immunization (28 dpi). Lastly, we illustrate some basic histological analysis at the CNS level, focusing on the spinal cord as the primary site of disease-induced damage.

Yazar Spotlight: Hem Erkek hem de Dişi Fareler İçin İlgili Çok Yönlü Bir Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Modeli Oluşturma 

Experimental autoimmune encephalomyelitis is one of the most widely used murine models of multiple sclerosis. In the current protocol, C57BL/6J mice of both sexes are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide, resulting mainly in ascending paresis of the tail and limbs. Here we discuss the protocol of EAE induction and evaluation.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

CYP2D6 Hayvan Modeli:, Fare Otoimmün Hepatit indükleyin nasıl

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Bir Fare Spontan Otoimmün Tiroidit Modelinin Oluşturulması

CBir1 TCR Transgenik CD4⁺ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG_35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon Fare Hipofiz İmmunogen hazırlanması

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

CYP2D6 Hayvan Modeli:, Fare Otoimmün Hepatit indükleyin nasıl

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Bir Fare Spontan Otoimmün Tiroidit Modelinin Oluşturulması

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

CBir1 TCR Transgenik CD4⁺ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG_35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit