Yazarların laboratuar araştırmalar, Ulusal Sağlık hibe R37-HL041026, R01-HL086483 ve R01-HL056786 (SSS) ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi F32-HL097463 ve T32-AR048523 (PB) Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. Hayvan Bakımı ve Kullanımı Inceleme ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayını takiben, en az 12 hafta eski erkek fareler kullanılır. Bir fare pentobarbital intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile sodyum (60 mg / kg) ile anestezi. Cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi gibi gerekli takviyeleri (% 10-20, ilk enjeksiyon ip) (parmak veya kuyruk tutam çekilme yanıt belirtilen her 30-60 dakika) tarafından korunur. Deneysel işlemin tamamlanmasından sonra fare pentobarbital (ip) ve servikal dislokasyon tarafından ötenazi ile aşırı doz. 2. Mikropipetler ve Microiontophoresis <ol><li> Microiontophoresis mikropipetler (iç ucu çapı, yaklaşık 1 mikron) borosilikat camdan kılcal tüpler yatay bir pipet çektirmenin kullanarak hazırlanmıştır. Bizimki bir sertlik ~ 5 mm konik; uzun tapers daha esnektir. </li><li> Mikropipetler M 18.2 suda çözünmüş 1M ACh (Figure1A-C) ile yeniden toprakla. Asfaltlanması için, microcapillary tüp ilgi agonist (Şekil 1) içeren bir şırınga birleştiğinde 0.2 mikron filtre bağlıdır. Bunlar hazır fabrikasyon (aşağıda) ya da ticari firmaların satın olabilir. Microcapillary tüp microcapillary tüp geri çekilirken mikropipet doldurur gibi mikropipet ve ACh çözüm lümenine teslim arka sonuna eklenir. Ucu aşağı dönük mikropipet Holding, hava kabarcıkları, yavaşça mikropipet Flicking kaldırılır. </li><li> Mikropipet mikromanipülatör (Şekil 2) monte tutucu güvence altına alınmıştır. Tutucu bir microiontophoresis programcı da pozitif terminaline bağlı harici bir pin, mikropipet içinde ACh çözüm bağlayan bir gümüş tel vardır. Doku hazırlanması kenarında güvenli ikinci bir gümüş tel mikropipet ucu hazırlığı içinde serum fizyolojik solüsyon içine gelişmiş olarak devreyi tamamlamak için negatif terminaline bağlı. </li><li> Mikropipet ucu arterioler duvara bitişik konumlandırılmış (ya da floresan yanıt) vazodilatasyon önlemek için istinat akımı uygulanır. Mevcut İstinat mikropipet ucu (iç çapı = 1 mm) ve agonist konsantrasyonu boyutuna göre değişir, ancak yüksek tanımlı parametreler (1M ACh, 1 mikron ucu için ~ 200 nA) tekrarlanabilir. Istinat akımı görüntü elde başlangıcı ile senkronize elektronik tetik (Ek Şekil 1) ile mevcut ejeksiyon teslim tesadüf olmaktan çıkar. </li></ol> 3. Mikromanipülasyon <ol><li> XY mikroskop sahne için özel bir platform ferromanyetik paslanmaz çelik üretildi. Platform ölçüleri (1 / 8 &quot;X 12&quot; X 13 &quot;) manyetik üsleri (Şekil 2B) hazırlık tarafından dikte konumlandırma etkinleştirmek için güvenli istenilen (Şekil 2A). Mikromanipülatörler deneysel olarak hazırlık etrafında pozisyon mikromanipülatörler için yeterli alan sağlar. Bunlar; ilgi (Şekil 2C) siteleri konumlandırma mikropipetler için hazırlık etrafında fabrikasyon platform üzerine yerleştirilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Mikropipet ucu bir arteriyol bitişik konumlandırılmış ile ACh için floresan yanıt (ACh kaçağını önlemek için ayarlanabilir daha mevcut istinat) vardır. Bir eşik uyaran altında hiçbir etkisi vardı. Ancak, uyaran şiddeti arttıkça, endotelyal hücre kalsiyum floresan, arteriyol boyunca giderek daha büyük mesafeler üzerinde arttıkça stimülasyon site (Şekil 3) floresan yoğunluğu yoktu. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Microiontophoresis Pipetler Dolgu Yöntemi. A) microcapillary tüp (yeşil ok) B) microcapillary tüp içine beslenir, daha sonra 1M ACh ile dolu bir şırınga bağlı filtre 0.2 mikron (mor ok) bağlı bir sıkıştırma uydurma (mavi ok ) sabitlenir arka uç ve çözüm yoluyla microiontophoresis pipet pipet doldurulduktan sonra, aşağı ucu tutun). C mikropipet lümen doldurmak için yerinden hafifçe konik üzerinde kabarcıklar (siyah ok) kaldırmak için fiske. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Mikromanipülatör Yerleştirme için özel Platformu. Deneysel hazırlık etrafında yerleştirilmiş A) ferromanyetik paslanmaz çelik platform XY translasyonel sahne içeren bir özel MVX10 mikroskop taban üzerine yerleştirilmiştir B) Dairesel manyetik üsleri kompakt 3-eksenli mikromanipülatörler altına yapıştırılmış C) mikromanipülatörler (Bkz. ilişkili protokol: vallahi ID # 2874) ilgi belirli siteleri çalışma.ir kompakt boyutu ve çok yönlülük, aynı anda birden fazla mikropipetler kullanılacak sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Arteriollerde Kalsiyum Floresan arterioler duvarını kaplayan endotel hücreleri kalsiyum floresan uyaran yoğunluğu arttı. Ilk 3 panelleri görüntüleri) A) 250 nA, B floresan yanıtları 500 nA ve C) 1000 nA ejeksiyon (500 ms darbe süresi). Endotel hücre kalsiyum floresan üzerinde artan mesafe, AC (sırasıyla ~ 130, 270 ve 400 mm,) parantez ile gösterilir. Her bir panel arteriyol boyunca referans çizgisi için floresan tepkiler ACh (F / Fo) stimülasyon site kaydedildi gösterir. D) F / Fo vs zaman artan ACh uyaranlara için Kayıtlar. Mevcut ejeksiyon arttıkça, F / Fo genlik ve süresi arttı. 100 nA uyaran eşik değerinin altında olduğunu ve hiçbir etkisi olmadığını unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Ek Şekil 1" /> Ek Şekil 1. Elektronik tetik için devre şeması Bu devre bir kişisel bilgisayara bir paralel port arabirim. 5V sabit bir TTL darbe sağlar aktive. 7805 çip 9-12V DC güç kaynağı (pil uygun gerilim ince) bağlı bir 5V voltaj regülatörü. 7805, çıkış Dört İkili Switch ve devrenin çıkış gücü sağlar. 1K direnç karşısında Giriş bilgisayardan.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Missouri Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvanları da içeren tüm prosedürleri ve protokolleri için National Institutes Sağlık Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde yapılan edildi. Üretimi Bu makalede, Stanford Fotonik sponsor oldu .

Burada açıklanan protokol microiontophoresis için mikropipetler hazırlanması ve uygulanması için yöntemler göstermektedir. Asetilkolin Teslimat anestezi fare arteriollerde kalsiyum sinyalizasyon altta yatan endotel bağımlı vazodilatasyon göstermek için kullanılır. Çalışmamızın sonuçları göstermektedir ki ACh microiontophoresis mikropipet (Şekil 3) güncel ejeksiyon yoğunluğu ile endotel hücre kalsiyum floresan artar artar üzerinde mesafe. Dinlenme koşullar altında floresan artış eksikliği mikropipet ACh önemsiz kaçak gösterir. 