Bu çalışmada Lundbeck Vakfı, NOVO-Nordisk Vakfı, Danimarka bağımsız araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir | Tıbbi Bilimler, ve NORDEA Vakfı Hibe sağlıklı yaşlanma merkezi.

Hayvanlar ile ilgili tüm prosedürler, Avrupa Konseyi 'nin deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan omurgadan hayvanların korunması sözleşmesi 'nde belirtilen yönergelere göre Danimarka Ulusal Etik Komitesi tarafından onaylandı ve GELMESI yönergelerine uygun idi. Bu farelerin anestezik iyileşmeden önce ötenize edilen bir Terminal prosedürü.
1. cerrahi öncesi hazırlık
<ol><li>% 70 etanol ile cerrahi masayı ve çevredeki tüm bölgeyi temizleyin. Ameliyattan önce cerrahi aletleri iyice temizleyin ve kurutun.</li>
	<li>Anestezize bir NG2DsRed fare (TG (Cspg4-DSRed. T1) 1akik/J; her iki cinsiyette; 4-8 ay) bir periton enjeksiyonu ile ketamin + xylazine (60 mg/kg + 10 mg/kg) sterilize suda çözünmüş, pH 7,4. Cerrahi prosedürün tamamlanması kadar her 25 dakika ketamin (30 mg/kg) ek dozlarda yönetin. Anestezi derinliğini doğrulamak için düzenli olarak Kuyruk ve ayak tutam refleksleri kontrol edin.</li>
	<li>Deneme sırasında dehidrasyon önlemek için 1 mL toplam hacmi için fare arkasındaki dört farklı yerlerde subkutan tuz enjekte. Gözleri kurutmadan korumak için göz yağlayıcıyı uygulayın. 37 °C ' de beden sıcaklığının Rektal sıcaklık sondası ve Isıtma battaniyesi kullanılarak sürdürülmesi.</li>
</ol>2. cerrahi prosedür
<ol><li>Trakeotomi
	<ol>
<li>Fareyi arkasına yerleştirin. Planlanan kesi altında subkutan altında 0,04 ml 0,5% lidokain enjekte ve 2 dakika bekleyin göğüs kemiği (manubrium) üzerinde 10 mm uzunluğunda kesi yapın. Submandibular bezleri ve sternotiroid kasları ayırın ve sonra trakea açığa.</li>
		<li>Makas ile iki trakeal yüzük arasında trakeostomi yapın. 16,2 mm uzunluğunda küçük bir metal tüp ve trakeaya 1 mm çap yerleştirin. End-expiratory CO2 (Şekil 1a) izlemek için tüp mekanik bir ventilatör ve capnograph bağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kateter ekleme
	<ol>
<li>Planlanan kesi altında% 0,5 lidokain (0,04 mL) subkutan enjekte ve 2 dakika bekleyin.</li>
		<li>İnce uçlu forseps kullanarak arter damardan hafifçe ayırın. Bir mikrovasküler kelepçe ile kan akışını upstream durdurun. İki kan damarına bağlanarak 10-0 naylon sütür ile kan akışını aşağı yukarı sıkışın.</li>
		<li>Hem arter hem de ven küçük bir kesi yapmak için mikro-Diseksiyon makas kullanın. Her iki kan damarına plastik kateter takın. Sütürler sıkılarak kateterleri koruyun (8-0 veya 10-0 naylon sütürler damar boyutuna bağlı olarak) kateter lümen ödün vermeden. Mikrovasküler kelepçeyi çıkarın ve cildi kapatın.</li>
		<li>Arter kateter yoluyla kan basıncını izleyin. Kan gazı analizörü kullanılarak, her denemede (normal değerler: pO2, 90-120 mmHg; PCO2, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45), arter kan örneklerinde (50 μL) kan gazlarının seviyesini ölçmek. Floresan ve anestezi infüzyon için ven kateteri kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kraniotomi
	<ol>
<li>Kulakların arasında fare kafasının dışında kürk tıraş. Planlanan kesi altında subkutan altında 0,5% lidokain 0,04 ml enjekte ve 2 dakika bekleyin.</li>
		<li>Periosteum kaldırmak için% 10 Demir klorür çözeltisi kullanarak kafatası silin. Kafatasını tuz ile iyice durulayın. Yapışkan bir metal baş çubuğu siyoakrilat tutkal ve aktivatör ile kafatasına (Şekil 1a). Not: metal baş çubuğu 75 mm uzunluğunda ve 13,5 mm genişliğindedir ve merkezde 5 mm 'lik yuvarlak delik vardır.</li>
