Merhaba, benim adım Bartolomeo Bosco, ve İtalya Trento Üniversitesi Bütünleştirici Biyoloji Merkezi Transkripsiyonel Ağ Laboratuvarı'nda doktora öğrencisiyim. Bildiğiniz gibi transkripsiyon transkripsiyon faktörü ve kofaktör mekansal ve zamansal organizasyonu içeren son derece karmaşık bir süreçtir. Çoğu, insan P53 de dahil olmak üzere, yanıt elementleri olarak adlandırılan belirli cis-acting elemanları tanımak, ve bu DNA-sıralama için bağlayıcı hedef genlerin transkripsiyon modülasyonu için gereklidir.
Bu çalışmada, size, transaktivasyon fonksiyonlarına özgü P53 dizisini, mayayı bir renk muhabiri geninde veya luciferase'de protein olarak model sistemi olarak kullanarak veya bu yaklaşımların ana deneysel adımlarını ve çok yönlülüğünü vurgulamak için hücre büyümesinin niceliklerini vurgulamak için test olarak kullanma protokolünü göstermek istiyoruz. Protokol bir, adenin-2 veya firefly luciferase geninin yukarı doğru belirli bir P53 tepki elemanı içeren muhabir maya suşlarının yapımı. Bir muhabir gerginlik inşa etmek için, ilk adımları izleyin 1.1 ile 1.15 istenilen promotör bölge hedefleyen oligonükleotidler ile maya hücreleri dönüştürmek için.
Dönüşüm standart lityum asetat bazlı protokole dayanmaktadır. Transformatörler 5-FOA plakalar üzerinde görünür, genellikle 30 derece kuluçka üç gün sonra, çoğaltma plaka olmayan seçici Olmayan YPDA plakaları üzerine ve ayrıca YPDA plakalar G418 içeren, sonraki karşılaştırma kolaylaştırmak için her plaka işaretleme. Tabakları bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, G418 duyarlı ama YPDA plakaları üzerinde büyüdü kolonilerin aday muhabir suşları belirlemek. Tek koloni izole elde etmek için yeni bir YPDA plaka üzerinde tanımlanan koloniler Çizgi ve onları 30 derece iki gün boyunca büyümeye izin. Adım 1.20'de belirtilen koşullarla PCR reaksiyonu gerçekleştirarak istenen P53 yanıt elemanının doğru entegrasyonunu kontrol edin.
Sanger sıralamadan önce doğru amplicon uzunluğunu kontrol etmek için PCR ürününün bir aliquot'u agarose jelüzerine yükleyin. İkinci protokol, nitel renk bazlı adenin-2 maya testini kullanarak P53 protein transaktivasyon yeteneğinin nasıl değerlendirilebildiğini anlatan bir örnek sayılmiyoruz. Birinci bölümde açıklanan aynı lityum asetat bazlı protokolü izleyerek P53 ifade vektörleri ile maya hücrelerini dönüştürün.
Çizgi tek maya transformant koloniler, plaka başına altı kadar, yeni bir seçici plaka üzerinde, ve onları 30 derece bir gecede büyümeye izin. Ertesi gün, steril kadifeler kullanarak, çoğaltma plaka renk fenotip değerlendirilmesi için izin yeni seçici plakalar üzerinde çizgiler, yani adenin sınırlayıcı miktarda içeren seçici plakalar.
Üç gün boyunca 30 derecede kuluçkaya yat. Aynı çizgiler çoğaltma birden çok kez kaplanabilir. Protokol üç, şimdi kantitatif lüminesans tabanlı LUC1 maya test ini kullanarak P53 protein transaktivasyon yeteneğinin değerlendirilmesinin bir örneğini savuruyoruz.
İlk olarak, aşağıdaki P53 ifade vektörleri ile maya hücreleri dönüştürmek, yine, lityum asetat tabanlı protokol bölüm iki açıklanan. Karbon kaynağı olarak glikoz içeren yeni seçici plakalara tek transformantlar yerleştirin ve bir gecede 30 derecede büyümelerini bekleyin. Her dönüşüm türü için beş ila yedi farklı yamalar yapın.
Bir gecede büyümeden sonra, karbon kaynağı olarak raffinose içeren sentetik seçici ortamda steril kürdan veya pipet ucu kullanarak hücrelerin küçük bir miktar resuspend. Bu hücre süspansiyonları 0.4 civarında 600 nanometre de optik bir yoğunluğa sahip olmalı ve daha sonra farklı sıcaklıklarda kuluçka için birden fazla 96-iyi plakalar bölünebilir, tedaviler, ya da P53 ifadesini etkinleştirmek için galaktoz değişen miktarda hücreleri maruz bırakmak için. Ateş böceği nin etkinliğini ölçmek için, şeffaf 96 kuyulu plakadan 10 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonu beyaz 384 kuyulu bir plakaya aktarın ve hücreleri eşit hacimli lysis tamponuyla karıştırın ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
Ateş böceği luciferase substrat 10, 20 mikrolitre ekleyin. Ve ışık birimlerini çok etiketli plaka okuyucu kullanarak ölçün. Ayrıca 96-kuyu plaka kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün.
Protokol 4, şimdi P53 tarafından indüklenen maya büyüme inhibisyonu yararlanmak için nasıl bir örnek sıyoruz. Maya hücrelerini P53 ifade vektörleriyle dönüştürün veya P53'ü ve MDM2 gibi kofaktörlerinden birini, bölüm bir'de açıklanan lityum asetat bazlı protokolü takip etmek için ifade vektörleriyle dönüştürün. Transformant hücreleri seçici ortamda yaklaşık bir optik yoğunluğa büyütün.
Ve 0.05 onları seyreltmek ve uygun konsantrasyoniçin seçilen bir molekül ekleyin. Hücreleri 30 derecede bir çalkalayıcıyla 42 saat kuluçkaya yatırın. Sonra, en az seçici orta plakalar maya hücre kültürünün 100 mikrolitre tohum.
30 derecede iki gün kuluçkaya yat. ICORE kaset yerine doğru RE entegrasyonu koloni PCR tarafından kontrol edilebilir, aday maya klonlar hücrelerinin küçük bir miktar başlayarak ve hedeflenen locus yükseltmek için tablo üç açıklanan astar lar kullanarak. Yaklaşık 500 nükleotitten oluşan bir bant olan PCR ürünleri, doğru P53 yanıt elementi dizisinin varlığı için düzenlenmiş genomik konumun dizisini doğrulamak için Sanger dizilimi tarafından kontrol edilebilir.
Muhabir gerginliği fonksiyonel tahlillerde kullanılmaya hazır. P53 protein transaktivasyon yeteneğini değerlendirmek için maya kolonilerinin rengini kontrol edin. Örneğin, vahşi tip P53 ve mutantlar R175H ve R282W arasında iki farklı muhabir, P21-5-prime ve PUMA ve iki farklı sıcaklık, 30 derece ve 37 derece kullanarak bir karşılaştırma sıyoruz.
İlginçtir, R175H bir kaybı-fonksiyon P53 alel iken, her koşulda kırmızı koloniler, R282W 30 derece artık transaktivasyon aktivitesi ile sıcaklık hassasiyeti gösterir, beyaz koloniler sonuçlanan, ama 37 derece aktivite kaybı, kırmızı veya pembe koloniler ile sonuçlanan. Genişletilmiş veri seti şekil iki B.Wild-tipi P53 dört mutant aleller de 10 farklı P53 yanıt elemanı muhabir suşları, üç sıcaklık ve kurucu ifade düzeyleri kullanılarak transaktivasyon için test edilmiştir sunulmaktadır. Sonuçlar maya kolonisi renk fenotip hatırlatan bir renk kodu özetlenir.
P53 K139E mutant alel kısmi aktivitekorur ve soğuğa duyarlıdır. Örneğin, koloniler 24 ve 30 derece GADD45 muhabiri zorlanma kırmızı, ama 37 derece beyaz. Burada insan ve C.elegans P53 mayasının transaktivasyon özgüllüğünü karşılaştırarak bu yöntemle elde edilen sonuçlara bir örnek salıyoruz.
Çubuk grafiğindeki sonuçlar, standart hatası dört çoğaltma olan ortalama göreli ışık birimleri olarak ifade edilir. Beş farklı P53 yanıt öğesi karşılaştırıldı. P53 protein ekspresyonunun üç farklı düzeyi ortadaki galaktoz konsantrasyonu değiştirilerek test edildi.
İki P53 ortologları belirgin olarak farklı transaktivasyon özgüllüğü gösterir. Bu, 28 nükleotitli bir spacer'In varlığı veya yokluğu dışında, aynı sırayı paylaşan ced13 ve V1 yanıt elemanlarının sonuçlarıyla örneklenmiştir. C.elegans P53 tam tersini gösterirken İnsan P53 V1 bağlayıcı site ile çok daha yüksek transaktivasyon sergiler.
Sonuçlar galaktoz indükleyici altında P53 ifade düzeyinden bağımsızdır. 100 mikrolitre kültür damlaelde kolonilerin sayısını sayarak maya büyüme ölçün. Mutant P53 ifade hücrelerinin büyüme reaktivasyon sıfır düzeyde temsil ederken% 100 olarak belirlenen maksimal olası etkisi olarak maya ifade vahşi tip P53 büyüme göz önüne alındığında bileşiklerin mutant reaktivasyon etkisini hesaplayın.
Bu örnekte, Nutlin-3a, MDM2'nin birlikte ekspresyonunun neden olduğu yabani tip P53 inhibisyonunu azaltırken PhiKan083 kısmen Y220C P53 mutantını yeniden etkinleştirir. Her iki durumda da, bu maya büyüme p53 bağımlı azalma ile sonuçlanır. Maya bazal hücreleri değerleri araştırmak için yararlı kanıtlanmıştır, P53 protein fonksiyonlarının yönlerini.
Bu çalışmada açıklanan protokol, yabani tip veya kanserle ilişkili mutant P53'ün transaktivasyon potansiyelini hedef bölgelerin varyantlarına göre değerlendirmek için özellikle hassastır. Ayrıca, yaklaşım P53 fonksiyonlarını etkileyen küçük molekülleri belirlemek ve kofaktör ile P53 etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Renk muhabirlerinin kullanımı, luciferase minyatürleştirilmesi, hem de maliyet-etkin ve ölçeklenebilir tahliller kimyasal kütüphane tarama için uygun büyüme inhibisyonu testi sonucu.
Son olarak, bu çalışmada açıklanan sistem, diğer diziye özgü transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi ile kolayca benimsenebilir.