100 nA uyaran yoğunluğu (Şekil 3, efsane) yanıt eksikliği stimülasyon bir eşik yoğunluğunu artırmak için endotel hücre kalsiyum için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu teknikleri diğer vazoaktif ajanlar ve doku hazırlıkları kolayca adapte edilebilir. Pratik Düşünceler: microiontophoresis arterioler reaktivite çalışma ile çalışan, bazı şeyleri kabul edilmelidir. Teslim agonist gerçek konsantrasyonunu belirlemek zor olsa da, uyaran-yanıt eğrileri hazırlıkları içinde ve arasında tekrarlanabilir. Bu darbe süresi sabit tutarak (örneğin, 500 ms) ve ejeksiyon akımı (Şekil 3 örneğin, 250, 500 ve 1000 nA) değişen yapılabilir. Alternatif olarak, mevcut ejeksiyon sabit tutulur olabilir (örneğin, 500 nA) ve darbe süresi değişken (örneğin, 250, 500 ve 1000 ms). Tanımlanmış bir agonist konsantrasyonu eylemleri için bir başvuru için, hazırlama, uygun bir çözüm 5 ile superfused olabilir . Çözünen ejeksiyon için itici güç elektrik yükü hareketi olduğundan, teslim edilecek ajan mikropipet yerinden net ücret taşımalıdır. Ilgi ajan birincil sorumlu taşıyıcısı olduğundan emin olmak için, elektro-osmoz en aza indirmek için yüksek konsantrasyon (örneğin, ACh için 1 M) çözülür. Mikropipet dolum çözüm pH manipüle gerektirdiğinde, araç kontrolleri, herhangi bir non-spesifik etkilerini tespit etmek için gereklidir. Uygun kontrolleri de yalnız akım geçişi için yapılmalıdır (örneğin, izotonik tuzlu su ile dolu mikropipetler kullanarak). Sürümü kendi sitesinden ajan yayılması için etkili mesafe tespit olmalı ve en kolay mikropipet konumlandırılmış fizyolojik bir tepki ortadan kalkması (örneğin, vazodilatasyon veya hücre içi kalsiyum ACh ejeksiyon üzerine bir artış) tarafından deneysel olarak belirlenir. hedef site mesafeler tanımlanmıştır. Pratikte, etkin difüzyon mesafesi önemli ölçüde mikropipet ucu doku yerleştirilmiş nasıl etkilenir; doku ve ucu içine basılı ucu tıkalı ise, örneğin, ejeksiyon engelli daha. Aşırı bağ dokusu oldukça zahmetli ve cerrahi hazırlanması sırasında doku yüzeyinin uzaklaştırılması gerekir. Dikkat ajan ucu tüketen olasılığı da verilmelidir. Bu nispeten kısa bakliyat (örneğin, ≤ 1 ler) kullanılarak en aza indirilmiştir. Sürekli akımlar (örneğin, birkaç saniye) ile agonist mikropipet dökme dolum çözüm difüzyon ile değiştirilmesi daha ucundan daha hızlı bir şekilde sınır dışı olabilir. Biri (örneğin, + uyaran bir depolarizan K sağlamak için) yerel iyonik ortam değiştirmek için çalışıyoruz. Halinde önemsiz hacmi, microiontophoresis ile yerinden. Çünkü, bu etkili bir şekilde microiontophoresis ile başarılı değil. Fakat kolayca istenilen dökme sıvı basıncı ejeksiyon ile sağlanır. bileşimi. Bir arteriyol yerel uyarılması için, iç çapları 2-3 mikron ile mikropipet ipuçları ejeksiyon basıncını 4-5 psi (28-35 kPa) ve bir solenoid valf 10 ile kontrol darbe süresi (örneğin, 1 saniye) ile iyi çalışır. Bir mikrodamar üzerine bir mikropipet bir ajan sürekli teslim gerekli olduğu durumlarda, basınç ejeksiyon uygun iç uç çapı (örneğin, ~ 10 mikron) 11,12 mikropipetler kullanılması tercih edilir. Açık / kapalı sabit basınç kafası iyi tanımlanmış bir stopcock vana ile bilinen bir yüksekliğe bir hidrostatik sütun, ucuz bir sağlar. Akış hızları, pipet ve sürüş basınç iç çapı ile belirlenir. Her zaman olduğu gibi, araç kontrolleri basınç ejeksiyon nonspesifik eylemler dışlamak için gereklidir.