		<li>0,5 mm arkasında ve sağ duyusal varil korteks üzerinde kemiğinin sağında 3 mm merkezli 4 mm çap kraniyotomi matkap. İnce uçlu damar dilatör ile dura çıkarın.</li>
		<li>% 0,75 agaroz jel ile maruz korteks kapak, yapay beyin omurilik sıvısı (acsf; pH = 7,4) çözünür ve 35 °c soğutulur. Kapak 80-90 bir cam lamel magazini ile kraniyotominin% 10-15 ° ' lik bir açı ile metal baş çubuğuna (Şekil 1B) cam mikro-pipet ekleme ve yerleştirme izin verir.</li>
		<li>Beyin titreşimi en aza indirmek için, cam lamel magazini iki köşesini siyanoakrilat tutkal ve aktivatör ile metal baş çubuğuna yapıştırın. Maruz beyin üzerine almak önlemek için dikkatle aktivatör uygulayın. Sonra yapıştırılmış cam lamel magazini iyice tuzlu ile durulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bıyık yastık stimülasyon prob ekleme gerçekleştirin. Kraniyotomi için Trigeminal sinir kontralateral ramus infraorbitalis uyarmak için yüz sol tarafına özel yapılmış Bipolar elektrotlar (8 mm uzunluk ve 0,25 mm kalınlık) bir dizi ekleyin. Katot yakın aradan infraorbitalis konumlandırın ve çiğneme kaslar içine anot yerleştirin7. 2 Hz 'de 20 s trenlerinde 1 MS için 1,5 mA yoğunluğunda bir elektrik Stimülatörü ile stimülasyon gerçekleştirin.</li>
	<li>Cerrahi tamamlandıktan sonra, 0,05 mL florürin isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, moleküler ağırlık [MW] 50.000) bir bolus yönetmek kan plazmasını etiketlemek için femoral ven içine. Ketamin kesilmeye devam edin ve anestezinin sürekli intravenöz infüzyon-chloralose (17% w/v, son konsantrasyon) ile karışık FITC-dextran (2% w/v, son konsantrasyon) at 0,02 mL/10 g/h. stabilize etmek için yaklaşık yarım saat bekleyin yeni anestezik devlet. Not: her Iki FITC-dextran ve α-chloralose% 0,9 tuz içinde çözülür.</li>
</ol>3. ilk iki foton görüntüleme oturumu
<ol><li>Fareyi ticari iki foton mikroskop (malzeme tablosu) aşamasına aktarın. Hem kırmızı floresan protein (RFP, Şekil 1c) ve yeşil floresan protein (Gfp, Şekil 1c) epi-floresan aydınlatma modları altında, bir 5x objektif ile maruz korteks bir resim çekmek. Sonraki oturumda cam mikro pipet eklemek için bir ' harita ' olarak RFP resmi kullanın. Not: GFP ' map ' damarlardan/venüller arter/arteriollerden ayırt etmek için kullanılır.</li>
	<li>İki foton mikroskop ve 25x 1,0 sayısal diyafram (NA) su daldırma amacı ile piezo motor kullanarak iki foton görüntüleme gerçekleştirin. 900 nm için uyarma dalga boyu ayarlayın. Korteks arama ve her penetran arteriyol takip ve yatay dalları bulmak (1St sipariş kapillaries).</li>
	<li>Görüntü penetran arterioller ve 1St sipariş kapillaries REST ve bıyık Pad stimülasyon sırasında. Bölüm 5 ' te ayrıntılı görüntüleme parametrelerine bakın.</li>
	<li>RFP ' map ' (Şekil 1C) üzerinde bıyık yastık stimülasyon sırasında >% 5 vazodilasyon ile 1St sipariş kılcal yerleri işaretle. < 5% vazodilatasyon ile konumlar bıyık varil korteks bölgenin dışında olarak kabul edilir. Not: denemede NG2DsRed fareler yerine vahşi tip fareler kullanıyorsanız, GFP görüntüsü yerine ' harita ' olarak kullanılır.</li>
</ol>4. cam mikro-pipet ekleme
<ol><li>Pipet çekici (malzeme tablosu) kullanılarak şişirme için cam Mikro-pipetleri hazırlayın. Cam mikro-pipetlerin 3-3,5 MΩ direnci ve 4.5-5 mm Konik uzunluğu vardır. epi-floresan lamba ve iki foton mikroskop altında Pipet ucunu görselleştirmek için 1 mM ATP ve 10 μM Alexa 594 karışımı olan bir pipet yükleyin.</li>
	<li>Cam mikro pipet 'i bir yama kelepçe tutucusuna monte edin ve bir hava pompasına bağlayın. Pompa tutma basıncını 0 psi olarak ayarlayın.</li>
	<li>Kırmızı epi-floresan aydınlatma kullanarak, 5x objektif ile Pipet ucunu odaklanın. Cam mikro pipeti agarose üzerindeki aCSF 'ye yerleştirin. Hava pompasının tutma basıncını 0,2 psi 'ye ayarlayın. Küçük kırmızı bir bulut, aCSF 'de Pipet ucunu dışarı çıkartılabilir. Bu pipet ekleme sırasında tıkanma önlemek için.</li>
	<li>Hedef olarak RFP ' map ' işaretli konumlardan birini seçin. Pipet ucunu, yaklaşık olarak x-y düzleminde hedefe doğru dönük olarak 30 μm mesafeye sahip kapak camı kenarının yatay düzlemine taşıyın.</li>
	<li>Kapak cam fişi altında z eksenindeki Pipet ucunu dikkatle indirin. Sonra Cam Pipet hedefe doğru ilerlemeye başlayın ~ kadar ~ 500 μm beyin yüzeyinin üzerinde. Kapak cam kenarı, pipet ucu ve beyin yüzeyi arasında sıklıkla odağı değiştirin, pipeti taşımak için yeterli boş alan olduğundan emin olun.</li>
	<li>Hedefi 25x 'e geçin. Pipet ucunu yeniden merkezleyin ve Pipet ucunu RFP ' haritasındaki hedefe doğru ilerletin. Pipet ucunu agaroz katmanında tutun.</li>
	<li>Pipet Ucu beyin yüzeyinin ~ 100 μm üzerinde olduğunda, görüntüleme modunu iki foton mikroskobu olarak değiştirin. Odak bir hedef konuma hangi puf. X, y koordinatlarını (x0, y0) ve derinliği yüzeyinin altında (z0) yazın. Beyin yüzeyinde ekleme noktasının koordinatlarını hesaplayın (xı, yı) aşağıdaki gibi: xı = x0 + z0 /tan θ yi = y0 Burada θ pipet tutucu ve yatay düzlem arasındaki açıdır.</li>
	<li>Pipet ucunu beyin yüzeyinin koordinatlarına (xı, yı) yerleştirin. Pipeti hafifçe ve yavaşça (x0, y0, z0) ulaşıncaya kadar takın. Bir gemi bir ekleme yolunun yolunda ise, pipet geri çekin ve diğer ekleme koordinatları ve yol yeniden hesaplayın; veya Sahne plakasını hafifçe çevirin ( Şekil 1A'da belirtildiği gibi).</li>
	<li>10-15 psi 'de 0 psi ve ejeksiyon basıncında pompa tutma basıncını ayarlayın. Puff ATP için 200-400 MS hedef konumda iki foton görüntüleme sırasında. Tartışma bölümünde açıklandığı gibi, her pipet için ve zamanla şişirme basıncını ve süresini ayarlayın.</li>
</ol>5. hyperstack iki foton görüntüleme
<ol><li>İki foton mikroskobu ve piezo motor ile 25 x 1,0 NA su daldırma hedefi kullanarak deneyler gerçekleştirin. 900 nm için uyarma dalga boyu ayarlayın. DsRed (perikaytlardan)/tetramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) FITC-dextran (kan plazma)/gcamp6 (GFP, astrositik kalsiyum) gelen yeşil ışık kan plazma boyama ve kırmızı ışık toplamak için yayılan ışık filtre.</li>
	<li>Penetran arteriole, 1St sipariş kılcal, 2ND sipariş kılcal ve muhtemelen komşu floresan hücreler (örneğin, perikayt, astrosit) içeren ilgi yerinde yüksek çözünürlüklü z-yığını üretin. Mümkün olduğunca kan damarlarının 3D yapısını dahil ederek hyperstack görüntüleme x * y * z hacmi belirleyin. Her yığını toplam yüksekliği 30-50 μm değişebilir, x-y düzlem kabaca 60 μm x 40 μm bir alanı kapsar iken.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımındaki görüntü yığınını, 4-5 μm düzlemsel mesafeye sahip 8-10 düzlemlerden oluşmak üzere ayarlayın. Piezo-motor amacı her düzlemin görüntüsünü elde etmek için z eksenindeki her seviyede durur. Örnekleme hızı Stack başına 1 s ve x-y düzleminde piksel çözünürlüğü 0.2-0.3 μm ' dir (Şekil 2A). Bir kayıt normalde 10 pre-Puff görüntü yığınları ve 150 sonrası puf görüntü yığınları içerir.</li>
</ol>6. veri işleme
<ol><li>Özel yapılan analitik yazılımı kullanarak verileri işleme. Her görüntü yığınını maksimal yoğunluk projeksiyonuna göre tek bir görüntüye Düzleştir (Şekil 2B). Faiz (Şekil 2C) gemi boyunca dik 3 μm genişliğinde bir ılgı dikdörtgen bölge (YG) çizin.</li>