<table><tbody><tr><td> Kullanılan Malzeme </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Borosilikat Kapiler Tüp </td><td> Warner Aletleri </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Yatay Pipet Çektirme </td><td> Sutter Aletleri </td><td> model P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Asetilkolin klorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> Luer hub için adaptör </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Microcapillary boru sabitlemek için </td></tr><tr><td> 0.2 mikron naylon Titan filtre </td><td> Sun Sri </td><td> 42.204-NN </td><td> Kaybını en aza indirmek için düşük tutma hacmi </td></tr><tr><td> 5 ml şırınga </td><td> Becton-Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet Tutucu </td><td> Warner Aletleri </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Gümüş Tel </td><td> Warner Aletleri </td><td> AG10W </td><td> 0.25mm çaplı </td></tr><tr><td> 3-eksen mikromanipülatör </td><td> Siskiyou Tasarım Araçlar </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Manipülatör için Bileşenleri gösterildiği gibi </td></tr><tr><td> microiontophoresis mevcut programcı </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> Model 260 </td><td></td></tr><tr><td> tetikleme cihazı </td><td> Özel </td><td> özel </td><td> devre Sayı sağlanmaktadır. Şekil 1 </td></tr><tr><td> paslanmaz çelik levha </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> Tasarımına göre </td></tr><tr><td> Yoğunlaştırılmış Dijital Kamera </td><td> Stanford Fotonik A.Ş. </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Piper Control yazılımı ile Entegre </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis deneysel bir hazırlık içinde belirli bir yerinde bir çözünen teslim mikropipet ucu üzerinden akım geçişi gerektirir. Microiontophoresis tekrarlanabilir nöronlar 2 üzerine nörotransmitter ve nöropeptitlerin sunarak sinaptik iletim 1 taklit edebilirsiniz. İhmal edilebilir hacmi (sıvı) deplasman deneysel hazırlanması mekanik bozukluğu ortadan kaldırır. 3 mikrosirkülasyon bu tekniklerin uyarlanması vazodilatasyon ve vazokonstrüksiyon mekanizmaları in vivo 4,5 mikroskobik düzeyde incelenmesi gereken sağladı. Gibi lokalize teslim sistemik kan basıncı ve doku kan akımı ya da dönüşlü değişiklikler, böylece mikrodamarlar içsel özelliklerini ifşa çağrıştıran olmadan mikrovasküler bir ağ içinde tanımlanmış siteler okudu vazomotor yanıtları önemli bir avantaj sağlıyor. Microiontophoresis bir sınırlaması ilgi site teslim ajan konsantrasyonu tam olarak tespit 6 zor olmasıdır. Bununla birlikte, mikropipet ucu serbest ejeksiyon akım şiddeti ve süresi 2,7 orantılıdır gibi tekrarlanabilir uyaran-tepki ilişkileri kolayca tanımlanan deneysel koşullar altında (aşağıda açıklanmıştır) tespit edilebilir. Microiontophoretic teslim etkileyen Ek faktörler çözünen konsantrasyon ve çözelti içinde iyonizasyon içerir. Mikropipet ucunun iç çapı istinat akımı ile dengelendi olabilir difüzyonal &#39;kaçak&#39;, en aza indirmek için ~ 1 mm veya daha az olmalıdır. Böylece dışa akım (pozitif) bir katyon ve mikropipet içinde tutmak için kullanılan bir negatif akım çıkarmak için kullanılır. Mikropipetler Fabrikasyon sofistike elektronik Elcikler 8 ile kolaylaştırılır. Mikropipetler bir filament içeren cam kapiller tüplerin çekti mikropipet ucu içine &#39;fitilleri&#39; çözüm arka uç (&quot;yeniden toprakla&quot;) dolu. Bu ilgi ve çözüm çıkartma çözüm mikropipet lümenine içeren bir şırıngaya bağlı bir microcapillary tüp ekleyerek yapılır. Mikromanipülatörler deneysel bir hazırlık içinde mikropipetler istenen yerleştirme sağlar. Hareketli bir taban üzerine monte mikromanipülatörler mikrovasküler ağları (aşağıda geliştirilen) topografya göre hazırlık etrafında yerleştirilmiş olabilir. - İşbu protokol microiontophoresis asetilkolin (ACh + Cl): fare Cremaster&#39;ın kas hazırlık endotel bağımlı vazodilatasyon üretmek için bir arteriyol (Jüpiter ID # 2874 ilişkili protokol) üzerine göstermektedir. Stimulus teslimat elektronik bir tetikleyici ile dijital görüntü elde etme ile senkronize edilir. Cx40 BAC-GCaMP2 transgenik farelerin 9 kullanımı yaşayan mikrosirkülasyon arterioler endotel hücreleri vazodilatasyon altında yatan hücre içi kalsiyum yanıtları görselleştirme sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation at JoVE.com

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis mikropipet içi ve dışı arasındaki elektriksel potansiyel bir fark yanıt mikropipet iyonların hareketi gerektirir. Biyolojik aktif molekülleri böylece elektrik akımı ile orantılı olarak teslim edilir. Biz mikrosirkülasyon endotel bağımlı vazodilatasyon çalışma mikromanipülasyon ile birlikte asetilkolin microiontophoresis göstermektedir.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Görüntüleme.  University of Missouri. Microiontophoresis mikropipet içi ve dışı arasındaki elektriksel potansiyel bir fark yanıt mikropipet iyonların hareketi gerektirir. Biyolojik aktif molekülleri böylece elektrik akımı ile orantılı olarak teslim edilir. Biz mikrosirkülasyon endotel bağımlı vazodilatasyon çalışma mikromanipülasyon ile birlikte asetilkolin microiontophoresis göstermektedir.

Video: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Biyoloji

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...