	<li>Kırmızı kan hücrelerinin gölgeler ve korteks küçük titreşimlerden parazitleri en aza indirmek için, o zaman gemi segmentinin ortalama profilini temsil eden tek bir satıra yansıtarak dikdörtgen YG ortalama. Her maksimal yoğunluk görüntüsü için bunu yapın.</li>
	<li>Profil satırlarını, kronolojik düzende maksimal yoğunluk görüntülerini temsil eden x ekseni ile 2B görüntü olarak çizin (Şekil 2D, üst panel). Gemi8,9 (kırmızı eğrileri ile gösterilir) kenarlarını bulmak için etkin bir kontur algoritması (Chan-vese segmentasyon) kullanın; Şekil 2 D, üst panel).</li>
	<li>Kan damarının kenarları arasındaki fark olarak çap değişikliklerinin zaman seyrini hesaplayın ( Şekil 2D'de üst ve alt kırmızı eğrileri arasındaki dikey mesafe, alt panel). Çap değişimlerinin ön şişme çapı temel ve zaman içinde çap değişimi Arsa eğrileri normalleştirmek. Her YG için bunu yapın (Şekil 2E).</li>
	<li>Damar tepkisi genliği, şişirme işleminden sonra en yüksek/en düşük tepe genliği olarak tanımlanır. Yanıt gecikmesi, yarım maksimum genlik gecikme süresi olarak tanımlanır (Şekil 2G). Tanklar (Şekil 2F) boyunca DÜĞÜMLERI koyarak ve her YG ve penetran arteriole arasındaki coğrafi mesafeyi ölçmek ile iskeletize damar yapısını el ile izleyin. Gecikme farklılıkları ile mesafeleri bölerek CVR hızını hesaplayın.</li>
</ol>7. Viral vektör enjeksiyon
<ol><li>Aynı anda astrositik kalsiyum yanıtlarını incelemek için, standart stereotaktik Viral vektör enjeksiyon prosedürü takiben, NG2DsRed fareler somatoduyusal korteks içine 0,6 μL Viral vektör (pZac 2.1 gfaABC1D-LCK-GCaMP6f, Addgene) bir hacim enjekte 10' a kadar.</li>
	<li>Üç hafta sonra, fare somatoduyusal korteks astrositler genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi ifade, GCaMP6f. Yukarıda belirtilen cerrahi prosedür ve fareler için iki foton görüntüleme izleyin. Astrositler ve damar Lumina ayırt etmek için, TRITC-dextran yerine FITC-dextran damar Lumina kırmızı leke için kullanılır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease.">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses.">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks.">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo.">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo.">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex.">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li><li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation.">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li><li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images.">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain.">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain.">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).</li><li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2++Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo.">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li><li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons.">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726 (2018).</li><li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+(Scape)+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms.">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Damar çalışmaları için bir zorluk damar çapları kesin ölçümdür. Burada tarif ettiğimiz Yöntem, iki foton mikroskobu ile hızlı ve tekrarlayan hiperyığın görüntüleme yapmak için motorlu bir piezo amaç kullandı. İlk olarak, bu yöntem penetran arteriol, 1St sipariş ve 2ND sipariş kılcal odak kaybı olmadan tekrarlı sınavlar sağlar ve yavaşça kapillaries in vivo içinde vasküler tepkiler yürütülen keşif yol açtı. İkincisi, bir viral vektör enjeksiyon tekniği il...

Beynin yüksek enerji tüketimi oranı vardır. Yaklaşık 20% oksijen ve 25% insan vücudu tarafından tüketilen glikoz beyin işlevine adamıştır, beyin sadece kaplar ise toplam vücut kütlesi% 2. Normal beyin fonksiyonunun bakımı, karmaşık bir damar ağında kan akışı ile yeterli ve verimli oksijen ve beslenme kaynağı gerektirir. Yerel beyin aktivitesi ve serebral kan akımı (CBF) nöronlar, astrositler, perikayt, pürüzsüz Kas hücreleri (smcs) ve endotel hücreler (ECS)1fonksiyonel özelliklerine bağlı olarak, sağlam birleştiğinde. Son zamanlarda, penetran arterioller dallanma kapiller ilk birkaç sipariş bir ' hotspot '2olarak ortaya çıktı, kılcal kan akışının aktif düzenleme gösteren. Yavaş yürütülen damar tepkisi (CVR) bu ' hotspot ', fare somatoduyusal korteks hem bıyık stimülasyon ve yerel ejeksiyon (PU,) ATP bir cam mikro-pipet3sırasında keşfedilen.
İki foton lazer tarama floresan mikroskopisi tarafından In vivo görüntüleme yaygın serebral korteks nörovasküler tepkiler okuyan için kullanılan olmasına rağmen, çalışmaların çoğu kan damar çapları ölçülen ve bir içinde düzenlemeleri incelenmiştir iki boyutlu (2D) x-y düzlem. Zorluklar şunlardır: Öncelikle, serebral kan damarlarında ve onların kucaklayan astrositler, perikayt ve SMCs üç boyutlu (3D) dalları inşa. Bu nedenle 3D etkileşimlerini incelemek çok önemlidir. İkincisi, odak kayması bile küçük bir miktar hem gemi çapları ve hücresel floresan sinyalleri kesin ölçümü etkiler. Son olarak, CVR 'Ler üç boyutta hızlı ve uzak bir şekilde ulaşmaktadır. 3B ses taraması, CVR 'Ler tespit etmek ve mekanizmalarını açıklama için idealdir. Fare somatoduyusal korteks in vivo çalışması için iki foton mikroskop içinde bir piezo motor amacı uyguladık, elde edilen görüntülerin maksimal yoğunluk projeksiyonlarına göre hassas çap ölçümleri sağlar.
Cam mikro-pipetler sık olarak in vivo beyin çalışmaları için kullanılan, örneğin, toplu yük organik boyalar4, kayıt EEGs5 ve yama sıkma6. Yine de, sınırlamalar kalır. Yaygın olarak, cam mikro-pipet ucu hassas bir şekilde yerleştirilir, ya da mikro-pipet yerel girişimler için kullanılmaz. Burada, mikro-pipet ekleme ve yerel fırlatma prosedürünü optimize ettik.
Ayrıca, 3D iki foton mikroskobu ve genetik olarak kodlanmış floresan göstergeleri kombinasyonu bir 3D kapsamda nörovasküler kavrama araştırmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bu çalışmada, bu ve enjekte viral vektörler astrosit spesifik genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri fare somatoduyusal korteks içine taşıyan yararlandı. Astrositler yanı sıra damar çapları farklı floresan işaretçileri birleştirerek aynı anda görüntülenmiş.
Genel olarak, cam mikro-pipet ve hızlı iki foton hyperstack görüntüleme ile yerel ejeksiyon (şişirme) için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz, bu da kılcal çap değişikliklerinin kesin ölçümünü sağlar. Buna ek olarak, bizim yöntemi aynı anda astrositler ve vasküler çap Tepkiler CA2 + tepkiler 3D profilleri incelemek için yeni bir araç sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

Normal beyin fonksiyonunun bakımı, karmaşık bir damar ağı ile yeterli ve verimli oksijen ve beslenme kaynağı gerektirir. Ancak, serebral kan akışının düzenlenmesi (CBF), özellikle kapiller düzeyinde tamamen anlaşılır. İki foton mikroskopisi, CBF ve yönetmeliğinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan güçlü bir araçtır. Şu anda bu alan, üç boyuttaki (2) CBF yanıtlarının incelenmesi (1) in vivo iki foton mikroskopi çalışmaları eksikliği ile sınırlıdır ve (3) vasküler ağ içinde lokalize müdahalelerdir. Burada, bir cam mikro-pipet ile ATP yerel ejeksiyon tarafından yapılmıştır vasküler tepkiler yürütülen incelemek için iki foton mikroskopisi kullanarak bir 3D in vivo yöntemi tarif. Yöntemimiz, elde edilen görüntülerin maksimal yoğunluk projeksiyonu ile hassas çap ölçümleri sağlayan hızlı ve tekrarlayan hiperyığın iki foton görüntüleme kullanır. Ayrıca, bu yöntem de 3D astrositik kalsiyum tepkiler okumak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca cam mikro-pipet ekleme ve iki foton hyperstack görüntüleme avantajları ve sınırlamaları tartışıyoruz.

Ameliyat tamamlandıktan sonra fareler iki foton mikroskobu (Şekil 1A) nakledildi. Hedef yerde (Şekil 1B) hedef kan damarının YAKıNLıĞı ile 1 mm ATP içeren cam bir mikro pipet yerleştirildi.
1 mM ATP (Şekil 2a, tamamlayıcı video 1) bir puf verirken hiperyığın görüntüleme gerçekleştirdik. Her görüntü yığını maks...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette at JoVE.com

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Cam mikro-pipet ve hızlı iki foton hyperstack görüntüleme yöntemi kullanarak optimize edilmiş bir yerel fırlatma prosedürü sunacağız, bu da kapiller çapı değişikliklerinin hassas ölçümünü ve yönetmeliğinin üç boyutta araştırmasını sağlar.

In vivo üç boyutlu Iki-foton mikroskobu çalışma bir cam mikro-pipet kullanarak yerel ATP ejeksiyon tarafından vasküler tepkiler yürütülen eğitim

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Bu protokol, ATP'nin lokal ejeksiyonu ile ortaya çıkarılan serebral kılcal damarlarda yavaş yapılan vasküler yanıtları incelemek için tasarlanmıştır. Bu tekniğin avantajı lokal pipet ejeksiyonu ile lokal sinaptik aktiviteleri simüle etmek ve 3D iki foton mikroskopisi ile az bulunan damarı odakta tutmaktır. Bu yöntem aynı zamanda serebral nörom ve glial aktiviteyi istirahatte ve üç boyutlu stimülasyon üzerine incelemek için de kullanılabilir. Prosedürü gösteren Michael L olacak

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K Görüntüleme.  University of Copenhagen. Bu protokol, ATP'nin lokal ejeksiyonu ile ortaya çıkarılan serebral kılcal damarlarda yavaş yapılan vasküler yanıtları incelemek için tasarlanmıştır. Bu tekniğin avantajı lokal pipet ejeksiyonu ile lokal sinaptik aktiviteleri simüle etmek ve 3D iki foton mikroskopisi ile az bulunan damarı odakta tutmaktır. Bu yöntem aynı zamanda serebral nörom ve glial aktiviteyi istirahatte ve üç boyutlu stimülasyon üzerine incelemek için de kullanılabilir. Prosedürü gösteren Mi...

Video: In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Two-photon Imaging of Microglial Processes&#039; Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...